細胞凋亡及其調控演示文稿

細胞凋亡及其調控演示文稿當前第1頁\共有148頁\編于星期四\21點細胞凋亡的特征及意義細胞凋亡的發(fā)生機制檢測凋亡的常用方法和技術細胞凋亡的調控細胞凋亡與疾病Biochemistry&MolecularBiology

Cell當前第2頁\共有148頁\編于星期四\21點細胞凋亡（aopotosis，aGreekwordthatmeans

“droppingoff”or“fallingoff”)是機體細胞在正常生理或病理狀態(tài)下發(fā)生的一種自發(fā)的、程序化的死亡過程，其發(fā)生受到機體的嚴密調控細胞凋亡對多細胞生物的生長發(fā)育和正常生命活動至關重要，與許多疾病的發(fā)生也相關

當前第3頁\共有148頁\編于星期四\21點2002年10月7日英國人悉尼·布雷諾爾、美國人羅伯特·霍維茨和英國人約翰·蘇爾斯頓，因在器官發(fā)育的遺傳調控和細胞程序性死亡方面的研究獲諾貝爾諾貝爾生理與醫(yī)學獎。2002年諾貝爾生理與醫(yī)學獎獲得者（圖片來自）當前第4頁\共有148頁\編于星期四\21點§4.1細胞凋亡的特征及意義一、細胞凋亡的基本特征1、形態(tài)學特點單個凋亡細胞與周圍細胞分離以胞漿空泡開始，與細胞膜融合，導致膜發(fā)泡。隨后空泡自細胞內排出，引起水分喪失、細胞容積減少、細胞固縮染色質濃縮或重新分布于核膜下呈圓形或半月形最后細胞器也超濃縮，細胞核解體，細胞膜下陷，包裹著核碎片和細胞器形成凋亡小體凋亡小體最終被周圍細胞吞噬當前第5頁\共有148頁\編于星期四\21點Cellstructurechangesduringapoptosis.Thetoppanelshowsanormalcell.Thelowerpanelshowsanapoptosingcell;arrowsindicatecondensednuclearfragments.當前第6頁\共有148頁\編于星期四\21點檢測凋亡的常用形態(tài)學方法在實際研究中，為了對細胞凋亡進行嚴格、合理的評價，往往采用多種方法，聯合應用。細胞形態(tài)學的評價(1)普通光鏡、熒光顯微鏡觀察分別對細胞核、質染色，計算凋亡細胞數目缺點：常受主觀因素干擾，重復性較差ab當前第7頁\共有148頁\編于星期四\21點(2)電子顯微鏡觀察

凋亡細胞膜表面變化，如膜發(fā)泡和某些結構的丟失，染色質固縮和線粒體超濃縮necrosisapoptosis當前第8頁\共有148頁\編于星期四\21點凋亡細胞的生物化學特點（1）非隨機性DNA降解：細胞凋亡過程中，核酸內切酶活化，基因組DNA被降解產生寡核小體片段，大小相當于核小體（180~200bp）的倍數（2）細胞膜磷脂酰絲氨酸外翻：正常細胞的膜磷脂分布不對稱，氨基類磷脂如磷脂酰絲氨酸和磷脂酰乙醇胺多分布在膜內側。（3）正常的能量代謝（4）胞漿蛋白交聯：凋亡細胞的mRNA和蛋白合成減少，誘導組織谷氨酰胺酶表達，在胞膜下形成殼狀結構，使凋亡小體穩(wěn)定當前第9頁\共有148頁\編于星期四\21點3、凋亡細胞的結局在細胞凋亡末期，破碎的核片段由一層包被，形成凋亡小體，被鄰近細胞，主要是巨噬細胞清除，不會導致周圍組織損傷和炎癥反應。壞死（necrosis）因溶酶體水解酶的釋放而導致鄰近組織的損傷和炎癥反應當前第10頁\共有148頁\編于星期四\21點NECROSISAPOPTOSIS當前第11頁\共有148頁\編于星期四\21點當前第12頁\共有148頁\編于星期四\21點二、細胞凋亡的生物學意義1、個體的生長發(fā)育(1)胚胎發(fā)育中特定種類細胞在完成其使命后通過凋亡而淘汰，代之以新的細胞類型指、趾、關節(jié)腔的形成，人、蝌蚪尾巴的消失(2)成年個體中，通過細胞凋亡清除衰老細胞并代之以新生的細胞，從而維持特定組織器官的細胞類型和數量的穩(wěn)定皮膚和粘膜等細胞的更新（1.維持細胞總數和機體生活力2.調節(jié)細胞數量和質量3.參與形態(tài)建成）當前第13頁\共有148頁\編于星期四\21點細胞凋亡在鴨和雞的腳的形態(tài)發(fā)生中的作用

當前第14頁\共有148頁\編于星期四\21點細胞凋亡在非洲爪蟾發(fā)育過程中尾巴消失中的作用溶酶體中

cathe-pasin酶的濃度當前第15頁\共有148頁\編于星期四\21點2、淋巴細胞的成熟和維持免疫系統的功能在淋巴細胞的發(fā)育分化中，自身反應性B細胞克隆的清除一些免疫活性細胞可以通過誘導凋亡來殺傷靶細胞防止過高的免疫應答（受抗原刺激活化的T淋巴細胞自身可以通過激活誘導的細胞死亡過程而凋亡3、細胞凋亡與DNA和組織損傷、修復有密切聯系細胞損傷嚴重，無法修復時，細胞通過凋亡清除；組織損傷后由肉芽組織轉變?yōu)轳：圻^程當前第16頁\共有148頁\編于星期四\21點4、細胞凋亡與衰老密切相關隨著年齡的增長，許多類型細胞失去凋亡能力，可能是導致衰老和器官功能普遍下降的原因胸腺和淋巴細胞可能也喪失觸發(fā)凋亡信號途徑的能力5、細胞凋亡可能與多種疾病的發(fā)生有直接聯系腫瘤，神經退行性疾病當前第17頁\共有148頁\編于星期四\21點

