基因重組和基因工程

目的要求熟悉DNA重組的類型：同源重組、特異位點(diǎn)重組和轉(zhuǎn)座重組等。熟悉同源重組、特異位點(diǎn)重組、轉(zhuǎn)座、插入序列和轉(zhuǎn)座子、接合作用、轉(zhuǎn)化作用和轉(zhuǎn)導(dǎo)作用的概念；細(xì)菌的基因轉(zhuǎn)移的方式。掌握重組DNA技術(shù)的相關(guān)概念：重組DNA技術(shù)的基本原理和過(guò)程；目的基因的概念及種類。熟悉限制性內(nèi)切核酸酶的概念、識(shí)別位點(diǎn)及切割產(chǎn)生的末端；目的基因的獲取途徑；外源基因與載體的連接方式；重組DNA導(dǎo)入受體菌的方式；重組體的篩選方法。當(dāng)前第1頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)1

自然界DNA重組和基因轉(zhuǎn)移是經(jīng)常發(fā)生的

DNARecombinationandGeneTransferOccurFrequently

inNature第一節(jié)當(dāng)前第2頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)2什么是DNA重組？DNA分子內(nèi)或分子間發(fā)生遺傳信息的重新組合。DNA片段在細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞間，甚至在不同物種之間進(jìn)行交換，交換后的片段仍然具有復(fù)制和表達(dá)的功能當(dāng)前第3頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)3DNA重組廣泛存在于各類生物：真核生物基因組間重組多發(fā)生在減數(shù)分裂時(shí)同源染色體之間的交換。原核生物來(lái)自不同親代兩組DNA之間可通過(guò)多種形式遺傳重組。意義：迅速增加群體遺傳多樣性、區(qū)分有利、不利突變、通過(guò)優(yōu)化組合積累有意義的遺傳信息參與許多重要的生物學(xué)過(guò)程當(dāng)前第4頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)4DNA重組的分類轉(zhuǎn)座(transposition)同源重組(homologousrecombination)位點(diǎn)特異的重組(site-specificrecombination)當(dāng)前第5頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)5概念：發(fā)生在同源序列間的重組，通過(guò)鏈的斷裂（,配對(duì)）和再連接，在兩個(gè)DNA分子同源序列間進(jìn)行單鏈或雙鏈片段交換的過(guò)程。又稱基本重組（generalrecombination)。是最基本的DNA重組方式一、同源重組是最基本的DNA重組方式指在同一物種不同個(gè)體間或不同物種間相同或相似的DNA序列

當(dāng)前第6頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)6同源重組最初的證據(jù)來(lái)自細(xì)胞遺傳學(xué)對(duì)減數(shù)分裂時(shí)染色體行為的研究。真核生物在形成配子時(shí)，細(xì)胞染色體進(jìn)行一次復(fù)制，細(xì)胞核進(jìn)行兩次分裂，由此從雙倍體細(xì)胞產(chǎn)生單倍體細(xì)胞，故稱減數(shù)分裂。前期，參與聯(lián)會(huì)的同源染色體實(shí)際上已復(fù)制形成兩條姊妹染色體，從而出現(xiàn)有四條染色體構(gòu)成的四聯(lián)體。在四聯(lián)體的某些位置非姊妹染色單體之間可以發(fā)生交換。當(dāng)前第7頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)7同源重組機(jī)制—Holliday模型（1）兩個(gè)同源染色體DNA排列整齊（任意兩個(gè)同源DNA片斷可以發(fā)生重組，但同源雙鏈DNA分子必須緊密接觸，方能交換）。

