微生物實驗實驗一顯微鏡的使用及微生物形態(tài)觀察

微生物實驗實驗一顯微鏡的使用及微生物形態(tài)觀察第一頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期六實驗一顯微鏡的使用及微生物形態(tài)觀察

一.目的

1.了解普通光學顯微鏡的構造，學習顯微鏡的使用方法和保養(yǎng)。（高、低倍鏡的使用）

2.觀察藍細菌、霉菌、酵母菌、放線菌的個體形態(tài)，學會生物圖的繪制。二.實驗器材

1.光學顯微鏡

2.示范片：顫藻、曲霉、青霉、酵母菌、放線菌。第二頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期六三.實驗內容(一)顯微鏡的構造和使用方法1.構造機械部分:鏡筒(雙筒，兩筒間距離可調，上裝有目鏡）轉換器（3孔，裝有物鏡）載物臺（中央圓孔、彈簧夾、移動器）調節(jié)器（粗調、細調）鏡臂（支撐作用）鏡座（上有光源，亮度可調）光學部分：目鏡（10×、16×）物鏡（低倍鏡10×、高倍鏡40×、油鏡100×）聚光器（內有光圈調節(jié)）光源（光量可調）

第三頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期六

顯微鏡放大倍數=目鏡放大倍數×物鏡放大倍數

物鏡上的標識：

1.25(0.65、0.25)100(40、10）

160/0.17

↓↓↓↓

數值孔徑放大倍數鏡筒長蓋玻片厚度

數值孔徑：N.A.=n﹒sinα/2

n—玻片和物鏡之間的折射率。

α—光線最大射入角。

分辨率（最大可分辨距離）＝λ/N.A.

λ—波長

第四頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期六

2.顯微鏡的使用

低倍鏡的使用

（1）雙手取出顯微鏡置于實驗臺上，接上電源，打開開關，調節(jié)合適光量。

（2）轉動轉換器，將低倍鏡移至正下方。調節(jié)兩目鏡鏡筒間的距離。

（3）將載玻片放在載物臺上夾住，移動觀察對象于圓孔正中。

（4）側視物鏡，轉動粗調將載物臺上移，至載玻片距物鏡頭約５ｍｍ時停止。

（5）雙眼向目鏡里觀察，同時旋轉粗調節(jié)器使載物臺緩慢下移，若標本顯出但不清晰，可用細調節(jié)器調至清晰。若粗調旋轉太快，超過焦點沒有看到標本，則必須重復（4）、(5)步驟。不能在眼睛觀察目鏡的同時旋轉粗調，以防物鏡與載玻片相碰撞，造成損壞。

第五頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期六

高倍鏡的使用

在用低倍鏡找到觀察目標后，若需要進一步放大觀察，將其移到視野中央。用轉換器將高倍鏡移到鏡筒下方，將光量調大一點。若標本不清晰，用細調上下轉動使之清晰。（此時不再動粗調）

３．顯微鏡的維護

（１）將載物臺降至最低，取下標本片。

（２）將光量調至最小，關上電源。

（３）用鏡頭紙先檫目鏡、物鏡，再擦顯微鏡其它部分。

（４）將顯微鏡放入鏡箱，還原。第六頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期六（二）微生物形態(tài)的觀察

1.

用低倍鏡和高倍鏡觀察顫藻、曲霉、青霉、酵母菌、放線菌、星藻示范片。

2.

畫出微生物形態(tài)圖，并標明顯微鏡的放大倍數。10╳10

顫藻第七頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期六實驗二活性污泥生物相的觀察

一.目的

1.學習測量微生物大小。

2.學習用壓滴法制作標本片。

3.觀察幾種原、后生動物，菌膠團及藻類個體形態(tài)。

二.實驗器材

1.活性污泥混合液。

2.單胞藻、新月藻、草履蟲等示范片。

3.顯微鏡、載玻片、蓋玻片。

4.目測微尺、物測微尺。第八頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期六

三.實驗內容1.微生物大小的測定(1)標定目鏡測微尺裝在目鏡上的目測微尺中央刻有等分為100格或更多格的標尺，使用前要用物測微尺標定。物測微尺中央刻有1mm長的標尺，等分為100格，10μm／格。將物測微尺的刻度朝上放在載物臺上，用低倍鏡找出物測微尺的刻度，移動物測微尺使其第一條線與目測微尺的第一條線重合，順著刻度線找出另一條重合線。算出低倍鏡下目測微尺每格的長度。換高倍鏡用同樣方法標定出高倍鏡下目測微尺每格的長度。第九頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期六測微尺示意圖(2)微生物大小的測量

將物測微尺取下，換上標本片，選擇適當物鏡測量微生物的長度和寬度占目測微尺的格數，再按目測微尺1格的長度算出微生物的長度和寬度。第十頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期六

