淺論入肝門靜脈動脈化加門腔分流術(shù)對大鼠肝臟再生的影響

淺論入肝門靜脈動脈化加門腔分流術(shù)對大鼠肝臟再生的影響【摘要】【目的】在大鼠70%肝部分切除基礎(chǔ)上建立入肝門靜脈動脈化加門腔分流術(shù)的模型，并研究大鼠肝臟再生情況。【方法】155只Sprague-Dawley大鼠分為3組。實(shí)驗(yàn)組大鼠65只，利用右腎動脈行入肝門靜脈動脈化，并行門腔分流及肝部分切除，肝切組大鼠65只，僅進(jìn)行肝部分切除，對照組大鼠25只，僅右腎切除。分別觀察實(shí)驗(yàn)組及肝切組術(shù)后2、7、14及28d殘肝再生比率變化，以及3組在術(shù)中0h、術(shù)后24、48、72h及7d各時相點(diǎn)殘肝肝臟S期細(xì)胞比例及增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)陽性表達(dá)的肝細(xì)胞比例情況?！窘Y(jié)果】術(shù)后2、7、14d兩組肝臟再生比率相比，實(shí)驗(yàn)組較肝切組明顯增高，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P);至術(shù)后28d，實(shí)驗(yàn)組及肝切組肝臟再生比率趨平，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P)。術(shù)后各時相點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組及肝切組殘肝S期肝細(xì)胞比例及PCNA陽性表達(dá)肝細(xì)胞比例均較對照組明顯升高，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P)。實(shí)驗(yàn)組與肝切組相比，術(shù)后24h殘肝S期細(xì)胞比例及PCNA陽性細(xì)胞比例均已經(jīng)開始升高，至術(shù)后48、72h及術(shù)后7d，實(shí)驗(yàn)組仍明顯高于肝切組，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P)?！窘Y(jié)論】入肝門靜脈動脈化重建入肝血流對大鼠肝細(xì)胞的增生及增殖有促進(jìn)作用，是預(yù)防肝部分切除術(shù)后急性肝功能衰竭的有效方法。

【關(guān)鍵詞】門靜脈動脈化;肝切除術(shù);再生;增殖細(xì)胞核抗原

Abstract：【Objective】Extendedhepatectomymayresultinacutepostoperativeliverfailure，theaimofthisstudywastoassesstheeffectsofportalveinarterialization(PVA)associatedwithportocavalshunt(PCS)onliverregenerationafter70%partialhepatectomy(PH)inaratmodel.【Methods】Onehundredandfifty-fiveSpragueDawleyratswereassignedtothreegroups：PVAassociatedwithPCSafter70%PH(experimentalgroup);70%PHonly(PHgroup);rightnephrectomy(controlgroup).Liverregenerationrate(LRR)wasassessedondays2，7，14，and28aftersurgery，proliferatingcellnuclearantigen(PCNA)labelingindex，andSphaselivercellratewereassessedon0h，24h，48h，72h，and7daysaftersurgery，respectively.【Results】Ratswith70%PHfollowingPVA+PCSshowedsignificantlygreaterlivergrowththanratswith70%PHonlyinthefirst14dayspostoperatively(P).However，nosignificantdifferencewasfound28daysaftersurgerybetweenthesetwogroups.TheratswithPVA+PCSshowedthehighestvaluesofPCNAlabelingindexandSphaselivercellrateswithin7days，andhigherthantheothertwonon-PVAgroupssignificantly(P).【Conclusions】ThepresentfindingsindicatethatPVAtechniquebringbeneficialeffectsonmaintainingliverregenerationafterextendedpartialhepatectomyinrats.

門靜脈動脈化最初應(yīng)用于肝硬化門靜脈高壓癥門體分流術(shù)后預(yù)防肝功能衰竭和肝性腦病的發(fā)生[1]，以及用于進(jìn)展期肝膽惡性腫瘤行擴(kuò)大肝部分或肝門部根治性整塊切除后預(yù)防急性肝功能衰竭，近年來

實(shí)驗(yàn)動物及分組

雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠共155只，體質(zhì)量250～300g，分3組：實(shí)驗(yàn)組65只，行右腎切除，利用右腎動脈行入肝門靜脈動脈化，門腔完全分流，再按Higgins方法行70%部分肝(肝左葉+中葉)切除;肝切除組65只，行右腎切除+70%部分肝(肝左葉+中葉)切除;對照組25只，僅行右腎切除。

