心肌細(xì)胞腫脹激活氯離子通道的單通道特性

心肌細(xì)胞腫脹激活氯離子通道的單通道特性【摘要】目的：研究急性分離小鼠心肌細(xì)胞腫脹激活氯離子通道的單通道特征.方法：采用膜片鉗單通道方法，記錄急性分離的小鼠心肌細(xì)胞暴露于低滲溶液時(shí)出現(xiàn)的腫脹激活氯通道電流().結(jié)果：等滲狀態(tài)下，用細(xì)胞貼附式記錄，多數(shù)心肌細(xì)胞膜片無(wú)通道活動(dòng)，用低滲溶液灌流細(xì)胞，在細(xì)胞容積增大的同時(shí)，出現(xiàn)單通道電流的激活.該腫脹激活單通道氯電壓在-100mV~+100mV均有激活.在電壓+100mV時(shí)，其單通道電導(dǎo)為(±)pS，開(kāi)放概率為±，電流電壓曲線顯示其反轉(zhuǎn)電位(-±)mV,接近氯離子平衡電位的理論值(ECl=-mV),且反轉(zhuǎn)電位隨氯離子濃度的改變而改變.氯通道阻斷劑DIDS可逆性阻斷該單通道電流.結(jié)論：小鼠心肌細(xì)胞腫脹激活氯通道的單通道電導(dǎo)為(±)pS，電流呈外向整流特征并對(duì)DIDS敏感.

【關(guān)鍵詞】心肌/細(xì)胞學(xué)；腫脹激活氯離子通道；膜片鉗術(shù)

0引言

調(diào)節(jié)性細(xì)胞容積減小指的是細(xì)胞暴露于低滲透壓環(huán)境時(shí)，細(xì)胞膨脹、容積增大激活了細(xì)胞的容積調(diào)節(jié)功能，導(dǎo)致胞內(nèi)的溶質(zhì)及水份外流，使已膨脹的細(xì)胞容積向正常容積轉(zhuǎn)化的過(guò)程.在心肌細(xì)胞，RVD功能的異常是缺血再灌注損傷、心力衰竭、心肌肥厚等多種心臟疾病過(guò)程中細(xì)胞凋亡與壞死以及心律失常發(fā)生的關(guān)鍵.因此，闡明心肌細(xì)胞RVD過(guò)程的機(jī)制，了解參與心肌細(xì)胞容積調(diào)節(jié)的離子通道特性和分子定位，具有重要的生理學(xué)與病理生理學(xué)意義.關(guān)于小鼠心肌細(xì)胞上腫脹激活的氯通道的單通道特性目前尚無(wú)報(bào)道.我們?cè)诩毙苑蛛x的小鼠心肌細(xì)胞上，應(yīng)用膜片鉗細(xì)胞貼附式和內(nèi)面向外式方法觀察了低滲溶液激活的氯通道的單通道特性.

1材料和方法

材料

5~7周齡的成年雌性C157小鼠.實(shí)驗(yàn)中所用藥品和試劑除EGTA購(gòu)自日本W(wǎng)ako公司外，Hepes,Nifidipine,TEACl,4,4diisothiocyanostilbene2,2disulfonicacid和tetrodotoxin等均購(gòu)自Sigma公司.

方法

單個(gè)小鼠心肌細(xì)胞的分離實(shí)驗(yàn)用小鼠，ip注射肝素抗凝，20min后，10g/L戊巴比妥鈉麻醉.打開(kāi)胸腔，迅速取出心臟，放在冰分離液中，主動(dòng)脈插管Langendorff裝置進(jìn)行灌流.用灌流液沖洗心臟3~5min后，改用含有g(shù)/L膠原酶和1g/LBSA的灌流液灌注8~15min，最后用冰灌流液沖洗殘酶約7min.將心臟剪碎,分離單個(gè)心肌細(xì)胞置于保存液，吹打過(guò)濾后，4℃保存待用.灌流過(guò)程中，液體溫度保持37℃，所有液體用純氧飽和.灌流液(mmol/L)：NaCl,KCl4,NaH2PO4,MgSO4,Hepes10,葡萄糖11(用NaOH調(diào)pH至).