2.壓滴法觀察活性污泥中生物相

（1）壓滴法制作標本片用滴管取活性污泥混合液一小滴，放在載玻片中央。取一塊蓋玻片先將一邊與混合液接觸，然后慢慢將蓋玻片放下使其蓋在混合液上。片內不能有氣泡。（2）觀察活性污泥中生物相先用低倍鏡觀察活性污泥中菌膠團、原生動物、后生動物。畫出所觀察到的生物形態(tài)圖。標明名稱、放大倍數和微生物的大小。第十一頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期六

四.實驗結果

1.低、高倍鏡下目測微尺每格的長度。

2.畫出2~3種污泥中所觀察到的生物形態(tài)圖。標明名稱、放大倍數和微生物的大小。

3.畫出兩種藻類生物形態(tài)圖，標明名稱、放大倍數和微生物的大小。。3.觀察幾種藻類的個體形態(tài)觀察幾種藻類的個體形態(tài)，畫出生物形態(tài)圖，標明名稱、放大倍數。第十二頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期六實驗三微生物的染色

一.目的

1.學習微生物的染色技術，掌握微生物的單染色法和革蘭氏染色法。

2.學習油鏡的操作。第十三頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期六二．染色原理和油鏡的工作原理1．油鏡工作原理

油鏡的放大倍數最大（100），故鏡頭焦距短，直徑小,但所需光照強度卻最大。從標本片透過的光線是從玻片進入空氣，再進入鏡頭。由于玻璃和空氣的介質密度不同，有些光會因折射或反射而不能進入鏡頭。物象就顯現(xiàn)不清。為了不使通過的光線有所損失，須在油鏡與玻片之間加入折射率和玻璃

(n=1.52）相仿的香柏油

(n=1.515)。故而稱之為“油鏡”。第十四頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期六

2．單染色法：微生物不但個體微小，且無色半透明。要在顯微鏡下觀察清楚，必須染上顏色。微生物細胞中含有大量的蛋白質等一類兩性電解質：在酸性溶液中結合質子帶正電；在堿性溶液中給出質子而帶負電。等電點一般在pH=2~5。所以，在中性、堿性或弱酸性溶液中，微生物細胞通常帶負電荷。堿性染料在電離時，染色部分是帶正電荷的，容易與帶負電荷的菌體結合使之著色。經染色后的菌體細胞與背景形成鮮明的對比，在顯微鏡下很容易觀察。第十五頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期六

3．革蘭氏染色法：

革蘭氏染色法將細菌分為G＋和G-

，這由兩類細菌細胞壁的結構和組成的不同而決定。用結晶紫初染后，所有的細菌都染上藍紫色。碘作為媒染劑能與結晶紫結合形成結晶紫-碘的復合物，增強了染料與菌體的結合力。用乙醇脫色處理時，兩類細菌的脫色效果是不同的。G＋細菌的細胞壁主要由肽聚糖形成的網狀結構組成，且壁厚、類脂含量低，用乙醇脫色時使細胞壁脫水、網狀結構孔徑縮小，通透性降低，使得結晶紫—碘的復合物不易被洗脫而保留在細胞內。雖經洗脫和復染仍然保持初染劑的藍紫色。G-細菌則不同，由于其細胞壁肽聚糖層較薄，類脂含量高，所以在脫色處理時，類脂被乙醇溶解，細胞壁的通透性增大，使結晶紫—碘的復合物比較容易被洗脫出來，用復染劑復染后，細胞被染上復染劑的顏色。第十六頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期六

三．實驗器材

1．顯微鏡、香柏油、接種環(huán)、酒精燈等。

2．結晶紫染液、碘液、95%乙醇、沙黃染液。

3．菌種：大腸桿菌、枯草芽孢桿菌。第十七頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期六四．實驗內容

(一)單染色

1．涂片取一塊載玻片，用記號筆劃分出兩區(qū)域并做上記號，在兩區(qū)域中央各滴半滴無菌水，用接種環(huán)以無菌操作法分別取兩種菌種在左右兩滴水中，和勻后涂成薄膜。

2．干燥室溫自然干燥或吹干。

3．固定涂面朝上，通過火焰2~3次。

4．染色在涂片薄膜上滴加結晶紫染液，使之覆蓋2分鐘。

5．水洗傾倒去染液，斜置載玻片，用洗瓶小水流沿玻片邊緣沖洗，直至水呈無色為止。

6．干燥室溫自然干燥或用吸水紙吸干。第十八頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期六

(二)革蘭氏染色

完成單染色的1~6步驟后

7.媒染加媒染劑碘液使之覆蓋1分鐘，水洗，吸水紙吸干。

8.脫色滴加95%乙醇數滴使之覆蓋16秒鐘，立即水洗,吸干。

9.復染用沙黃（番紅）液復染2分鐘，水洗，吸干。

第十九頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期六(二)鏡檢

先分別用低倍鏡和高倍鏡找到要觀察的樣品區(qū)域后，用轉換器將物鏡轉到空擋，在樣品區(qū)域滴加香柏油，再將油鏡慢慢轉到工作位置浸入油中。若不清晰，慢慢轉動微調直至清楚。油鏡用完后，用鏡頭紙沾取乙醇-乙醚混合液檫拭油鏡頭。再用干的鏡頭紙檫干鏡頭。第二十頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期六