入肝門靜脈動脈化模型建立

所有大鼠術(shù)前均禁食24h，不禁水，口罩吸入乙醚麻醉。取腹部正中切口進(jìn)腹，在手術(shù)顯微鏡下，游離門靜脈上至門靜脈入肝左右分支處，下至脾靜脈與腸系膜上靜脈匯合處。游離右腎動脈、右腎靜脈和右輸尿管，右腎動脈由腹主動脈開口處游離至腎動脈分叉以遠(yuǎn)3mm，并結(jié)扎切斷由腎動脈發(fā)出的腎上腺動脈。右腎靜脈由下腔靜脈游離至腎門，游離輸尿管并結(jié)扎切斷。在距腹主動脈5mm處阻斷右腎動脈，于右腎動脈分叉以遠(yuǎn)2mm處切斷右腎動脈，于右腎靜脈匯入下腔靜脈處阻斷右腎靜脈，距血管夾以遠(yuǎn)2mm處橫斷右腎靜脈，切除右腎。肝素生理鹽水反復(fù)沖洗各游離的血管腔。將右腎動脈從下腔靜脈后方拉至其左前方，并將動脈分叉部用顯微組織剪剖開并修剪成魚口狀備用，長徑約3～4mm，橫徑約2mm。在門靜脈主干分支處和脾靜脈與腸系膜上靜脈匯合處分別用無損傷血管夾阻斷，在兩血管夾中下三分之一處橫斷門靜脈。修剪各斷端血管外膜，以備吻合。

在10～16倍雙人雙目手術(shù)顯微鏡輔助下，用10-0帶針無創(chuàng)尼龍縫線將入肝門靜脈主干與右腎動脈橢圓形剖面兩定點(diǎn)連續(xù)端端吻合，縫合完畢后依次松開入肝門靜脈主干與右腎動脈血管夾，成功將入肝門靜脈動脈化(阻斷時間8～12min)。之后用10-0帶針無創(chuàng)尼龍縫線將右腎靜脈與遠(yuǎn)端門靜脈主干(脾靜脈與腸系膜上靜脈匯合處)兩定點(diǎn)連續(xù)端端吻合，完畢后松開阻斷血管夾，完成門腔完全分流(阻斷時間在10～12min)。以雙鑷法證實(shí)吻合口通暢并檢查有無漏血，若有漏血，可間斷補(bǔ)針。肝部分切除參照Higgins大鼠肝部分切除方法，切除大鼠肝臟的左葉和中葉，切除量占全肝70%。術(shù)畢經(jīng)大鼠尾靜脈注射1mL生理鹽水，可翻身飲水，1d后正常飲食，單籠飼養(yǎng)。

指標(biāo)測定

肝臟再生比率的測定

預(yù)實(shí)驗(yàn)時取10只正常大鼠稱體質(zhì)量為(261±31)g，切除全肝稱濕質(zhì)量，為(±)g，再將肝臟切除左外葉、左內(nèi)葉及中葉稱濕質(zhì)量，為(±)g。得出肝切除部分濕質(zhì)量占全肝的(±)%，同時求得全肝濕質(zhì)量占體質(zhì)量的(±)%。手術(shù)制模前大鼠稱質(zhì)量，根據(jù)全肝/體質(zhì)量比例算出全肝理論質(zhì)量，手術(shù)后稱取切除之部分肝臟濕質(zhì)量，實(shí)驗(yàn)組及肝切組分別在術(shù)后2、7、14、28d取10只大鼠處死后取殘肝標(biāo)本并稱取肝濕質(zhì)量。根據(jù)公式計算肝再生比率：肝再生率(%)=[mC-(mA-mB)]/(mA-mB)×100%，其中mA為大鼠理論全肝質(zhì)量，mB為切除肝質(zhì)量，mC為處死大鼠取標(biāo)本時的殘余肝質(zhì)量。

再生肝S期肝細(xì)胞比例

3組各取5只大鼠分別于術(shù)中取1cm3大小肝組織，術(shù)后6、24、48、72h和7d處死后于殘余肝上取部分組織以g/L膠原酶消化，制作單細(xì)胞懸液，供流式細(xì)胞術(shù)FCM檢測。使用FACSCalibur型流式細(xì)胞儀(美國BectonDickinson公司)，用碘化丙啶(PI)定量DNA熒光染色法(美國BDCycletestTMPlusDNAReagentKit)，雞紅細(xì)胞做標(biāo)準(zhǔn)樣品，調(diào)整儀器的CV值在5%以內(nèi)，激光功率為200W，激發(fā)光波長488nm，濾光片波長620nm，測定細(xì)胞熒光信號。每份樣品檢測20000個細(xì)胞，計數(shù)活細(xì)胞總數(shù)，S期(DNA合成期)肝細(xì)胞數(shù)，求出每例樣本S期肝細(xì)胞百分比例=S期肝細(xì)胞/活細(xì)胞總數(shù)×100%。