ＡＢＣＡ′B′C′

a′b′c′abc1234

當(dāng)前第8頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)8（2）一個(gè)DNA的一條鏈斷裂、并與另一個(gè)DNA對(duì)應(yīng)的鏈連接5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′3′5′5′3′5′3′5′3′（3）通過(guò)分支移動(dòng)產(chǎn)生異源雙鏈DNA，形成Holliday中間體5′3′5′3′5′3′5′3′當(dāng)前第9頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)9片段重組體(patchrecombinant)拼接重組體(splicerecombinant)（4）Holliday中間體切開并修復(fù)，形成兩個(gè)雙鏈重組體DNA，分別為：當(dāng)前第10頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)105′3′5′5′5′3′3′3′DNA連接酶片段重組體5′5′5′5′3′3′3′3′內(nèi)切酶(ruvC)內(nèi)切酶(ruvC)5′3′5′5′5′3′3′3′拼接重組體5′5′5′5′3′3′3′3′5′3′5′5′5′3′3′3′DNA連接酶5′3′5′3′5′3′5′3′當(dāng)前第11頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)11片段重組體

（見模型圖右邊產(chǎn)物）：

切開的鏈與原來(lái)斷裂的是同一條鏈，重組體含有一段異源雙鏈區(qū)，其兩側(cè)來(lái)自同一親本DNA。拼接重組體（見模型圖左邊產(chǎn)物）：

切開的鏈并非原來(lái)斷裂的鏈，重組體異源雙鏈區(qū)的兩側(cè)來(lái)自不同親本DNA。

當(dāng)前第12頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)12當(dāng)前第13頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)13參與E.coli同源重組的主要酶RecA蛋白：結(jié)合單鏈DNA，形成的復(fù)合物，復(fù)合物可將同源雙螺旋中的互補(bǔ)順序“退火”，同時(shí)將另一條鏈排擠出去，形成所謂D環(huán)RecBCD：具有三種酶活性：①DNA解旋酶；②核酸外切酶；③單鏈內(nèi)切酶的活性。RuvC：特異的識(shí)別Holliday分支點(diǎn)，并改變DNA在Holliday分支點(diǎn)處的構(gòu)型，將兩條單鏈切斷，隨后由連接酶將切口連接.當(dāng)前第14頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)14

內(nèi)切酶(recBCD)DNA侵?jǐn)_(recA)分支遷移(recA)

內(nèi)切酶(recBCD)

