實(shí)驗(yàn)植物的組織培養(yǎng)

快速繁殖植物組織培養(yǎng)技術(shù)有何意義？當(dāng)前第1頁\共有30頁\編于星期三\22點(diǎn)

我國用花藥培養(yǎng)法先后培育出優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)作物、糧食和蔬菜等新品種，廣泛應(yīng)用于果樹和花卉的快速繁殖。借助于組織培養(yǎng)生產(chǎn)人工種子，解決某些作物品種繁殖力差、結(jié)子困難或發(fā)芽率低等問題。當(dāng)前第2頁\共有30頁\編于星期三\22點(diǎn)

生產(chǎn)藥物、食品添加劑、香料、色素和殺蟲劑等。例如：紫杉醇，生物堿、紫草素等。轉(zhuǎn)基因植物的培育植物去病毒當(dāng)前第3頁\共有30頁\編于星期三\22點(diǎn)實(shí)驗(yàn)：菊花的組織培養(yǎng)當(dāng)前第4頁\共有30頁\編于星期三\22點(diǎn)當(dāng)前第5頁\共有30頁\編于星期三\22點(diǎn)當(dāng)前第6頁\共有30頁\編于星期三\22點(diǎn)（用于配置發(fā)芽和生根培養(yǎng)基）當(dāng)前第7頁\共有30頁\編于星期三\22點(diǎn)當(dāng)前第8頁\共有30頁\編于星期三\22點(diǎn)當(dāng)前第9頁\共有30頁\編于星期三\22點(diǎn)當(dāng)前第10頁\共有30頁\編于星期三\22點(diǎn)植物組織培養(yǎng)用的培養(yǎng)基，含有植物生長發(fā)育所需要的各種營養(yǎng)物質(zhì)，這些營養(yǎng)物質(zhì)同樣為細(xì)菌等微小的生物提供了適合的營養(yǎng)。在這種培養(yǎng)基上，細(xì)菌等微小的生物比植物細(xì)胞具有更強(qiáng)的新陳代謝能力，它們比植物細(xì)胞生長、繁殖得更快，而且它們會產(chǎn)生毒素，使培養(yǎng)的植物細(xì)胞很快中毒死亡。因此，植物組織培養(yǎng)要想取得成功，必須有效地防止細(xì)菌等的污染，保證培養(yǎng)材料、培養(yǎng)基、培養(yǎng)用具完全無菌。為了達(dá)到這一要求，就要在植物組織培養(yǎng)過程中進(jìn)行一系列的消毒、滅菌，并且要求無菌操作。當(dāng)前第11頁\共有30頁\編于星期三\22點(diǎn)實(shí)驗(yàn)材料用具培養(yǎng)瓶、鑷子、超凈臺、滅菌鍋、封口膜和橡皮圈、有棉球的廣口瓶、酒精燈、三角漏斗、培養(yǎng)皿MS培養(yǎng)基萘乙酸、芐基腺嘌呤發(fā)芽培養(yǎng)基生根培養(yǎng)基當(dāng)前第12頁\共有30頁\編于星期三\22點(diǎn)制備MS固體培養(yǎng)基外植體消毒

接種

生芽定植五、實(shí)驗(yàn)過程

移栽鍛煉

生根注意：對培養(yǎng)材料進(jìn)行表面滅菌時(shí)，一方面要考慮藥劑的消毒效果；另一方面還要考慮植物材料的耐受能力。不同藥劑、不同植物材料，甚至不同器官要區(qū)別對待。當(dāng)前第13頁\共有30頁\編于星期三\22點(diǎn)（一）制備MS固體培養(yǎng)基1、配制母液

按照MS培養(yǎng)基成分表,分別配制培養(yǎng)基的母液。

(1)大量元素母液(10倍液)