電生理學(xué)實(shí)驗(yàn)取分離好的單個(gè)心肌細(xì)胞置于灌流槽中，灌流無(wú)鈣臺(tái)氏液.待細(xì)胞穩(wěn)定貼壁后，灌流等滲細(xì)胞外液，形成巨阻封接，室溫下采用膜片鉗單通道細(xì)胞貼附式和內(nèi)面向外式方法［1］記錄腫脹激活單通道氯電流.電極采用硼硅酸玻璃管經(jīng)電極拉制器(P2000:SutterInstruments,Novato,CA)多步拉制而成.沖灌電極液后電阻為5~6MΩ.電流經(jīng)EPC9放大器(HEKAElectroniks,Lambrecht,德國(guó))放大后，電流信號(hào)采樣頻率為10kHz，經(jīng)濾波后，記錄到Pulse和Pulsefit軟件系統(tǒng)中(HEKAElectroniks,Lambrecht,德國(guó)).數(shù)據(jù)分析應(yīng)用PulseMate和Origin(OriginLabInc.,Northampton,MA)軟件.

電生理學(xué)實(shí)驗(yàn)所用液體：電極內(nèi)液:NMDGCl85,NaCl10,4AP2,BaCl2,NaH2PO4,MgCl24,Hepes10,glucose,TEACl5,TTX8μmol/L,nifidipine5μmol/L,,加入甘露醇調(diào)節(jié)溶液的滲透壓為305Osmmol/kg.低滲灌流液:NMDGCl113,MgATP5,NaGTP,EGTA5,Hepes5,滲透壓為230Osmmol/kg.在研究氯離子通道選擇性的實(shí)驗(yàn)中，灌流液中等量的Cl-由天冬氨酸代替.為驗(yàn)證腫脹激活單通道氯電流對(duì)氯通道阻斷劑DIDS的敏感性，用含有500mol/LDIDS的低滲灌流液灌流細(xì)胞，觀察其對(duì)單通道開(kāi)放概率的抑制作用.等滲灌流液是在低滲溶液中加入甘露醇調(diào)節(jié)滲透壓到305Osmmol/kg.實(shí)驗(yàn)過(guò)程中灌流液中持續(xù)加入8μmol/LTTX，5μmol/Lnifidipine以阻斷電壓依賴(lài)性Na+通道和LtypeCa2+通道.所有溶液的滲透壓應(yīng)用冰點(diǎn)滲透壓測(cè)量?jī)x(OM802,Vogel,德國(guó))測(cè)量.阻斷劑DIDS用二甲基亞砜配置50mmol/L的儲(chǔ)存液保存，使用時(shí)稀釋到500μmol/L灌流細(xì)胞.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包完成，所有數(shù)據(jù)以x±s表示.用阻斷劑前后的比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，即認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.

2結(jié)果

小鼠心肌細(xì)胞腫脹激活單通道氯電流的電壓依賴(lài)性在等滲狀態(tài)下，多數(shù)小鼠心肌細(xì)胞膜片無(wú)通道活動(dòng).低滲溶液(230Osmmol/kg)灌流細(xì)胞，15～30min后，細(xì)胞容積增大，同時(shí)，有些在等滲條件下無(wú)通道活動(dòng)的膜片出現(xiàn)單通道電流的激活，通道激活的時(shí)間一般是在低滲溶液灌流后的(13±4)min.一旦單通道電流出現(xiàn)，就將該膜片游離形成內(nèi)面向外式記錄方式.Fig1A所示的即為在等滲時(shí)無(wú)電流活動(dòng)，用低滲溶液灌流后出現(xiàn)通道活動(dòng)的一個(gè)膜片記錄結(jié)果.可見(jiàn)，在細(xì)胞內(nèi)外氯離子濃度對(duì)稱(chēng)時(shí)，在電壓-100mV~+100mV范圍內(nèi)，均有通道開(kāi)放，且能穩(wěn)定20min以上，在+100mV和-100mV鉗制電壓時(shí)，電流的幅度分別為(±)pA和pA,(n=11)，表現(xiàn)出明顯的外向整流特征.Fig1B為單通道電流的電流/電壓曲線.當(dāng)?shù)蜐B灌流液中氯離子的濃度由113mmol/L改為25mmol/L時(shí)，電流的反轉(zhuǎn)電位向更負(fù)的方向偏移，由0mV偏移到了對(duì)電流的開(kāi)放產(chǎn)生明顯抑制作用，約3min達(dá)到最大作用，此時(shí)單通道開(kāi)放時(shí)間明顯縮短，而關(guān)閉時(shí)間延長(zhǎng)(Fig3).在+100mV，通道的開(kāi)放概率由±降低為±.DIDS的阻斷作用是可逆的，沖洗后阻斷作用消失.