DNA連接酶5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′3′3′5′3′5′3′3′5′5′3′5′3′5′3′Holiday中間體5′3′5′3′5′3′5′3′當(dāng)前第15頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)15Holiday中間體5′3′5′3′5′3′5′3′5′5′3′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′內(nèi)切酶(ruvC)內(nèi)切酶(ruvC)DNA連接酶DNA連接酶片段重組體拼接重組體當(dāng)前第16頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)16①不需要特異DNA序列，而是依賴兩個(gè)分子間序列的相同或相似性（同源性）；②同源雙鏈DNA分子必須緊密接觸，相對(duì)應(yīng)方才能交換（聯(lián)會(huì)）③重組時(shí)，兩個(gè)DNA片段必須有一個(gè)發(fā)生斷裂或有一段單鏈缺失（空隙）。同源重組特點(diǎn)：當(dāng)前第17頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)17二、細(xì)菌的基因轉(zhuǎn)移與重組有四種方式細(xì)菌可以通過(guò)多種途徑進(jìn)行細(xì)胞間基因轉(zhuǎn)移，并通過(guò)基因重組適應(yīng)隨時(shí)改變的環(huán)境。這種遺傳信息的流動(dòng)不僅發(fā)生在種內(nèi)，也發(fā)生在種間如果被轉(zhuǎn)移基因與內(nèi)在基因部分同源就可以發(fā)生同源重組當(dāng)前第18頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)18（一）接合作用當(dāng)細(xì)菌的細(xì)胞通過(guò)性菌毛相互接觸時(shí)，質(zhì)粒DNA從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至另一細(xì)胞的過(guò)程稱為接合作用(conjugation)。細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子?？勺灾鲝?fù)制供體細(xì)胞被定義為雄性受體細(xì)胞被定義為雌性當(dāng)前第19頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)19能夠促使DNA轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒稱為致育因子，F(xiàn)因子(Ffactor)與接合功能有關(guān)的蛋白質(zhì)（性菌毛等）均由F因子編碼。當(dāng)前第20頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)20當(dāng)前第21頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)21當(dāng)前第22頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)22F質(zhì)粒DNA可以通過(guò)重組整合到受體的染色體中，使受體菌成為高頻重組（Hrf)菌株若F質(zhì)粒的DNA未能完整地進(jìn)入受體菌，則受體菌不能轉(zhuǎn)化為F+F質(zhì)粒的DNA可以被切割出來(lái)，有時(shí)可攜帶宿主菌的染色體DNA，稱作F?因子，F(xiàn)?因子攜帶的基因可在受體菌表達(dá)。當(dāng)前第23頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)23（二）轉(zhuǎn)化作用通過(guò)自動(dòng)獲取或人為地供給外源DNA，使細(xì)菌獲得新的遺傳性狀的現(xiàn)象，稱為轉(zhuǎn)化作用(transformation)。當(dāng)前第24頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)24具有攝取周圍環(huán)境中游離DNA分子能力的細(xì)菌稱為感受態(tài)細(xì)胞很多細(xì)菌在自然條件下就有吸收外源DNA的能力（如固氮菌、鏈球菌等），雖然感受態(tài)經(jīng)常是瞬間的。當(dāng)前第25頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)25自然條件下感受態(tài)的形成需要10多種蛋白質(zhì)參與實(shí)驗(yàn)室：高濃度的Ca2+處理使細(xì)菌形成感受態(tài)當(dāng)前第26頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)26①.游離DNA與細(xì)胞表面DNA結(jié)合蛋白結(jié)合，②.其中一股鏈被核酸酶降解，另一股鏈被吸收當(dāng)前第27頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)27當(dāng)前第28頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)28（三）轉(zhuǎn)導(dǎo)作用當(dāng)病毒從被感染的（供體）細(xì)胞釋放出來(lái)、再次感染另一（受體）細(xì)胞時(shí)，發(fā)生在供體細(xì)胞與受體細(xì)胞之間的DNA轉(zhuǎn)移及基因重組即為轉(zhuǎn)導(dǎo)作用(transduction)。通過(guò)噬菌體（病毒）將細(xì)菌（細(xì)胞）基因從供體轉(zhuǎn)移到受體當(dāng)前第29頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)29λ噬菌體的生活史溶菌生長(zhǎng)途徑(lysispathway)溶源菌生長(zhǎng)途徑(lysogenicpathway)當(dāng)前第30頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)30

當(dāng)前第31頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)31轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程當(dāng)前第32頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)32（四）細(xì)胞融合細(xì)胞質(zhì)膜融合導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)移、重組實(shí)驗(yàn)室：溶菌酶除細(xì)菌細(xì)胞壁，人工促使原生質(zhì)體融合，引起廣泛的重組。當(dāng)前第33頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)33三、位點(diǎn)特異重組，即特異位點(diǎn)間發(fā)生的整合位點(diǎn)特異重組(site-specificrecombination)

是由整合酶催化，在兩個(gè)DNA序列的特異位點(diǎn)間發(fā)生的整合。原核生物中，有時(shí)基因重組依賴于小范圍的同源序列的聯(lián)會(huì)，重組只限于該小范圍內(nèi)，只涉及特定位點(diǎn)的同源區(qū)，這類重組稱作～當(dāng)前第34頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)34當(dāng)前第35頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)35λ噬菌體的整合酶識(shí)別噬菌體和宿主染色體的特異靶位點(diǎn)發(fā)生選擇性整合；反轉(zhuǎn)錄病毒整合酶可特異地識(shí)別、整合反轉(zhuǎn)錄病毒cDNA的長(zhǎng)末端重復(fù)序列(longterminalrepeat,LTR)。