五．實驗結果

觀察兩種細菌的形態(tài)和顏色，繪出油鏡下細菌形態(tài)圖，說明革蘭氏染色的結果。

六．思考題

通過實驗，你認為革蘭氏染色成功關鍵是那一步？為了避免假陽性或假陰性出現(xiàn)，在對未知菌種做革蘭氏染色鑒定時，你認為應該怎樣做？第二十一頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期六實驗四微生物的計數

（顯微鏡直接計數法）

一．目的

1.了解血球計數板的計數原理，掌握血球計數板的計數方法。

2.觀察酵母菌的形態(tài)，學習區(qū)分酵母菌死活細胞的方法。二.實驗器材

顯微鏡、血球計數板、酵母菌液、美藍染液、蓋玻片。

第二十二頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期六

三．原理

1.血球計數板計數原理血球計數板是一塊特制的載玻片，有四條豎槽和一條橫槽。橫槽兩邊的平臺上各有一個有九個大方格的方格網，中間大方格為計數室：邊長為１ｍｍ，深為0.1mm，容積為0.1mm3(10-4ml)。計數室有兩種規(guī)格：一是分為16個中方格，每中方格中有25個小方格；另一種是分為25個中方格，每中方格有16個小方格。兩種都共有400個小方格。第二十三頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期六

計數：

數出5個中方格中的總菌數A，若菌液的稀釋倍數為B，則計算公式如下：

(1)25個中方格的計數板計算公式

(2)16個中方格的計數板計算公式第二十四頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期六

2.區(qū)分酵母菌死活細胞基本原理美藍是一種無毒性的染料，它的氧化型呈藍色，還原型是無色。用美藍對酵母菌的活細胞進行染色時，由于細胞的新陳代謝作用，細胞內具有較強的還原能力，能使美藍由藍色的氧化型變成無色的還原型。因此，具有還原能力的酵母活細胞是無色的或淡藍色，而死細胞或代謝作用的衰老細胞則呈藍色，借此即可對酵母菌的死細胞和活細胞進行鑒別。第二十五頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期六

四.實驗內容

1.酵母菌的形態(tài)觀察及死活細胞的鑒別

(1)在載玻片上加半滴美藍染液，在染液上滴一滴菌液。取一塊蓋玻片，先將一邊與菌液接觸，然后慢慢將蓋玻片放下蓋在菌液上。

(2)將標本片放3分鐘后，先用低倍鏡然后用高倍鏡觀察酵母菌的形態(tài)和出芽情況，并根據顏色來區(qū)別死活細胞。

第二十六頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期六

2.酵母菌液的計數

(1)鏡檢計數室對計數板進行鏡檢。若有污物，則用自來水沖洗，用電吹風吹干后才能進行計數。

(2)加樣品

在血球計數板上蓋上蓋玻片,用滴管將搖勻的酵母菌液由蓋玻片邊的小槽滴一小滴,菌液會自動進入計數室，靜置5分鐘。

(3)計數將血球計數板置于載物臺上，先用低倍鏡找到計數室的位置，再換高倍鏡計數。每計數室計5個中格（四角和中間）。計數原則：計上不計下，計左不計右。芽體占母細胞一半時算一個。

(4)清洗血球計數板

計數后將血球計數板用自來水沖洗干凈，勿用硬物刷，吹干后鏡檢。若不干凈，則必須重復洗滌干凈為止。第二十七頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期六

五.結果記錄

1.2.酵母菌死活細胞的比例？六.思考題用此法計數的結果是活菌體還是死、活菌體的總和？第二十八頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期六實驗五活性污泥不同微生物種群的分離培養(yǎng)與鑒別

一.目的

1．掌握配制培養(yǎng)基和制備無菌水的方法。

2.學會玻璃器皿的干熱滅菌和培養(yǎng)基高壓蒸汽滅菌技術。

3.學習倒平板的方法和兩種分離微生物的基本操作技術。

4.學習微生物純種分離、培養(yǎng)及菌落的觀察。第二十九頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期六

二.實驗器材1.培養(yǎng)皿、試管、吸管、錐形瓶等。

2.牛皮紙等包扎材料。

3.10%HCl、10%NaOH、精密pH試紙。

4.牛肉膏、蛋白胨、NaCl、瓊脂。

5.高壓蒸汽滅菌鍋等。

6.活性污泥。

7．接種環(huán)、酒精燈、恒溫箱(培養(yǎng)箱)等。

8．結晶紫染液。

9.顯微鏡、載玻片第三十頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期六

三.實驗內容

（一）培養(yǎng)基的制備及滅菌1.玻璃器皿的包扎與滅菌（1）六套培養(yǎng)皿一組,用報紙包裝。（2）取四支吸量管，在其吸端塞少許棉花后用長報紙條包扎。（3）干熱滅菌:上述玻璃器皿在160°C烘箱內2小時。

2.無菌水的制備在3支試管中各裝入9ml自來水，塞上硅膠塞,同下述培養(yǎng)基一起用高壓蒸汽滅菌。第三十一頁，共三十三頁