蠶豆根尖微核檢測

蠶豆根尖微核檢測指導老師：吳麟

組長：路青瑜小組成員:何悅李婷陳鴻譚小娥劉清唐珍馮沁李雙吳海林符方亮摘要：本實驗運用蠶豆根尖微核檢測技術，分別用0.25mg/mL染發(fā)劑、0.5mg/mL洗潔精對蠶豆根尖做處理，同時以0.25mol/L疊氮化鈉處理蠶豆根尖做陽性對照，自來水作陰性對照。鏡檢后測得其微核率分別為17.55%，19.82%，23.18%，11.16%；染發(fā)劑、洗潔精處理的污染指數分別為1.7、1.8，結果表明均屬于輕度污染。關鍵詞：蠶豆微核檢測微核率Abstract：Thisexperimentusingviciafabamicronucleustesttechnology,respectivelyfor0.25mg/mLcolourants,0.5mg/mLofviciafabadetergent,atthesametimetodoprocessingmol0.25/sodiumazideprocessingviciafabadopositive,negativecontrolforwater.Afterthemicroscopicmicronucleusrate17.55%respectively,19.82%,23.18%,11.16%,Hair,detergentpollutionindexrespectivelywith1.7,1.8,resultsshowthatbelongtolightpollution.Keyword：Horsebeanmicronucleustest；micronucleusrate引言：染發(fā)劑和洗潔精都是我們生活中的日用品，特別是洗潔精?；瘜W去污劑主要分為陽離子型、陰離子型和非離子型3類（其中陰離子型表面活性劑使用頻率最高）。國內學者采用該技術開展了水體污染物、環(huán)境污染物和合成洗滌劑方面的研究。生活洗滌劑侵人人體后與其它的化學物質結合后，毒性會增加數倍，尤其具有很強的誘發(fā)癌特性。據有關報導，人工實驗培養(yǎng)胃癌細胞、注入化學洗滌劑基本物質LAS會加速癌細胞的惡化。LAS的血溶性也很強，容易引起血紅蛋白的變化，造成貧血癥。染發(fā)劑主要成分為：氨水、對苯二胺。市場上絕大部分染發(fā)劑都含有致癌物“對苯二胺”，長期使用將導致白血病、皮膚癌、乳腺癌等疾病。對苯二胺是國際公認的一個致癌物質。由于染發(fā)劑接觸皮膚，而且在染發(fā)的過程中還要加熱，苯類有機物質通過接觸和加熱后，通過頭皮進入毛細血管，然后隨血液循環(huán)到達骨髓，如果長期反復作用于造血干細胞，會導致白血病的發(fā)生。經常染發(fā)的人群乳腺癌、皮膚癌、膀胱癌的發(fā)病率都會增加。微核(micronucleus,簡稱MCN)，也叫衛(wèi)星核，是真核類生物細胞中的一種異常結構，是染色體畸變在間期細胞中的一種表現(xiàn)形式。微核往往是各種理化因子，如輻射、化學藥劑對分裂細胞作用而產生的。在細胞間期，微核呈圓形或橢圓形，游離于主核之外，大小應在主核1/3以下。微核的折光率及細胞化學反應性質和主核一樣，也具合成DNA的能力。一般認為微核是由有絲分裂后期喪失著絲粒的染色體斷片產生的。有實驗證明，整條染色體或幾條染色體也能形成微核。這些斷片或染色體在分裂過程中行動滯后，在分裂末期不能進入主核，便形成了主核之外的核塊。當子細胞進入下一次分裂間期時，它們便濃縮成主核之外的小核，即形成了微核。已經證實，微核率的大小是和作用因子的劑量或輻射累積效應呈正相關，這一點與染色體畸變的情況一樣。所以許多人認為可用簡易的周期微核計數來代替繁雜的中期畸變染色體計數。