§4.2MechanismsofapoptosisApoptosisistriggeredbyavarietyofpathways當前第18頁\共有148頁\編于星期四\21點OverviewoftheevolutionarilyconservedapoptotispathwayinC.elegansandvertebrates.當前第19頁\共有148頁\編于星期四\21點Regulators促進或抑制凋亡，CED-9和Bcl-2在營養(yǎng)因子存在的情況下抑制細胞凋亡.Adapters作用于調控蛋白和效應蛋白;在營養(yǎng)因子存在的情況下促進效應蛋白的激活.蛋白酶caspases（胱天蛋白酶）是胞內一種重要的效應蛋白;其活化可導致胞內底物的降解，最終導致細胞死亡.當前第20頁\共有148頁\編于星期四\21點一、caspase與細胞凋亡1、caspase的種類與性質胱天蛋白酶caspase（天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶）,活性位點含有QACXG（X=R，Q，C）保守氨基酸序列。這類酶都以無活性的酶原形式合成并存儲在細胞中。N-端為一個序列、長度特異的原結構域，是caspase的活性調節(jié)結構域，其后是一個大亞基和一個小亞基序列。當前第21頁\共有148頁\編于星期四\21點Caspase被活化時，在原結構域C-端及大、小亞基間保守序列的Asp位點被切割，游離的大、小亞基結合成異二聚體，其活性中心由兩個亞基的部分氨基酸序列共同構成。

caspase異二聚體可進一步二聚化，形成活性更強的四聚體。

Caspaseactivationrequiresdimerizationandtwocleavages.當前第22頁\共有148頁\編于星期四\21點迄今共發(fā)現14種caspase，根據其結構的同源性分3個亞家族：Caspase-1亞家族：caspase-1，4，5，11，12，13，14。它們的活化與炎癥因子的合成有關，多數情況下不是細胞凋亡的直接效應分子。Caspase-2亞家族：caspase-2Caspase-3亞家族：caspase-3，6，7，8，9，10。它們都直接參與介導細胞凋亡過程當前第23頁\共有148頁\編于星期四\21點

根據caspase前體分子(procaspase)的N-端原結構域,以及它們在細胞凋亡中的作用不同，caspase-3亞家族也可以分兩類：具有”long-prodomain”的起始分子initiators，如caspase-8,9,10等?？梢酝ㄟ^這種long-prodomain與胞膜上的受體和接頭蛋白構成的caspase激活復合物結合，結果使caspase起始分子發(fā)生聚集，并通過分子間切割而活化，繼而切割活化下游的caspase分子。當前第24頁\共有148頁\編于星期四\21點具有“short-prodomain”的效應分子，如caspase-3,6,7。它們不能相互聚集，只能作為上游caspase的底物，活化后作用于胞內多種蛋白質或酶類，促使細胞凋亡。

(p517,表21-2）當前第25頁\共有148頁\編于星期四\21點caspase對底物的酶切作用是高度特異的，至少可識別包括Asp在內的4個氨基酸殘基并切割Asp后的肽鍵，該作用同時受底物空間結構的影響。不同的caspase對其底物的氨基酸序列親和力不同，與其功能相適應。

N--Asp–X–X-X--C

疏水多樣化可變，Glu最佳當前第26頁\共有148頁\編于星期四\21點Fourcaspasepathwaysinvolvedinapoptosis

Adaptedfrom“CytokineBulletin”當前第27頁\共有148頁\編于星期四\21點Celltype-specificeffectorofapoptosis-inducingagentsoncaspase-9orcaspase-3deficientmice當前第28頁\共有148頁\編于星期四\21點2、caspase的活化在不同的細胞凋亡因素刺激下，caspase在細胞內可以通過多種不同的途徑被活化，然后切割并激活下游的caspase分子，介導細胞凋亡。（1）由死亡受體介導的“誘導接近”模型：如caspase-8，在上游分子的作用下寡聚化，然后緊密結合的caspase-8分子之間可以發(fā)生切割，釋放p18和p10至胞漿，并裝配成活性蛋白酶。這種起始活性蛋白酶將進一步激活下游的效應蛋白酶caspase-3,-6,-7，或另一分子起始蛋白酶caspase-9。當前第29頁\共有148頁\編于星期四\21點（2）caspase-9的活化通常需要線粒體的參與。Caspase-9在線粒體釋放的細胞色素C和dATP存在下，通過與Apaf-1的CARD(caspaserecruitmentdomain)

結合成一個復合體而得以活化，然后再去激活下游分子，包括caspase-3以及可能隨后被激活的caspase-2,-6,-8,-10,誘導細胞凋亡。Cytc和dATP與Apaf-1結合并誘導后者構象變化，更易聚集caspase-9當前第30頁\共有148頁\編于星期四\21點效應caspase,如caspase-3,-6,-7,主要通過上游caspase的切割而活化。切割后游離的大、小亞基裝配成活化caspase。caspase活化后的功能?當前第31頁\共有148頁\編于星期四\21點3、活化的效應caspase誘導凋亡的機制細胞內有上百種caspase的底物蛋白，如聚（ADP-核糖）多聚酶（PARP）；DNA依賴的蛋白激酶；IkB-α；蛋白激酶C、δ和θ；Rb蛋白；Ras-GTPase活化蛋白；MEKK1；Akt-1和Fak等對于其中一些底物的認識提示，caspase可能通過以下幾種機制參與凋亡當前第32頁\共有148頁\編于星期四\21點（1）滅活細胞凋亡抑制蛋白如caspase對ICAD/DFF45的剪切CAD(caspase活化的DNA酶）是一種導致細胞發(fā)生隨機性