分別稱取10倍用量的各種大量無機(jī)鹽，依次溶解于大約800ml熱的（60-80℃）蒸餾水中。（一種成分完全溶解后再加入下一種，最后加水，定容至1000ml后裝入試劑瓶中，冰箱內(nèi)貯存?zhèn)溆茫?2)微量元素母液(100倍液)(3)鐵鹽母液（100倍液）(4)有機(jī)成分母液(100倍數(shù))(5)生長素母液(6)細(xì)胞分裂素母液注意:配制培養(yǎng)基時(shí)，一定要注意調(diào)節(jié)pH。當(dāng)前第14頁\共有30頁\編于星期三\22點(diǎn)MS培養(yǎng)基配制方法返回當(dāng)前第15頁\共有30頁\編于星期三\22點(diǎn)你能說出各種營養(yǎng)物質(zhì)的作用嗎？同微生物培養(yǎng)基的配方相比，MS培養(yǎng)基的配方有哪些明顯的不同？問題思考微量元素和大量元素提供植物細(xì)胞生活所必需的無機(jī)鹽；蔗糖提供碳源，同時(shí)能夠維持細(xì)胞的滲透壓；甘氨酸、維生素等物質(zhì)主要是為了滿足離體植物細(xì)胞在正常代謝途徑受到一定影響后所產(chǎn)生的特殊營養(yǎng)需求。

微生物培養(yǎng)基以有機(jī)營養(yǎng)為主。與微生物的培養(yǎng)不同，MS培養(yǎng)基則需提供大量無機(jī)營養(yǎng)，無機(jī)鹽混合物包括植物生長必須的大量元素和微量元素兩大類。當(dāng)前第16頁\共有30頁\編于星期三\22點(diǎn)

（1）把裝好的培養(yǎng)基的三角瓶放入高壓滅菌鍋中，蓋好鍋蓋。

（2）設(shè)置滅菌溫度參數(shù)為121℃，20min，開始滅菌。

2、滅菌無菌技術(shù)是植物組織培養(yǎng)能否獲得成功的關(guān)鍵．

當(dāng)前第17頁\共有30頁\編于星期三\22點(diǎn)（二）外植體（離體組織）消毒

注意：對培養(yǎng)材料進(jìn)行表面滅菌時(shí)，一方面要考慮藥劑的消毒效果；另一方面還要考慮植物材料的耐受能力。不同藥劑、不同植物材料，甚至不同器官要區(qū)別對待。

1、70﹪酒精中浸泡10min，無菌水沖洗2、5%次氯酸鈉溶液中浸泡，無菌水沖洗3、用另一5%次氯酸鈉溶液浸泡5min，無菌水沖洗4、超凈臺中用無菌水多次沖洗當(dāng)前第18頁\共有30頁\編于星期三\22點(diǎn)（三）切段后接種

1、先用肥皂洗手，穿上工作服，戴上口罩和工作帽。2、放入培養(yǎng)瓶和滅菌后的接種用具(鑷子、解剖刀、接種針)，把鑷子、解剖刀、接種針插入內(nèi)盛70%酒精的廣口瓶中。當(dāng)前第19頁\共有30頁\編于星期三\22點(diǎn)

3、在酒精燈火焰旁，打開三角瓶，把花莖用無菌解剖刀切成幾段，每段至少有一張葉片

4、切段插入培養(yǎng)基，誘導(dǎo)愈傷組織，蓋上封口膜。

5、愈傷組織插入生芽培養(yǎng)基，蓋上封口膜。6、用記號筆在瓶壁上寫明培養(yǎng)材料、培養(yǎng)基代號、接種日期。注意事項(xiàng)