（一）λ噬菌體DNA的整合當(dāng)前第36頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)36（二）細(xì)菌的特異位點(diǎn)重組如果一個(gè)DNA分子上兩個(gè)特異位點(diǎn)之間發(fā)生重組，其后果有兩種可能性：即兩個(gè)位點(diǎn)之間的節(jié)段或被丟失，或被顛倒。倘若基因重組發(fā)生在調(diào)節(jié)基因或基因調(diào)控區(qū)，就會(huì)影響某些基因的“開關(guān)”機(jī)制。有些生物能夠利用這種重組倒置來(lái)控制基因的表達(dá)。當(dāng)前第37頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)37①兩端各有一個(gè)14bp的反向重復(fù)序列（特異重組位點(diǎn)-hix），二者方向相反。②中間是hin基因，編碼特異的重組酶-倒位酶，催化H片段倒位重組。③hin基因兩端各有一個(gè)啟動(dòng)子（P)，其中一個(gè)啟動(dòng)子啟動(dòng)hin基因表達(dá)產(chǎn)生倒位酶，另一個(gè)啟動(dòng)子正向啟動(dòng)鄰近的H2和rH1基因表達(dá)，分別產(chǎn)生H2鞭毛蛋白和H1阻遏蛋白。阻抑蛋白可抑制遠(yuǎn)方H1基因的表達(dá)。因而結(jié)果是H2表達(dá)而H1不表達(dá)。H片段的組成和功能：當(dāng)前第38頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)38沙門菌H片段倒位決定鞭毛相轉(zhuǎn)變。當(dāng)前第39頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)39hix為反向重復(fù)序列，它們之間的H片段可在Hin控制下進(jìn)行特異位點(diǎn)重組(倒位)。H片段上有兩個(gè)啟動(dòng)子P，其一驅(qū)動(dòng)hin基因表達(dá)，另一正向時(shí)驅(qū)動(dòng)H2和rH1基因表達(dá)，反向(倒位)時(shí)H2和rH1不表達(dá)。rH1為H1的阻遏蛋白基因。當(dāng)前第40頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)40H2鞭毛素阻遏蛋白Hin轉(zhuǎn)位片段hinH2IH1

H1鞭毛素hinH2IDNA啟動(dòng)序列H1啟動(dòng)序列沙門菌H片段倒位決定鞭毛相轉(zhuǎn)變當(dāng)前第41頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)41四、轉(zhuǎn)座重組大多數(shù)基因在基因組內(nèi)的位置是固定的，但有些基因可以從一個(gè)位置移動(dòng)到另一位置。這些可移動(dòng)的DNA序列可以分為：插入序列和轉(zhuǎn)座子兩類。由插入序列和轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的基因移位或重排稱為轉(zhuǎn)座(transposition)。當(dāng)前第42頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)42轉(zhuǎn)座子中包含一些基因，這些基因可以使轉(zhuǎn)座子從原來(lái)的DNA鏈位置上斷裂開來(lái)，然后再插入到另外的DNA鏈位置上。當(dāng)插入到一個(gè)新的位置后，轉(zhuǎn)座子對(duì)附近基因的功能會(huì)造成一定的影響，在離開該位置時(shí)，它又有可能把一些附近的基因也一起帶走。轉(zhuǎn)座子的這種行為有點(diǎn)“唯我獨(dú)尊”，是基因的自私性的一種表現(xiàn)。當(dāng)前第43頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)43插入序列(insertionsequences,IS)組成：IRTransposaseGeneIR（一）插入序列轉(zhuǎn)座二個(gè)分離的反向重復(fù)(invertedrepeats,IR)序列一個(gè)轉(zhuǎn)座酶（transposase)編碼基因當(dāng)前第44頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)44插入序列發(fā)生轉(zhuǎn)座的形式：保守性轉(zhuǎn)座(conservativetransposition)復(fù)制性轉(zhuǎn)座(duplicativetransposition)當(dāng)插入序列轉(zhuǎn)座時(shí)，宿主靶部位雙鏈被交錯(cuò)切開，經(jīng)修復(fù)后形成短的正向重復(fù)靶序列通常是任意的但交錯(cuò)切開的長(zhǎng)度是固定的。當(dāng)前第45頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)45插入序列的復(fù)制性轉(zhuǎn)座當(dāng)前第46頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)46轉(zhuǎn)座子(transposons)—可從一個(gè)染色體位點(diǎn)轉(zhuǎn)移到另一位點(diǎn)的分散重復(fù)序列。IRIRTransposaseGene有用基因（二）轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座轉(zhuǎn)座子組成：