DNA降解的特定核酸酶。非凋亡期，CAD和ICAD（inhobitorofCAD）結合形成無活性復合物細胞凋亡時，caspase剪切ICAD使其失活，CAD從而游離并進入細胞核，降解DNA。DFF：HeLa細胞中分離的DNA片段化因子，ICAD同源分子當前第33頁\共有148頁\編于星期四\21點（2）剪切細胞結構蛋白如caspase對核板的降解作用核板是襯托于核內膜表面的堅固結構，與染色質的組織密切相關。它由核纖層蛋白的頭尾多聚體組成。細胞凋亡過程中，caspase在單一位點剪切核纖層蛋白，導致核板塌陷和染色質濃縮。Caspase剪切的還有肌動蛋白，Fak和核分裂相關蛋白等。當前第34頁\共有148頁\編于星期四\21點（3）剪切核效應蛋白Caspase可能作用于DNA修復、mRNA拼接和DNA修復相關蛋白，使其活性喪失或失調。聚（ADP-核糖）多聚酶（PARP）與DNA修復、基因完整性監(jiān)護有關；細胞凋亡啟動時，PARP被剪切，導致其氨基端的兩個結合DNA的鋅指結構與羧基端的催化結構域分離，進而喪失其正常功能。當前第35頁\共有148頁\編于星期四\21點4、caspase活化的抑制劑細胞內存在一些caspase的抑制蛋白，防止caspase的非特異性活化。一些病毒蛋白或人工小肽也可以抑制caspase（1）IAP(inhibotorsofproteins)家族可以通過與死亡受體復合物上的TRAF結合而阻止細胞凋亡（2）一些caspase的底物如IL-1β以及一些人工小肽，是caspase的抑制劑當前第36頁\共有148頁\編于星期四\21點（3）一些能阻斷l(xiāng)ong-prodomain相互作用的物質如sentrin能特異性結合Fas，卻不能結合FADD，從而阻斷了caspase-8的活化（4）絲氨酸蛋白酶抑制劑如昆蟲病毒蛋白p35,牛痘病毒蛋白CrmA等，都能抑制caspase的活性（5）FLIPs家族在病毒中發(fā)現的凋亡抑制劑，結構域中含有DED，與FADD或caspase-8競爭結合而發(fā)揮負調節(jié)作用當前第37頁\共有148頁\編于星期四\21點5、介導細胞凋亡的其它酶類核酸內切酶:多數作為caspase的底物而被活化并發(fā)揮作用，在核小體連接處切割染色體蛋白激酶：一些與caspase相互作用影響細胞凋亡的蛋白激酶，如PKC，DNA-PKcs（DNA-依賴性蛋白激酶，一種哺乳動物絲/蘇氨酸蛋白激酶，參與損傷DNA的修復、維持細胞結構與功能的完整性，可被caspase-3催化而滅活）當前第38頁\共有148頁\編于星期四\21點總之，caspase是細胞凋亡調控的關鍵分子群，其活化是不同凋亡途徑中共同的下游事件?；罨腸aspase通過切斷與周圍細胞的聯絡、重組細胞估價、阻止DNA復制和修復、破壞DNA和核結構、誘導凋亡小體的形成等，在細胞凋亡中起重要作用。當前第39頁\共有148頁\編于星期四\21點KeyConcepts靶細胞表面的Fas受體與作用細胞質膜表面的FasL（配體）相互結合，從而被激活.Fas和TNF（腫瘤壞死因子）受體相關,FasL類似TNF.Fas與FasL結合后聚集成為三聚體結構.Fas受體胞漿區(qū)結構域即“死亡受體”，作用是與其它蛋白質相互作用。二、死亡受體介導的細胞凋亡當前第40頁\共有148頁\編于星期四\21點1、死亡受體的結構細胞表面有一類能結合細胞間凋亡刺激分子，并將信號傳導至胞內引起凋亡的受體，稱“死亡受體”(deathreceptor,DR)。屬于腫瘤壞死因子受體（TNFR）超家族。當前第41頁\共有148頁\編于星期四\21點TopologystructureofDR當前第42頁\共有148頁\編于星期四\21點TNFR結構上包括：一個由1-6個富含Cys結構域構成的保守的胞外區(qū)，一個60–80個氨基酸組成的“死亡結構域”(deathdomain,DD)的胞內區(qū)Fas/FasL信號途徑中，還含有死亡效應結構域（deatheffectordomain,DED)。該結構域同時存在于起始caspase分子中。當前第43頁\共有148頁\編于星期四\21點2、死亡受體介導凋亡的途徑通常FasL分子以同三聚體形式和3個

Fas分子交聯，導致Fas的死亡結構域

DD成簇，并以DD為中介結合FADD，形成死亡誘導信號復合體（DISC）。隨后，FADD通過其DED結構域和caspase-8的DED相互作用，導致caspase-8形成寡聚體，并驅使其自身活化活化的caspase-8進一步活化效應caspase,如caspase-3等，使細胞發(fā)生凋亡。當前第44頁\共有148頁\編于星期四\21點TNF與其受體TNFR結合后，（1）能夠活化轉錄因子NF-κB和AP-1，誘導促炎癥和免疫調節(jié)基因表達（2）通過與FasL