3討論

Nilius等［2］首先在內(nèi)皮細(xì)胞記錄到了低滲激活的氯通道電流，發(fā)現(xiàn)該電流可明顯減輕細(xì)胞在低滲狀態(tài)下水腫的程度.到目前為止，腫脹激活氯通道已被證實(shí)廣泛分布在多種哺乳動(dòng)物的細(xì)胞膜上［3］.在犬和兔的心房肌細(xì)胞和竇房結(jié)細(xì)胞［4-6］、豚鼠心室肌細(xì)胞，培養(yǎng)的雞心肌細(xì)胞［7,8］和人心房肌細(xì)胞［9,10］上均證實(shí)了的表達(dá)，且的全細(xì)胞電流具有共同的電生理學(xué)特點(diǎn):對(duì)氯離子的高度選擇性;外向整流特性;在去極化電壓下的時(shí)間依賴(lài)性失活等.而關(guān)于該通道的單通道特性報(bào)道較少.尤其在小鼠心肌細(xì)胞未見(jiàn)報(bào)道.我們應(yīng)用膜片鉗單通道記錄方法，探討了小鼠心肌細(xì)胞腫脹激活氯電流的單通道特性，證實(shí)該通道能夠被低滲溶液激活，單通道電導(dǎo)約為38pS，可逆性被DIDS阻斷，這與Duan等［11］報(bào)道的兔心房肌細(xì)胞容積敏感性氯通道的單通道特性相似.但小鼠心肌細(xì)胞腫脹激活氯通道對(duì)DIDS敏感性低于兔心房肌細(xì)胞，其機(jī)制有待進(jìn)一步探討.

研究心肌細(xì)胞的，不僅有助于明確生理狀態(tài)下細(xì)胞的容積調(diào)節(jié)機(jī)制，而且很有可能成為臨床治療的新的切入點(diǎn).因?yàn)樗粌H參與細(xì)胞的容積調(diào)節(jié)，而且與心肌缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用和細(xì)胞凋亡有關(guān).在心肌缺血時(shí)，由于局部代謝障礙，心肌細(xì)胞腫脹，此時(shí)激活，在一定程度上有利于保護(hù)心肌細(xì)胞，避免細(xì)胞由于過(guò)度腫脹而導(dǎo)致心肌細(xì)胞壞死.

【參考文獻(xiàn)】

［1］HamilOP,MartyAJ,NeherE,etal.Improvedpatchclamptechniquesforhighresolutioncurrentrecordingfromcellsandcellfreemembranepatches［J］.PflugersArch,1992;422:143-150.

［2］NiliusB,EggermontJ,VoetsT,etal.Propertiesofvolumeregulatedanionchannelsinmammaliancells［J］.ProgBiophysMolBiol,1997;68:69-119.

［3］TsengGN.Cellswellingincreasemembraneconductanceofcaninecardiaccells:Evidenceforavolumesensitiveanionchannels［J］.AmJPhysiol,1992;262:C1056-C1068.

［4］SorotaS.Swellinginducedchloridesensitivecurrentincanineatrialcellsrevealedbywholecellpatchclampmethod［J］.CircRes,1992;70:679-687.

［5］OkadaY.Volumeexpansionsensingoutwardrectifier,Cl-channel:Freshstarttothemolecularidentityandvolumesensor［J］.AmJPhysiol,1997;273:C755-C789.

［6］HagiwaraN,MasudaG,IrisawaH.Stretchactivatedanioncurrentsofrabbitcardiacmyocytes［J］.JPhysiol,1992;456:285-302.

［7］VandenbergJ,YoshidaA,KirkK,etal.Swellingactivatedandisoprenalineactivatedchloridecurrentsinguineapigcardiacmyocyteshavedistinctelectrophysiologyandpharmacology［J］.JGenPhysiol,1994;104:997-1017.

［8］,FerminiB,NattelS.AlphaadrenergiccontrolofvolumeregulatedCl-currentsinrabbitatrialmocytes［J］.CircRes,1995;77:379-393.

［9］OzMC,SorotaS.Forskolinstimulatesswellinginducedchloridecurrent,notcardiaccysticfibrosistransmembraneconductanceregulatorcurrent,inhumancardiacmyocytes［J］.CircRes,1995;76:1063-1070.