反向重復(fù)序列轉(zhuǎn)座酶編碼基因抗生素抗性等有用的基因當(dāng)前第47頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)47細(xì)菌的可流動(dòng)性元件A插入序列：轉(zhuǎn)座酶編碼基因兩側(cè)連接反向末端重復(fù)序列(箭頭所示)B轉(zhuǎn)座子Tn3：含有轉(zhuǎn)座酶、β-內(nèi)酰胺酶及阻遏蛋白編碼基因C轉(zhuǎn)座子Tn10：含四環(huán)素抗性基因及兩個(gè)相同的插入序列IS10L當(dāng)前第48頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)48由轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座當(dāng)前第49頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)49第二節(jié)

重組DNA技術(shù)

又稱DNA克隆或分子克隆DNARecombinationTechniqueisalsoCalledDNACloningorMolecularClone當(dāng)前第50頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)50重組DNA技術(shù)的發(fā)展史1865年G.J.Mendel的豌豆雜交試驗(yàn)。1944年O.T.Avery的肺炎球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。1973年美國(guó)斯坦福大學(xué)的科學(xué)家構(gòu)建第一個(gè)重組DNA分子。1977年美國(guó)南舊金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遺傳工程公司，專門應(yīng)用重組DNA技術(shù)制造醫(yī)學(xué)上重要的藥物。1980年開始建造第一家應(yīng)用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)胰島素的工廠。1997年英國(guó)羅林研究所成功的克隆了多莉。當(dāng)前第51頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)51一、重組DNA技術(shù)相關(guān)概念克隆(clone):來(lái)自同一始祖的相同副本或拷貝的集合。獲取同一拷貝的過(guò)程稱為克隆化(cloning)，即無(wú)性繁殖。（一）DNA克隆當(dāng)前第52頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)52技術(shù)水平：分子克隆(molecularclone)（即DNA克?。?/p>

細(xì)胞克隆個(gè)體克?。▌?dòng)物或植物）

當(dāng)前第53頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)53應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將各種來(lái)源的遺傳物質(zhì)（同源的或異源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）與載體DNA接合成一具有自我復(fù)制能力的DNA分子——復(fù)制子(replicon)，繼而通過(guò)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進(jìn)行擴(kuò)增提取獲得大量同一DNA分子，也稱基因克隆或重組DNA(recombinantDNA)

。

DNA克隆當(dāng)前第54頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)54生物技術(shù)工程:基因工程、蛋白質(zhì)工程、酶工程、細(xì)胞工程等目的：①分離獲得某一感興趣的基因或DNA②獲得感興趣基因的表達(dá)產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）基因工程(geneticengineering)

——實(shí)現(xiàn)基因克隆所用的方法及相關(guān)的工作稱基因工程，又稱重組DNA工藝學(xué)。當(dāng)前第55頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)55（二）工具酶

限制性核酸內(nèi)切酶DNA聚合酶Ⅰ逆轉(zhuǎn)錄酶T4DNA連接酶堿性磷酸酶末端轉(zhuǎn)移酶

TaqDNA聚合酶當(dāng)前第56頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)56重組DNA技術(shù)中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別特異序列，切割DNADNA連接酶催化DNA中相鄰的5′磷酸基和3′羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個(gè)DNA分子或片段連接DNA聚合酶Ⅰ合成雙鏈cDNA分子或片段連接缺口平移制作高比活探針DNA序列分析填補(bǔ)3′末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而無(wú)53外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA3末端標(biāo)記等反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA替代DNA聚合酶I進(jìn)行填補(bǔ)，標(biāo)記或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5′羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針末端轉(zhuǎn)移酶在3′羥基末端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基當(dāng)前第57頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)57限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease)

限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease,RE)是識(shí)別DNA的特異序列,并在識(shí)別位點(diǎn)或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ定義：當(dāng)前第58頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)58與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)，限制外源DNA，保護(hù)自身DNA。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技術(shù)中常用Ⅱ型）分類：作用：當(dāng)前第59頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)59Ⅱ類酶識(shí)別序列特點(diǎn)——

回文結(jié)構(gòu)(palindrome)