相同途徑誘導細胞凋亡當前第45頁\共有148頁\編于星期四\21點通過對小鼠突變基因lpr的研究證實了這一凋亡信號通路.該基因是Fas的隱性突變,導致胸腺淋巴細胞增生,引起B(yǎng)細胞、T細胞免疫失衡.另一具有類似作用的突變是gld(產生淋巴肉瘤疾病，lymphoproliferativedisease).證明該基因編碼FasL.當前第46頁\共有148頁\編于星期四\21點TherelatedpropertiesofthesetwolocisuggestthatthisapoptoticpathwayistriggeredbyaninteractionbetweentheFasLligand(gldproduct)andFas(lprproduct).該通路對淋巴細胞的成熟至關重要當前第47頁\共有148頁\編于星期四\21點MitochondriaandBcl-2familiesareinvolvedinFas-inducedapoptosis當前第48頁\共有148頁\編于星期四\21點三、線粒體與細胞凋亡（Apoptosisinvolvesmitochondrialevents）Changesinmitochondriaoccurduringapoptosis(andalsoduringotherformsofcelldeath).Thesearetypicallydetectedbychangesinpermeability(線粒體通透性）.Thebreakthroughinunderstandingtheroleofmitochondriawasthediscoverythatcytochromecisreleasedintothecytosol（細胞色素c釋放）當前第49頁\共有148頁\編于星期四\21點1、細胞凋亡過程中線粒體跨膜電位的變化線粒體內膜通透性小，存在一些載體蛋白和質子泵，能有效地將線粒體基質內的質子泵入外室，形成內負外正的線粒體跨膜電位。幾乎所有誘導劑引起各種細胞凋亡時都伴隨有線粒體跨膜電位的下降，并且這種變化發(fā)生在凋亡細胞的形態(tài)學和生物化學改變之前。線粒體跨膜電位的部分維持依賴于線粒體膜通透性轉運孔（MPT）。當前第50頁\共有148頁\編于星期四\21點生理條件下，MPT呈周期性開放，使線粒體外室的質子進入基質，從而防止質子在外室的過度蓄積。MPT的持續(xù)開放或關閉則分別誘導和抑制細胞凋亡。幾乎所有誘導細胞凋亡的因素都可以造成MPT的破壞，如GSH耗竭劑、caspase-1等。MPT的持續(xù)開放將產生致死性后果，如跨膜電位和呼吸鏈脫偶聯、GSH耗竭、ROS產生、基質Ca2+外流和線粒體膜間蛋白的釋放等。這些因素進一步導致MPT的開放和跨膜電位的破壞當前第51頁\共有148頁\編于星期四\21點Mitochondrialdamageaffairs當前第52頁\共有148頁\編于星期四\21點2、線粒體釋放的凋亡誘導分子Themitochondrionplaysacentralroleinapoptosisbyreleasingcytochromec.ThisisactivatedbyBID.ItisinactivatedbyBcl-2.CytochromecbindstoApaf-1and(pro)-Caspase-9toformtheapoptosome.當前第53頁\共有148頁\編于星期四\21點在Bax過表達、UV照射、氧化劑、神經酰胺等因素的作用下，線粒體MPT開放，外膜破壞并釋放CytC等凋亡相關分子，是介導線粒體凋亡途徑中的重要效應分子。caspase-9(andothercaspases)的蛋白水解酶活性可被IAP家族抑制.線粒體可釋放IAP蛋白家族的拮抗分子.當前第54頁\共有148頁\編于星期四\21點（1）CytC：被釋放至胞質的CytC在ATP或dATP的輔助下可特異性結合胞漿接頭蛋白Apaf-1并促進Apaf-1寡聚化，Apaf-1借其N-端CARD直接募集多個

caspase-9分子，形成“apotosome”,變構并活化

caspase-9.當前第55頁\共有148頁\編于星期四\21點活化的caspase-9再激活下游分子，包括caspase-3及可能隨后被激活的caspase-2,-6,-8,-10。當前第56頁\共有148頁\編于星期四\21點CytC還是線粒體呼吸鏈的重要組成成分，CytC的耗竭可能導致呼吸鏈中電子傳遞的破壞使ATP生成受阻和ROS產生，進而誘導細胞壞死。CytC釋放誘導凋亡還是壞死取決于細胞類型：CytC充足的細胞，仍然有足夠的CytC維持電子轉運，氧消耗和ATP聲稱2保持正常水平——凋亡反之，在含有大量caspase抑制劑的細胞，CytC的釋放不能誘導caspase依賴的細胞凋亡，MPT的破壞則誘導壞死當前第57頁\共有148頁\編于星期四\21點AntiapoptoticsignallingbythePI3-kinase/Aktkinasepathway當前第58頁\共有148頁\編于星期四\21點(2)Smac(secondmitochondria-derivedactivatorofcaspase)線粒體釋放的caspase活化蛋白，MW25kD，N-端具有線粒體定位信號。Smac從線粒體釋放后，與caspase活性抑制蛋白IAPs家族分子結合，從而解除IAPs對caspase的抑制。Smac在p53介導的細胞凋亡信號通路中起重要的促進作用，而Bcl-2、Bax則分別通過抑制和促進Smac的釋放對細胞凋亡起調控作用。當前第59頁\共有148頁\編于星期四\21點（3）凋亡誘導因子（apoptosis-inducingfactor,AIF）1996年發(fā)現，存在廣譜caspase抑制劑是，鼠肝細胞線粒體膜間隙組分仍有促凋亡活性，分離鑒定出AIF。AIF可直接進入細胞核，導致染色體濃縮、斷裂，作用不依賴于caspase。（4）EndoG（endonucleaseG）MW30kD,是一種可以切斷DNA的caspase非依賴性核酸酶，進化上保守，在細胞凋亡中可導致DNA斷裂和染色質濃縮。當前第60頁\共有148頁\編于星期四\21點四、Therearemultipleapoptosispathways（一）細胞核凋亡誘導途徑以p53為中心的核凋亡通路及其轉換機制在細胞凋亡的誘發(fā)中具有重要作用。當細胞面臨DNA損傷、紡錘絲斷裂、癌基因異常激活、缺氧等不利因素時，在上游信號分子的作用下，p53表達上調，一方面通過與p16,p21以及Rb等相互作用引起細胞周期阻滯，另一方面通過促進bax,fas等基因表達，誘導細胞凋亡。當前第61頁\共有148頁\編于星期四\21點當前第62頁\共有148頁\編于星期四\21點（二）粒酶(Granzyme)B介導的細胞凋亡細胞毒性T淋巴細胞殺傷靶細胞的機制之一是誘發(fā)細胞凋亡，這種凋亡的作用主要是由它們分泌的粒酶B實現的。1、粒酶B（GrB）的基本結構與功能粒酶是CTL和NK細胞殺傷性顆粒中絲氨酸蛋白酶家族的總稱。以酶原形式合成，接受胞內外信號刺激后被激活。人類有5種：GrA、GrB、GrH、GrM和類胰蛋白酶-2粒酶的重要功能是參與顆粒介導的殺傷過程，酶切靶細胞內多種底物蛋白，有效啟動細胞凋亡。當前第63頁\共有148頁\編于星期四\21點Propertiesofgranzymesinhumansandrodents