由于大量新的化合物的合成，原子能的應用，各種各樣工業(yè)廢物的排出等都存在污染環(huán)境的可能性，欲了解這些因素對機體潛在的遺傳危害，需要有一套高度靈敏，技術簡單易行的測試系統(tǒng)來監(jiān)測環(huán)境的變化。只有真核類的測試系統(tǒng)更能直接推測誘變物質對人類或其它高等生物的遺傳危害，在這方面，微核測試是一種比較理想的方法。目前，國內外不少部門已把微核測試用于輻射損傷、輻射防護、化學誘變劑、新藥試驗、食品添加劑的安全評價，以及染色體遺傳疾病和癌癥前期診斷等各個方面。微核檢測技術靈敏度高，可靠性強；技術簡單，易于操作，而且有顯而易見的實用性；實驗周期短，且蠶豆根尖細胞周期中大部分時間處于對誘變劑敏感的間期，便于遺傳毒性檢測試驗，精確度也比較高。本實驗為染發(fā)劑和洗潔精的毒性提供了理論依據，同時引起人們的高度重視，也希望有關部門對日用品中的有害物質含量進行嚴格控制和檢測。2實驗部分2.1材料與試劑蠶豆(viciafaba)(為當年生無蟲飽滿，大小均一蠶豆(Vciafaba)種子，四川

農業(yè)大學農學院遺傳學實驗室提供）6mol/L鹽酸，甲醇，醋酸洋紅，CrO3,NaN3處理液，甲基磺酸乙酯（EMS），蒸餾水，冰醋酸，卡諾氏固定液，乙酸乙酯顯微鏡，計數器，鑷子，載玻片，蓋玻片，燒杯，磁盤，培養(yǎng)箱，分析天平，水浴鍋，酒精燈，剪刀，解剖針，濾紙，鉛筆，標簽紙，膠水等。2.2實驗預處理實驗流程圖:2.3實驗步驟2.3.1浸種催芽選擇粒大飽滿、大小均勻的蠶豆種子按需要量放入盛有自來水的燒杯中，在25°C下浸泡24h,期間至少換水2次。種子吸脹后，用紗布松散后裹置瓷盤中，保持濕度，在25C恒溫培養(yǎng)箱中催芽12?24h，待初生根長2?3mm，取發(fā)芽良好的種子，放入鋪滿濾紙的瓷盤中25C繼續(xù)催芽，經約36?48h,大部分初生根長至1?2cm，根毛發(fā)育良好，這時即可用于檢測了。2.3.2誘變劑處理取染發(fā)劑用蒸餾水配置成不同濃度的溶液，濃度為0.25mg.mL-1；稱取氧化型染發(fā)劑樣約0.25g(精確至少數點后四位)于5mL離心管中，加乙酸乙酯(或者分析純二甲基亞颯(DMSO))定容，混勻，放置離心機(2000r/min)中離心20min，取上層清液稀釋到250mL。此溶液含洗發(fā)劑0.25mg/mL，取適量體積置于培養(yǎng)皿中用于處理蠶豆根尖。將雕牌洗潔精分別配成0.5mg/mL的溶液100mL,并用稀鹽酸調節(jié)酸堿度，使pH為7-8。取和染發(fā)劑等體積的溶液處理蠶豆根尖。同時用自來水作陰性對照，用0.25mg/L疊氮化鈉作陽性對照。當初生根長到2?3cm時，各選初生根生長良好的蠶豆6?8粒，分別放入四個培養(yǎng)皿中中，染色24?27h。2.3.3恢復培養(yǎng)處理后的種子用自來水和蒸餾水共浸洗3?5次，每次2?3min，洗凈后，再置入鋪有濕潤濾紙的瓷盤中中，25C恢復培養(yǎng)22?24h。2.3.4取材、固定 將恢復培養(yǎng)后的種子，從根尖頂端，切下1cm長的幼根。用卡諾氏液固定24h。2.3.5解離、制片觀察用蒸餾水浸洗兩次，每次5min，吸十，加入6mol/L鹽酸將幼根浸沒，室溫下酸解10min，幼根軟化即可。吸取鹽酸，用蒸餾水浸洗三次，每次1?2min，最后浸于水中；取根置于載玻片上，截下1?2mm長的根尖，滴一滴醋酸洋紅染液，染色5?8min，加蓋玻片壓片觀察。2.3.6微核計數微核是游離于蠶豆根尖細胞漿中圓形或橢圓形小體.其太小不超過主核1/3,染色性與主核相一致。