切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGG當(dāng)前第60頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)60BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口當(dāng)前第61頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)61來(lái)源不同的限制酶，但能識(shí)別和切割同一位點(diǎn)，這些酶稱同功異源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ同功異源酶：當(dāng)前第62頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)62有些限制性內(nèi)切酶雖然識(shí)別序列不完全相同，但切割DNA后，產(chǎn)生相同的粘性末端，稱為同尾酶。這兩個(gè)相同的粘性末端稱為配伍未端(compatibleend)。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAG

GATCTA同尾酶當(dāng)前第63頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)63名稱識(shí)別序列及切割位點(diǎn)名稱識(shí)別序列及切割點(diǎn)切割后產(chǎn)生５’突出末端:BamHⅠ5’…G▼GATCC...3’BglⅡ

5’…A▼GATCT...3’EcoRⅠ

5’…G▼AATTC...3’HindⅢ

5’…A▼AGCTT...3’HpaⅡ

5’…C▼CGG...3’MboⅠ

5’…▼GATC...3’NdeⅠ

5’…GA▼TATG...3’切割后產(chǎn)生3’突出末端:ApaⅠ

5’…GGGCC▼C...3’HaeⅡ

5’…PuGCGC▼Py...3’KpnⅠ

5’…GGTAC▼C...3’PstⅠ

5’…CTGCA▼G...3’SphⅠ

5’…GCATG▼C...3’切割后產(chǎn)生平末端:AluⅠ

5’…AG▼CT...3’EcoRⅤ

5’…GAT▼ATC...3’HaeⅢ

5’…GG▼CC...3’PvuⅡ

5’…CAG▼CTG...3’SmaⅠ

5’…CCC▼GGG...3’限制性內(nèi)切核酸酶當(dāng)前第64頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)64（三）目的基因(targetgene)cDNA(complementaryDNA)指經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成的、與RNA(通常指mRNA或病毒RNA)互補(bǔ)的單鏈DNA。以單鏈cDNA為模板、經(jīng)聚合反應(yīng)可合成雙鏈cDNA?；蚪MDNA(genomicDNA)指代表一個(gè)細(xì)胞或生物體整套遺傳信息(染色體及線粒體)的所有DNA序列。當(dāng)前第65頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)65（四）基因載體定義為攜帶目的基因，實(shí)現(xiàn)其無(wú)性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子。常用載體質(zhì)粒DNA噬菌體DNA病毒DNA當(dāng)前第66頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)66克隆載體(cloningvector)為使插入的外源DNA序列被擴(kuò)增而特意設(shè)計(jì)的載體稱為克隆載體。表達(dá)載體(expressionvector)為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽鏈而特意設(shè)計(jì)的載體稱為表達(dá)載體。當(dāng)前第67頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)67載體的選擇標(biāo)準(zhǔn)：能自主復(fù)制；具有兩個(gè)以上的遺傳標(biāo)記物，便于重組體的篩選和鑒定；有克隆位點(diǎn)（外源DNA插入點(diǎn)），常具有多個(gè)單一酶切位點(diǎn)，稱為多克隆位點(diǎn)；分子量小，以容納較大的外源DNA。當(dāng)前第68頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)68質(zhì)粒

(plasmid)特點(diǎn):能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立自主復(fù)制；帶有某些遺傳信息,會(huì)賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀。當(dāng)前第69頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)69當(dāng)前第70頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)70

λ噬菌體DNA改造系統(tǒng)

λgt系列（插入型，適用cDNA克?。〦MBL系列（置換型，適用基因組克?。┦删w(phage)

M13噬菌體DNA改造系統(tǒng)（含lacZ基因）M13mp系列pUC系列當(dāng)前第71頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)71當(dāng)前第72頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)72酵母人工染色體(yeastartificialchromosome,YAC)細(xì)菌人工染色體(bacterialartificialchromosome,BAC)動(dòng)物病毒DNA改造的載體（如腺病毒，腺病毒相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒）其他當(dāng)前第73頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)73二、重組DNA技術(shù)基本原理基本原理目的基因的獲取DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞外源基因與載體的連接克隆載體的選擇和構(gòu)建重組體的篩選克隆基因的表達(dá)