GranzymeSpeciesActivityPredictedcleavageMr(kD)Cellularexpression

AMo,H,RtTryptaseLysine,arginine65*CTLs,NKcells,γδTcellsandthymocytesB Mo,H,RtAsp-aseAsp>Glu 32 CTLs,NKcells,γδTcellsandthymocytesC Mo,Rt UnknownAsporSer27CTLs D Mouse UnknownHydrophobic35-50CTLs E Mouse UnknownHydrophobic 35-45CTLs F Mo,Rt UnknownHydrophobic 35-50 CTLs G Mouse UnknownHydrophobic 30 CTLs H Human ChymasePhen>Tyr32 CTLsandNKcells J Rat UnknownUnknown 30 Unknown M Mo,H,RtMet-aseMet>Leu 30 NKcells JATrapani,GenomeBiology2001,2(12):reviews3014.1–3014.7當前第64頁\共有148頁\編于星期四\21點GrB活性中心由3個氨基酸組成：His44，Asp88，Ser183，其中Ser是發(fā)揮催化活性的關鍵殘基。GrB與其它幾種粒酶及穿孔素(perforin,PFN)等一起貯存于CTL的殺傷性顆粒中。其N-端帶有一個酸性二肽，必須經顆粒中的二肽酰基肽酶1加工除去，才能產生活性GrB。GrB活性受嚴格調控。（酶原形式，環(huán)境pH）。當前第65頁\共有148頁\編于星期四\21點2、粒酶B進入靶細胞的途徑當CTL識別靶細胞時，殺傷性顆粒迅速移向與靶細胞接觸的位置----極化現象。發(fā)生脫顆粒，使其中的GrB等釋放，接著進入靶細胞。進入途徑有：PFN孔道模型：PFN在中性pH和Ca2+參與下，12-18個PFN形成直徑15~18nm的多聚復合體孔道，將GrB運輸入胞。當前第66頁\共有148頁\編于星期四\21點GrB內吞模型：GrB是通過靶細胞膜表面受體介導內吞作用，進入靶細胞的內吞小體中。陽離子非依賴型6-磷酸甘露糖受體是GrB的死亡受體。PFN的主要功能是促使GrB從內吞小體中釋放，進一步定位到細胞核與細胞漿，特異切割底物。當前第67頁\共有148頁\編于星期四\21點3、粒酶B誘導細胞凋亡的途徑（1）caspase依賴的死亡通路GrB可以切割激活多種caspase前體。此外，GrB還可以直接切割caspase下游底物，如PARP,DFF45,Bid等，進一步放大caspase的作用。當前第68頁\共有148頁\編于星期四\21點（2）GrB介導的線粒體凋亡途徑GrB高效切割Bid，產生截短型Bid轉位至線粒體，并募集Bax嵌入線粒體膜，誘導線粒體釋放CytC、Smac/Diablo等多種促凋亡分子。GrB誘導線粒體開啟膜通透性孔道PTP和破壞跨膜電位，直接損傷線粒體功能。GrB還能使線粒體去極化，直接引起細胞死亡。這一過程需要胞內因子參與。當前第69頁\共有148頁\編于星期四\21點（3）GrB還可以直接切割DFF45使之失活，釋放出核酸酶CAD，引起細胞核DNA片段化；GrB還可以直接遷移至核內，切割核蛋白，啟動回促進核凋亡。在GrB誘導細胞死亡過程中，caspase依賴性途徑和線粒體途徑占主導地位，其它途徑的作用相對較弱。但各途徑之間也是相互協同、相互補充的。當病毒或腫瘤細胞干擾、破壞主要途徑，逃避宿主免疫監(jiān)視時，次要途徑就發(fā)揮重要作用，清除異常細胞。當前第70頁\共有148頁\編于星期四\21點AschematicmodelofGrB–mediatedapoptosis當前第71頁\共有148頁\編于星期四\21點Putativeextracellular(perforin-independent)rolesforGrBinage-relatedchronicinflammatorydisordersLaboratoryInvestigation(2009)89,1195–1220當前第72頁\共有148頁\編于星期四\21點（三）內質網相關的凋亡誘導途徑Caspase-12前體分子主要定位在ER膜表面，可能與ER介導的細胞凋亡有關鈣離子通道劑A23187等作用下，ER表面的caspase-12被calpain剪切活化并釋放到胞漿中，引起PC12等細胞凋亡。當前第73頁\共有148頁\編于星期四\21點(1)內質網蛋白質成熟和折疊的破壞導致內質網損傷從而引發(fā)細胞凋亡;(2)內質網凋亡蛋白酶caspase-12的激活;(3)內質網鈣信號的異常(Breckenridgeetal。2003)。(3)內質網膜上也存在Bak等凋亡蛋白，在凋亡因子的刺激下，Bax也能在內質網上富聚，Bax和Bak的多聚化和caspase·12的激活可導致細胞凋亡當前第74頁\共有148頁\編于星期四\21點Huetal.JBiochemMolBiol.2005,38(6):709-716Tanetal.JBC2006,Apr5,epubahead當前第75頁\共有148頁\編于星期四\21點當前第76頁\共有148頁\編于星期四\21點（四）細胞的脫落凋亡（anoikis）細胞與基質間的相互作用對細胞的生長和增殖有重要作用，如果失去基質的支持，細胞會發(fā)生程序性死亡，稱脫落凋亡。整合素家族介導的相關蛋白激酶途徑起重要作用。包括FAK，PTK，