肝細(xì)胞PCNA免疫組化檢測

3組同樣分別于術(shù)中取1cm3大小肝組織，術(shù)后6、24、48、72h和7d處死時留取肝臟標(biāo)本，均中性甲醛溶液固定、石蠟包埋。連續(xù)切片，厚4μm。切片常規(guī)脫蠟后蒸餾水沖洗5min;用300mL/L過氧化氫孵育30min以抑制內(nèi)源性過氧化物酶;用10mL/L正常小牛血清孵育20min封閉內(nèi)源性過氧化酶;加一抗(美國Dako公司，PCNAPC10MAb)稀釋液(1∶50)4℃濕盒內(nèi)室溫孵育過夜，PBS沖洗3次×5min;加生物素標(biāo)記的二抗(福州邁新公司，KIT-0100M，UltraSensitiveS-PMouse)室溫孵育30min;加ABC復(fù)合物室溫作用30min，PBS徹底沖洗;DAB顯色液(福州邁新，DAB-2031加強(qiáng)型DABPlusKit)染色2～10min，蘇木素輕度復(fù)染;系列酒精脫水，二甲苯透明;樹膠封片觀察。由兩名病理醫(yī)師雙盲法分別觀察免疫組織化學(xué)染色結(jié)果，在高倍鏡下(10×40)隨機(jī)觀察4個視野共1000個細(xì)胞，核內(nèi)有棕黃色顆粒沉積者為陽性細(xì)胞，取其兩人計數(shù)結(jié)果的平均值，用百分率表示PCNA陽性率。計算方法：PCNA陽性表達(dá)細(xì)胞比例=陽性細(xì)胞數(shù)/觀察的細(xì)胞總數(shù)×100%。

統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS版軟件，數(shù)據(jù)以x±s表示，兩組間計量資料統(tǒng)計采用t檢驗(yàn)，3組間均數(shù)比較先行單因素方差分析后再行LSD-t(leastsignificantdifference-t)檢驗(yàn)，取?琢=。

2結(jié)果

殘肝再生率變化

實(shí)驗(yàn)組及肝切組術(shù)后肝臟再生率均呈上升趨勢，術(shù)后2d至術(shù)后14d，實(shí)驗(yàn)組肝再生率與對照組相比明顯升高，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P)。至術(shù)后28d，實(shí)驗(yàn)組及肝切組肝臟再生率趨平，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P，表1)。

殘肝S期肝細(xì)胞比例變化

各組術(shù)后S期肝細(xì)胞比例的變化(表2)。從表中可以看出實(shí)驗(yàn)組及肝切組S期肝細(xì)胞比例的變化，其高峰出現(xiàn)在術(shù)后24～72h，以后逐漸下降，但到7d時仍明顯高于本組0時相點(diǎn)的水平(P)，說明肝細(xì)胞的再生主要發(fā)生在術(shù)后一周。特別是在術(shù)后3d以內(nèi)，是肝細(xì)胞再生的關(guān)鍵時期。三組在術(shù)后各個時相點(diǎn)總體均數(shù)存在統(tǒng)計學(xué)差異(F=，P)。其中實(shí)驗(yàn)組與肝切除組相比，在術(shù)后各時相點(diǎn)均有明顯升高，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P)。與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組與肝切組術(shù)后各時相點(diǎn)S期肝細(xì)胞含量均明顯升高，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P)。

PCNA陽性表達(dá)細(xì)胞比例變化

對照組PCNA表達(dá)陽性細(xì)胞比例在3%左右。實(shí)驗(yàn)組及肝切組術(shù)后24h陽性細(xì)胞比例已經(jīng)明顯增高，至72h達(dá)到高峰，此后逐漸下降，但仍明顯高于本組0時相點(diǎn)水平，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P)，表明術(shù)后1周細(xì)胞仍持續(xù)增殖。兩組術(shù)后各時間點(diǎn)與對照組相比，PCNA陽性細(xì)胞比例均明顯升高，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P)，而實(shí)驗(yàn)組PCNA陽性細(xì)胞比例與肝切組比較，從術(shù)后24h至術(shù)后7d，各時間點(diǎn)相比較，實(shí)驗(yàn)組均明顯高于肝切組，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P，表3;圖1)。