當(dāng)前第74頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)74以質(zhì)粒為載體的DNA克隆過(guò)程當(dāng)前第75頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)75（一）目的基因的獲取化學(xué)合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列。基因組DNA文庫(kù)(genomicDNAlibrary)cDNA文庫(kù)(cDNAlibrary)聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction,PCR)(見第22章)當(dāng)前第76頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)76化學(xué)合成法獲取目的基因由已知氨基酸序列推測(cè)可能的DNA序列。當(dāng)前第77頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)77組織或細(xì)胞染色體DNA基因片斷克隆載體重組DNA分子含重組分子的轉(zhuǎn)化菌限制性內(nèi)切酶受體菌基因組DNA文庫(kù)存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合從基因組DNA文庫(kù)獲取目的基因當(dāng)前第78頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)78限制酶切位點(diǎn)限制酶消化除去中間片段cosLRcoscosL左臂Rcos右臂真核生物染色體DNA限制酶部分消化外源DNA與載體DNA混合連接反應(yīng)體外包裝用重組噬菌體感染大腸桿菌~20KbDNA片段cosLRcos~20Kb外源DNA片段基因文庫(kù)用隨機(jī)切割的真核生物染色體DNA片段構(gòu)建基因文庫(kù)當(dāng)前第79頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)79mRNAcDNA

雙鏈cDNA重組DNA分子cDNA文庫(kù)

反轉(zhuǎn)錄酶載體受體菌復(fù)制從cDNA文庫(kù)獲取目的基因逆轉(zhuǎn)錄酶AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ堿水解

TTTT當(dāng)前第80頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)80（二）克隆載體的選擇和構(gòu)建目的不同，操作基因的性質(zhì)不同，載體的選擇和改建方法也不同。當(dāng)前第81頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)81（三）外源基因與載體的連接方式：(1)同一限制酶切位點(diǎn)連接(2)不同限制酶切位點(diǎn)連接配伍末端連接非配伍末端連接粘性末端連接當(dāng)前第82頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)82BamHⅠ切割反應(yīng)

GGATCCCCTAGGT4

DNA連接酶15oCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割載體DNA用BamHⅠ切割重組體載體自連目的基因自連同一限制酶切位點(diǎn)連接當(dāng)前第83頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)83不同限制酶切位點(diǎn)（非配伍末端）的連接EcoRⅠ切割位點(diǎn)BglⅡ切割位點(diǎn)+EcoRⅠ+BglⅡ雙酶切EcoRⅠ+BglⅡ雙酶切T4

DNA連接酶15oC重組體配伍末端的連接情況和同一限制酶切位點(diǎn)連接相似。當(dāng)前第84頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)84平端連接

限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端粘端補(bǔ)齊或切平形成的平端適用于：當(dāng)前第85頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)85目的基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4DNA連接酶15oC重組體載體自連目的基因自連當(dāng)前第86頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)86在末端轉(zhuǎn)移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進(jìn)行粘端連接。同聚物加尾連接當(dāng)前第87頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)875′3′3′5′載體DNA5′3′3′5′目的基因限制酶或機(jī)械剪切限制酶5′3′3′5′5′3′T(T)nT

T(T)nT3′5′5′

3′3′5′3′A(A)nA

A(A)nA3′5′λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端轉(zhuǎn)移酶+dATP末端轉(zhuǎn)移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA連接酶15oC重組體5′當(dāng)前第88頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)88由平端加上新的酶切位點(diǎn)，再用限制酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進(jìn)行粘端連接。

人工接頭(linker)連接當(dāng)前第89頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)89人工接頭及其應(yīng)用CCGAATTCGGGCTTAAGC5′-3′-EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ當(dāng)前第90頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)90受體菌條件：安全宿主菌限制酶和重組酶缺陷處于感受態(tài)(competent)