PI-3K/Akt，MAPK，SAPK/JNK等。當前第77頁\共有148頁\編于星期四\21點ModelforFAK-NTinducedroundingandapoptosisinbreastcancercelllines當前第78頁\共有148頁\編于星期四\21點HIECcellsselectivelyexpressPI3-Kisoformcomplexes,translatingintodistinctrolesinAkt-1activationandcellsurvival,aswellasinaselectiveengagementbyFakand/orSrcwithinthecontextofb1integrin/Fak/Src-mediatedsuppressionofanoikisApoptosis(2012)17:566–578當前第79頁\共有148頁\編于星期四\21點當前第80頁\共有148頁\編于星期四\21點(五）necroptosis（necrosis+apoptosis，壞死狀凋亡）缺乏凋亡條件(如FasL,TNF等)的情況下，利用RIPK1激酶促發(fā)細胞壞死狀凋亡當前第81頁\共有148頁\編于星期四\21點當前第82頁\共有148頁\編于星期四\21點Aponecrosis凋亡樣壞死指一類凋亡和壞死的混合形式。許多細胞毒性物質會在低濃度誘導PCD，在高濃度引起細胞壞死。假設細胞程序性死亡發(fā)生前細胞穩(wěn)態(tài)過程已經受損，可以解釋該現象。事實上，這是細胞毒性最常見的模式，從過氧化氫和其他氧化物到線粒體毒性物質antimycinA。Nicotera，Lipton和他們的同事證明了谷氨酸誘導的神經元細胞死亡，可能通過凋亡或壞死,依賴于線粒體膜電位改變和細胞內能量狀態(tài)。然而，在大多數情況下，與壞死樣形態(tài)學改變有關的aponecrosis并未證明是程序化的。當前第83頁\共有148頁\編于星期四\21點Apoptoticandnecrotichepatocellulardeathinresponsetostresssignals當前第84頁\共有148頁\編于星期四\21點JournalofReproductiveMedicineandEndocrinology2006;3(2):103-108當前第85頁\共有148頁\編于星期四\21點當前第86頁\共有148頁\編于星期四\21點§4.3檢測凋亡的常用方法和技術一、細胞形態(tài)學的評價1、普通光鏡、熒光顯微鏡觀察分別對細胞核、質染色，計算凋亡細胞數目缺點：常受主觀因素干擾，重復性較差ab當前第87頁\共有148頁\編于星期四\21點2、電子顯微鏡觀察

凋亡細胞膜表面變化，如膜發(fā)泡和某些結構的丟失，染色質固縮和線粒體超濃縮用于定性研究,不適于定量necrosisapoptosis當前第88頁\共有148頁\編于星期四\21點二、質膜完整性的評價檢測（一）細胞膜及核膜完整性的檢測1、膜通透性檢測（1）拒染實驗臺盼藍、碘化丙啶（PI）、EB等為膜不通透染料，可使壞死細胞或凋亡后期繼發(fā)性壞死細胞核著色，而活細胞或凋亡細胞不著色。缺點：不能區(qū)別繼發(fā)性壞死和真正意義上的壞死細胞；且易低估細胞死亡的程度，因為早期凋亡細胞還具有完整的細胞膜而被錯誤地當作活細胞。當前第89頁\共有148頁\編于星期四\21點（2）濃染實驗Hoechst33342、33258等為膜通透性染料，可之凋亡細胞著色濃密，區(qū)別正常細胞和凋亡細胞。（3）雙重染色采用對正常細胞膜和凋亡細胞跨膜通透性不同的兩種染料同時染色來區(qū)別常用流式細胞儀或熒光顯微鏡對丫啶橙（AO）和EB的雙重染色的細胞進行分析。正常細胞AO染色呈綠色；凋亡細胞AO陽性，EB陽性紅染。當前第90頁\共有148頁\編于星期四\21點2、AnnexinV的檢測一種通過檢測細胞膜結構的改變來區(qū)分活細胞、凋亡或壞死細胞的方法。凋亡細胞膜磷脂不對稱，膜內磷脂酰絲氨酸外翻，與連接素（Annexin）V有較強的親和力。因此熒光標記的AnnexinV可以作為一種敏感探針來檢測細胞凋亡同時使用膜不通透性染料PI能將凋亡細胞與壞死細胞區(qū)別當前第91頁\共有148頁\編于星期四\21點FCMdetectingofAnnexinV-conjugatedcells當前第92頁\共有148頁\編于星期四\21點（二）線粒體等細胞器膜完整性的檢測通過檢測線粒體跨膜電位的改變，來檢測線粒體膜完整性一些帶有正電荷、并具有膜通透性和親脂性的熒光染料均能被活細胞攝取并堆積在線粒體中。當凋亡發(fā)生后，線粒體跨膜電位降低，染料減少，可借助流式細胞儀檢測。Thefluorescentindicatorprovidedaggregatesinthemitochondria.