3討論

肝臟作為體內(nèi)血流最豐富的器官，有肝動脈及門靜脈雙重血供，約75%的血液供應(yīng)來自乏氧的門靜脈。以往一直認(rèn)為，門靜脈血中的肝臟營養(yǎng)因子對肝細(xì)胞的再生及增殖是必不可少的，但早在1952年，Cohn等就最早提出用動脈血代替門脈血灌注肝臟的設(shè)想，隨后的動物實(shí)驗(yàn)證明，以適當(dāng)壓力和流量的動脈血灌注肝臟，可使分流后的動物維持正常肝血流量，促使肝細(xì)胞再生，保證正常肝臟的解毒功能。張紅衛(wèi)等在肝硬化大鼠行部分門靜脈結(jié)扎后發(fā)現(xiàn)，非結(jié)扎的相應(yīng)肝葉代償增生，可提高Ⅱ期肝切除手術(shù)的范圍。近年來的動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，在擴(kuò)大部分肝切除的模型中，采用門靜脈動脈化的技術(shù)增加肝臟氧供及血流，能有效促進(jìn)肝細(xì)胞的增生。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦表明，在完全門腔分流后行入肝門靜脈動脈化，肝臟雖然沒有靜脈血的灌注，但充分的動脈血供能有效促進(jìn)肝細(xì)胞再生，尤其是在術(shù)后1周內(nèi)，肝細(xì)胞再生相關(guān)指標(biāo)如S期肝細(xì)胞比例及肝細(xì)胞PCNA表達(dá)的比例均較單純肝切除者明顯升高，與國外部分學(xué)者研究結(jié)果相符。

陳永亮等[9-10]研究表明肝臟部分切除后不論是在正常或梗阻性黃疸后再通的大鼠還是在同時行門靜脈動脈化的大鼠，術(shù)后肝質(zhì)量的測定、有絲分裂期肝細(xì)胞的計數(shù)和流式細(xì)胞儀對各期DNA含量的檢測均表明肝細(xì)胞再生非常明顯而且比較相似，說明門靜脈血的供應(yīng)對肝臟的再生并不是必須的，門靜脈動脈化后不影響肝臟的再生。王鵬等[11]利用胃十二指腸動脈與門靜脈行端側(cè)吻合術(shù)加肝左外葉切除犬只模型研究門靜脈動脈化對肝硬化犬肝切除后肝再生結(jié)果表明，PCNA表達(dá)增強(qiáng)，門靜脈動脈化對肝細(xì)胞的再生有促進(jìn)作用。Fan等用部分肝切除大鼠模型研究門靜脈動脈化后肝臟再生情況的結(jié)果表明，充足的肝血流量是肝再生的前提因素，在門靜脈血流量相同的情況下，無論是靜脈血還是動脈血均能保證肝臟的正常再生能力。而我們的殘肝再生率的研究結(jié)果亦表明，在術(shù)后28d內(nèi)，相對單純肝切除，附加入肝門靜脈化能顯著提高殘肝的增生及肝臟重量，這對于擴(kuò)大的部分肝切除術(shù)后預(yù)防和減少術(shù)后早期發(fā)生急性肝功能衰竭有著重要意義。

門靜脈動脈化主要機(jī)制是通過動脈血強(qiáng)化灌注門靜脈，增加門靜脈的壓力和改善肝臟缺血、缺氧。肝細(xì)胞主要由線粒體的呼吸鏈供能，其作用約消耗肝臟90%的供氧，而肝細(xì)胞再生的啟動有賴于白細(xì)胞介素-6及腫瘤壞死因子-?琢等因子表達(dá)增加[12]。因此，穩(wěn)定的氧供對肝臟能量代謝非常重要。在門靜脈動脈化后，富含氧供和高流量血供對肝臟的灌注能有效促進(jìn)肝細(xì)胞再生及增殖，另一方面，結(jié)合完全性的門腔分流，有效避免了門靜脈屬支壓力升高而引起的消化道靜脈曲張出血。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，門靜脈動脈化對肝臟再生具有促進(jìn)作用。

【參考文獻(xiàn)】

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陳永亮，黃志強(qiáng)，周寧新，等.門靜脈動脈