導(dǎo)入方式：轉(zhuǎn)化(transformation)轉(zhuǎn)染(transfection)感染(infection)（四）重組DNA導(dǎo)入受體菌當(dāng)前第91頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)911.直接選擇法(1)抗藥性標(biāo)記選擇(2)標(biāo)志補(bǔ)救(markerrescue)(3)分子雜交法原位雜交Southern印跡2.免疫學(xué)方法如免疫化學(xué)方法及酶免檢測(cè)分析等（五）重組體的篩選當(dāng)前第92頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)921.直接選擇法(1)抗藥性標(biāo)記選擇(2)標(biāo)志補(bǔ)救(markerrescue)(3)分子雜交法原位雜交Southern印跡2.免疫學(xué)方法如免疫化學(xué)方法及酶免檢測(cè)分析等（五）重組體的篩選當(dāng)前第93頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)93(插入失活法)抗藥性標(biāo)記選擇當(dāng)前第94頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)94α互補(bǔ)利用α互補(bǔ)原理篩選重組體pUC18當(dāng)前第95頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)95

原位雜交當(dāng)前第96頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)96

Southern印跡當(dāng)前第97頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)97雞的β肌球蛋白的克隆和檢出免疫學(xué)方法當(dāng)前第98頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)98重組DNA技術(shù)操作過(guò)程可形象歸納為：小結(jié)分分離目的基因切限制酶切目的基因與載體接拼接重組體

轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞篩篩選重組體

當(dāng)前第99頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)99熟悉蛋白質(zhì)的分子組成特點(diǎn)；氨基酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)、分類、三字符號(hào)及理化性質(zhì)；肽及多肽鏈的兩端；谷胱甘肽。掌握蛋白質(zhì)一至四級(jí)結(jié)構(gòu)的概念、要點(diǎn)、主要化學(xué)鍵及模體(motif)、結(jié)構(gòu)域(domain)、分子伴侶(chaperon)的概念。掌握蛋白質(zhì)重要的理化性質(zhì)。熟悉蛋白質(zhì)分離和純化的方法及其原理。當(dāng)前第100頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)100掌握核酸的分類、生物學(xué)功能、分子組成、化學(xué)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。掌握核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的概念及連接鍵。掌握DNA的堿基組成及Chargaff規(guī)則、DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)要點(diǎn)。熟悉DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)、核小體的組成。掌握RNA的分類、mRNA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、tRNA一級(jí)結(jié)構(gòu)及二級(jí)結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)、rRNA的功能。掌握DNA的變性、DNA的復(fù)性及分子雜交。當(dāng)前第101頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)101掌握酶的概念。熟悉酶的分子組成：全酶的組成、輔酶與輔基、金屬離子的作用、維生素構(gòu)成的輔酶與輔基。掌握酶活性中心的概念、活性中心的必須基團(tuán)。掌握酶促反應(yīng)的特點(diǎn)：高效性、特異性、可調(diào)節(jié)性。掌握影響酶的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)因素、米-曼氏方程式、Km與Vm的意義、酶的最適溫度、最適pH、可逆性抑制作用的概念、類型及其特點(diǎn)。熟悉不可逆性抑制作用的概念、類型及其特點(diǎn)。掌握酶原及酶原激活的概念、酶共價(jià)修飾的概念、同工酶的概念及特點(diǎn)。熟悉酶原激活的機(jī)理；酶的變構(gòu)調(diào)節(jié)；化學(xué)修飾調(diào)節(jié)的特點(diǎn)；乳酸脫氫酶同工酶的種類、分布、功能及臨床意義。當(dāng)前第102頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)102重組DNA技術(shù)操作的主要步驟載體質(zhì)粒噬菌體病毒目的基因（外源基因）基因組DNA

cDNA人工合成PCR產(chǎn)物限制酶消化開環(huán)載體DNA目的基因連接酶重組體轉(zhuǎn)化體外包裝，轉(zhuǎn)染帶重組體的宿主篩選表型篩選酶切電泳鑒定菌落原位雜交當(dāng)前第103頁(yè)\共有116頁(yè)\編于星期五\7點(diǎn)103表達(dá)體系的建立：表達(dá)載體的構(gòu)建受體細(xì)胞的建立表達(dá)產(chǎn)物的分離純化（