全部接種操作都是在無菌條件下進(jìn)行的，所以要特別認(rèn)真仔細(xì)，以防雜菌污染。當(dāng)前第20頁\共有30頁\編于星期三\22點(diǎn)（四）培養(yǎng)接種后的錐形瓶最好放在無菌箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)期間應(yīng)定期消毒，溫度控制在１８～２5℃，并且每日照光１4.5小時(shí)。觀察記錄生長情況，并照相存檔。2-3周后將生長健壯的叢狀苗在無菌條件下一個(gè)個(gè)轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，在上述條件下繼續(xù)培養(yǎng)當(dāng)前第21頁\共有30頁\編于星期三\22點(diǎn)（五）移栽（六）栽培生根后，將苗移至消毒的草炭土或蛭石中，用玻璃罩或塑料布保持80%以上濕度，2-3天后打開玻璃罩低濕度鍛煉轉(zhuǎn)移至土中培養(yǎng)（定植）當(dāng)前第22頁\共有30頁\編于星期三\22點(diǎn)此時(shí)的組織或細(xì)胞為離體的，即細(xì)胞所生活的環(huán)境為液體有機(jī)物營養(yǎng)環(huán)境，而不是能體現(xiàn)其整個(gè)植物體的光能自養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，是脫分化、再分化的過程，隨著芽和根的形成，就具有了自養(yǎng)的能力，是由細(xì)胞到一個(gè)個(gè)體的演變過程。1、高等植物是光能自養(yǎng)型生物，為什么在植物組織培養(yǎng)過程中還需要提供有機(jī)物培養(yǎng)基？2、培養(yǎng)過程中為什么需要進(jìn)行光照?思考？當(dāng)前第23頁\共有30頁\編于星期三\22點(diǎn)1、培養(yǎng)基的滅菌（高壓蒸汽滅菌）2、外植體的消毒（酒精、氯化汞）3、接種的無菌操作（酒精、酒精燈——灼燒）4、無菌箱中的培養(yǎng)；5、移栽到消過毒的環(huán)境中生存一段時(shí)間。3、在整個(gè)操作過程中，是如何來實(shí)現(xiàn)無菌環(huán)境的？當(dāng)前第24頁\共有30頁\編于星期三\22點(diǎn)結(jié)果分析與評價(jià)（一）對接種操作中污染情況的分析（二）是否完成了對植物組織的脫分化和再分化（三）是否進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)、對照與記錄（四）生根苗的移栽是否合格當(dāng)前第25頁\共有30頁\編于星期三\22點(diǎn)六、結(jié)果分析與評價(jià)

（一）對接種操作中污染情況的分析

接種3～4d后，在接種操作中被雜菌污染的培養(yǎng)物會表現(xiàn)出被污染的現(xiàn)象。請學(xué)生適時(shí)統(tǒng)計(jì)污染率，分析接種操作是否符合無菌要求。當(dāng)前第26頁\共有30頁\編于星期三\22點(diǎn)（二）是否完成了對植物組織的脫分化和再分化觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，看看是否培養(yǎng)出了愈傷組織，記錄多長時(shí)間長出愈傷組織。統(tǒng)計(jì)更換培養(yǎng)基后愈傷組織進(jìn)一步分化成根和芽的比例和時(shí)間。（三）是否進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)、對照與記錄做好統(tǒng)計(jì)和對照，填好結(jié)果記錄表，培養(yǎng)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)態(tài)度。從實(shí)驗(yàn)的第一步開始就要求做好實(shí)驗(yàn)記錄，實(shí)驗(yàn)小組配制不同培養(yǎng)基，如誘導(dǎo)愈傷或直接分化叢芽的培養(yǎng)基，然后做不同配方的比較。當(dāng)前第27頁\共有30頁\編于星期三\22點(diǎn)（四）生根苗的移栽是否合格生根苗移栽技術(shù)的關(guān)鍵是既要充分清洗根系表面的培養(yǎng)基，又不能傷及根系。一般使用無土栽培的辦法。培養(yǎng)基質(zhì)要提前消毒，可以向培養(yǎng)基質(zhì)噴灑質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的高錳酸鉀，并用塑料薄膜覆蓋12h。掀開塑料薄膜后24h才能移栽。新移栽的組培苗要在溫室過渡幾天，等壯苗后再定植大田或進(jìn)行盆栽。學(xué)生可以在課后統(tǒng)計(jì)自己移栽的成活率，看看移栽是否合格。當(dāng)前第28頁\共有30頁\編于星期三\22點(diǎn)1、不同植物、不同組織的生根和生芽是否都可以使用與本實(shí)驗(yàn)相同的生長素和細(xì)胞分裂素濃度2、本實(shí)驗(yàn)用人工合成的激素，而不用植物中存在的天然激素，為什么？

任何植物物種或品種都不可貿(mào)然使用與本實(shí)驗(yàn)相同的生長素和細(xì)胞分裂素濃度，必須要套索使用如何合成激素和何種激素濃度才可以。學(xué)習(xí)者可以參考已有文獻(xiàn)上成熟的經(jīng)驗(yàn)，也可以自己探索植物中存在的天然激素有相應(yīng)的使之分解的酶，這樣，天然激素在植物體內(nèi)作用和存在的時(shí)間就較短，而人工合成的激素在植物中沒有相應(yīng)使之分解的酶，所以作用和存在時(shí)間長，作用效果也更明顯。課后練習(xí)當(dāng)前第29頁\共有30頁\編于星期三\