healthycells-redfluorescence.apoptoticcells-greenfluorescence.當前第93頁\共有148頁\編于星期四\21點三、DNA斷裂的檢測

1、DNAladder細胞凋亡時主要的生化特征是其染色質發(fā)生濃縮,染色質DNA在核小體單位之間的連接處斷裂,180-200bp整數倍的寡核苷酸片段,在凝膠電泳上表現為梯形電泳圖譜(DNAladder)。細胞經處理后，采用常規(guī)方法分離提純DNA，進行瓊脂糖凝膠和溴化乙啶染色，在凋亡細胞群中可觀察到典型的DNAladder。

當前第94頁\共有148頁\編于星期四\21點

細胞色素c誘導的凋亡細胞DNA電泳圖1．細胞色素c誘導0h2．細胞色素c誘導1h3．細胞色素c誘導2h4．細胞色素c誘導3h5．細胞色素c誘導4h6．陰性對照7．Marker

（自趙允、翟中和）當前第95頁\共有148頁\編于星期四\21點“DNAladder”被作為細胞凋亡的一個重要的生化指標。

缺點：此方法敏感性不高，大量凋亡細胞同時存在時才出現典型的結果，且只能被用于細胞群體，不能用于組織的原位檢測。

當前第96頁\共有148頁\編于星期四\21點2、DNA凋亡峰的檢測凋亡細胞在固定和清洗中，易發(fā)生小分子量DNA流失，導致細胞內DNA含量減少應用DNA特異性熒光染料（PI，DAPI，Hoechst）染色后，在流式細胞儀進行的細胞周期分析中，凋亡細胞常以亞二倍體形式出現當前第97頁\共有148頁\編于星期四\21點3、TUNEL技術原理:細胞凋亡中,染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產生大量的粘性3'-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標記到DNA的3'-末端，從而可進行凋亡細胞的檢測，這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法（terminal-deoxynucleotidyltransferasemediatednickendlabeling,TUNEL）。當前第98頁\共有148頁\編于星期四\21點

當前第99頁\共有148頁\編于星期四\21點CDEFGHIJ當前第100頁\共有148頁\編于星期四\21點優(yōu)點未端脫氧核苷酸轉移酶（TdT）使核苷酸在雙鏈的斷端延伸，不需要模板的存在由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3‘-OH形成，很少能夠被染色。TUNEL實際上是分子生物學與形態(tài)學相結合的研究方法，對完整的單個凋亡細胞核或凋亡小體進行原位染色，能準確地反應細胞凋亡典型的生物化學和形態(tài)特征可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養(yǎng)的細胞和從組織中分離的細胞的細胞形態(tài)測定，并可檢測出極少量的凋亡細胞，因而在細胞凋亡的研究中被廣泛采用。當前第101頁\共有148頁\編于星期四\21點缺點值得注意的是壞死期由于內源性核酸內切酶和蛋白質酶的等作用，DNA被切割成大小不等的片段，常可出現陽性反應；組織或細胞處理不當時也可出現假陽性。因而，TUNEL等方法對凋亡細胞的標記是選擇性的,而不是特異性的。TUNEL或其他DNA裂解原位標記的分析應結合陽性細胞的形態(tài)，尤其是核的特征，細胞的分布和有無炎癥反應，以排除非凋亡的陽性反應。當前第102頁\共有148頁\編于星期四\21點四、生化指標Caspase3的活化

當前第103頁\共有148頁\編于星期四\21點細胞色素c的釋放當前第104頁\共有148頁\編于星期四\21點Bcl-2的表達和磷酸化

當前第105頁\共有148頁\編于星期四\21點Fas和FasL

的表達當前第106頁\共有148頁\編于星期四\21點§4.4細胞凋亡的調控一、細胞自身蛋白的調控作用1、p53的調控作用

p53的基本結構：野生型p53蛋白為一393AA的轉錄因子，活性形式為四聚體，自N-端為：轉錄活化區(qū)、DNA結合區(qū)、四聚體化區(qū)及C-端調節(jié)區(qū)。p53C-端易被降解或發(fā)生磷酸化修飾當前第107頁\共有148頁\編于星期四\21點AA324-355對p53蛋白的四聚化是必需的，使之首先形成2個各由2個β-折疊和2個α-螺旋構成的二聚體，兩個二聚體通過疏水作用連接成一個四螺旋結構當前第108頁\共有148頁\編于星期四\21點P53的表達及活性調節(jié)細胞中DNA損傷，紡錘絲斷裂，癌基因異常激活，缺氧，以及ATP耗竭等信號都能導致p53水平的迅速升高和p53蛋白活化。（蛋白半衰期延長、轉錄上調）已發(fā)現幾種探測DNA損傷的“分子探測器”ATM、DNA-PKcs、ATR等，可以將DNA損傷或脅迫信號傳遞給p53,誘導細胞凋亡。當前第109頁\共有148頁\編于星期四\21點正常細胞中p53的含量和活性是受到嚴密監(jiān)控的。HDM2（humandoubleminute-2)是p53的最主要的負反饋分子，介導p53的胞漿轉運和泛素化降解；JNK也可以結合p53并介導其泛素化降解細胞受到刺激時，眾多激酶可以對p53分子的不同位點進行多種修飾，進而發(fā)揮不同功能。如p53的Ser15,Thr8,Ser20等被磷酸化后，HDM2不能與p53結合——阻止降解；某些激酶磷酸化HDM2的p53結合位點，使其失去結合能力當前第110頁\共有148頁\編于星期四\21點p14蛋白與HDM2結合，抑制HDM2的E3泛素連接酶活性，使p53免于降解Regulationofp53protein當前第111頁\共有148頁\編于星期四\21點p53對細胞凋亡和細胞周期的調節(jié)作用細胞可以經過以p53為核心的信號轉導機制進行基因修復、引起細胞周期阻滯、或誘導細胞凋亡p53主要作用于細胞周期的G1期、G2/M期、G0-G1-S-Rb等檢查點，并引起細胞周期停滯。G1/S期調節(jié)點是p16-cyclinD1-CDK4-Rb途徑，p16是cyclinD1-CDK4的負調節(jié)因子，Rb是cyclinD1-CDK4的主要靶蛋白，通過作用于E2F-DP轉錄因子復合體調節(jié)細胞周期S期必需基因。當前第112頁\共有148頁\編于星期四\21點p53可以通過促進細胞周期抑制蛋白p21作用于p16、Rb等信號途徑，抑制cyclin-CDK復合體，如cyclinD-CDK4,cyclinE-CDK2等的活性，當前第113頁\共有148頁\編于星期四\21點接著Rb去磷酸化，結合E2F并抑制E2F家族的轉錄調節(jié)活性，引起細胞周期停滯在G1期。當前第114頁\共有148頁\編于星期四\21點當前第115頁\共有148頁\編于星期四\21點當前第116頁\共有148頁\編于星期四\21點細胞周期在G1、G2/M期的停滯為DNA修復提供了時間，一旦修復失敗，p53則在其它因素的配合下誘導細胞凋亡。當前第117頁\共有148頁\編于星期四\21點2、Bcl-2家族蛋白的調控作用Bcl-2是迄今研究最深入、廣泛的凋亡調控基因之一。哺乳動物中已發(fā)現至少15個Bcl-2同源蛋白：