每組隨機取3個根尖，高倍鏡觀察l000個間期細胞，統(tǒng)計徽核數及徽核率，然后用方差分析做統(tǒng)計學處理。結論3.1、實驗結果與分析通過鏡檢后得到的實驗數據如下表所示:處理物質0.25mg/mL染發(fā)劑溶液0.5mg/mL洗潔精溶液自來水（陰性對照）0.25mol/L疊氮化鈉（陽性對照）觀察的細胞個數26783278110251596微核數476512337微核率17.55%19.82%11.16%23.18%根據上表中的數據可進一步計算污染指數［污染指數二樣品實測微核千分率平均值/對照組（自來水）微核千分率平均值］，染發(fā)劑和洗潔精的污染指數分別為1.7、1.8，均在1.5?2區(qū)間，屬于輕度污染。另外，本實驗中疊氮化鈉對蠶豆根尖微核的誘導作用最強，洗潔精、染發(fā)劑次之，自來水的誘導作用最弱，而且其微核率偏高。這主要因為現(xiàn)在自來水中加了消毒劑，消毒劑是化學物質，對蠶豆根尖有一定程度的誘導作用使其形成微核。4、綜述綜上可見，洗潔精毒性不大，只要控制其用量可供日常生活使用；單次使用一定劑量的染發(fā)劑染發(fā)也不會有很強的毒性，但如果使用頻繁，對人體細胞的誘導作用加強，很可能會致癌。本實驗通過染發(fā)劑、洗潔精對染色體的危害進行了研究，進而推斷出其對人體的危害，以引起人們的高度重視，同時也為染發(fā)劑的進一步研究提供了依據。參考文獻［1］趙躍華.細胞微核技術的研究和應用.生物學通報［N］.1992.1:2］孫立平等.微核實驗的自動化檢測研究進展［J］.癌變?畸變?突變.2004［3］ 周秀艷等.遼寧典型工業(yè)廢水生物毒性綜合評價［J］.毒理學雜志.2005［4］ 臧宇等.蠶豆根尖微核試驗的應用與發(fā)展.癌變?畸變?突變［M］.1999宋虹劉明友.蠶豆微核檢測技術在制漿造紙廢水生物危害性測試上的應用.PaperScience&Technology[M].2006帥素容.誘變物質的微核檢測技術.普通遺傳學實驗教程[M].2003.8劉增禹蔡文國.方便面調料對蠶豆根尖的遺傳毒性[J].食品科技.2009劉瑞祥，?；蓰惖?微核技術及其在監(jiān)測水質污染中的應用，晉東南師范專科學校學報.2002,19(5)：25-27[9]陳曉倩.應用蠶豆根尖細胞微核技術檢測上海給排水系統(tǒng)中的致突變情況.癌變?畸變?突變，2000,12(4)：214-2l8艾爾肯?熱合曼等.用蠶豆根尖細胞微核技術檢測烏魯木齊河水質.干旱環(huán)境監(jiān)測，2000,14(1)：6-l1張國棟等.揚中市地表水的致突變性研究.重慶環(huán)境科學，2002,22(3)：58-60徐鑫成等.蘆薈和大蒜抗誘發(fā)微核效應.癌變?畸變?突變，1999,l1(5)：233-236徐鑫成，李曉萍.細胞微核技術及其應用.科技開發(fā)動態(tài).2004,(3)：3-5蓋均鎰.實驗統(tǒng)計方法.北京：中國農業(yè)出版社，2005：88-90陳光榮，金波，李明等.污染指數在微核技術監(jiān)測水質污染中的應用.中國環(huán)境科學，1986,6(2):60-63Mosley-Foreman,C,Choi,J;Wang,S;Yu,H.PhototoxicityofphenylenediaminehairdyechemicalsinSalmonellatyphimuriumTA102andhumanskinkeratinocytes.[J].JacksonStateUniversity,Jackson,MS39217,USA.Hu,T,Bailey,RE;Morrall,SW