凋亡抑制蛋白：Bcl-2,Bcl-XL,A1/Bf-1,Bcl-W,Mcl-1等凋亡誘導蛋白：Bax,Bcl-Xs,Bad,Bik,Bak,Bid,Hrk等當前第118頁\共有148頁\編于星期四\21點（1）Bcl-2家族的結構特點及其與功能的關系包含兩大結構域：C-端的跨膜結構域(transmembraneregion,TM);數量不等的Bcl-2同源結構域(Bcl-2homology,BH)。按結構分Bcl-2,Bax,BH3家族當前第119頁\共有148頁\編于星期四\21點Bcl-2是一種細胞內膜蛋白，主要定位于線粒體、內質網和核膜。TM結構域（信號錨定序列）是Bcl-2定位所必需的。BH結構域是介導與其它分子間相互作用的重要功能區(qū)。多數Bcl-2家族蛋白能形成二聚體（通過BH結構域）。促進存活和促進凋亡的成員間也可以借助于BH形成二聚體，影響彼此功能當前第120頁\共有148頁\編于星期四\21點（2）Bcl-2家族蛋白對凋亡的調節(jié)作用Bcl-2亞家族，如Bcl-XL能通過BH4結合Apaf-1，阻止后者對caspase-9的活化；而BH3亞家族，如Bik，則與Bcl-XL結合而抑制上述活性。由于含有BH1、BH2，Bcl-2和Bax可以在細胞器膜上形成性質不同的孔道，從而保護或破壞該細胞器。如Bcl-2、Bcl-XL能抑制線粒體PTP開放和維持跨膜電位；相反，Bcl-Xs則阻止Bcl-XL和CytC結合。Bcl-2家族蛋白自身活性也受調節(jié)——蛋白磷酸化當前第121頁\共有148頁\編于星期四\21點當前第122頁\共有148頁\編于星期四\21點Proposedintracellularpathwaysleadingtocelldeathbyapoptosisortotrophicfactor–mediatedcellsurvivalinmammaliancells.當前第123頁\共有148頁\編于星期四\21點3、IAP(inhibitorofapoptosisproteins)家族蛋白的調控作用IAP是一類發(fā)現于桿狀病毒中的細胞凋亡抑制蛋白家族。在人類中已發(fā)現6個成員：NIAP，c-IAP1，c-IAP-2，XIAP，Survivin，BRUCE。IAP一級結構中N-端為桿狀病毒IAP重復序列BIR，BIR的C-端包含CX2CX16HX6C保守序列，IAP分子可串聯2-3個BIR結構，但只有含BIR2才有活性。IAP的C-端是一個鋅指結構，與IAP分子的調節(jié)功能有關。當前第124頁\共有148頁\編于星期四\21點IAP抑制細胞凋亡：直接抑制caspase的活化caspase-3,7,9）當前第125頁\共有148頁\編于星期四\21點作用于TNFR介導的信號轉導通路(降解I-κB引起NF-κB活化，抑制凋亡的發(fā)生)當前第126頁\共有148頁\編于星期四\21點二、病毒蛋白的調控作用1、病毒的Bcl-2同源蛋白腺病毒編碼的EIA有雙重功效：激活靜息期細胞進入細胞周期；而在細胞增殖受阻時誘導細胞凋亡

EIA表達的結果依賴于細胞中p53.E1B-19kD類似于Bcl-2，抑制p53介導的細胞凋亡

LMP、BHRF1等促進細胞存活當前第127頁\共有148頁\編于星期四\21點2、caspase活化抑制蛋白如IAP家族等3、HIV感染介導的細胞凋亡HIV外殼蛋白誘導T細胞凋亡通過Fas/FasL途徑當前第128頁\共有148頁\編于星期四\21點三、細胞周期與細胞凋亡調控在生物體中細胞的增殖和死亡是密切相關，受到精細調控的過程，二者共同維持特定器官和組織的平衡和細胞數目的穩(wěn)定。細胞周期檢查點的調控G1期——p53，Rb，E2FS，G2/M——Bcl-2，p53當前第129頁\共有148頁\編于星期四\21點CellcyclewereregulatedbyCDKcomplexes當前第130頁\共有148頁\編于星期四\21點§4.5細胞凋亡與疾病一、細胞凋