真菌多糖的化學結構

真菌多糖的化學結構可分為一級、二級、三級、四級結構。真菌多糖的一級結構主鏈主要有兩種：一種是葡聚糖，以6-1,3糖苷鍵連接為主，兼有少量6-1,4或6-1，6糖苷鍵，如自然界中的茯苓多糖、云芝多糖等的分子結構；另一種是甘露聚糖，主要由a-糖苷鍵連接，如：冬蟲夏草多糖是a-1，2糖苷鍵連接，銀耳多糖和黑木耳多糖是a-1，3糖苷鍵連接。真菌多糖的二級結構是指多糖骨架鏈間以氫鍵結合形成的各種聚合體，只與分子主鏈的構象有關，不涉及側鏈的空間排布形式。真菌多糖的三級結構是指由多糖中糖殘基中的官能團間通過非共價作用而導致的有序、規(guī)則而粗大的空間構象。四級結構是指多糖多聚鏈間以非共價作用力而結合形成的聚集體。多糖的結構單位可以是直鏈，也可以有支鏈：直鏈一般以a-1，4-和6-1，4-苷鍵連接，分支鏈中常以a-1，6-苷鍵連接。1真菌多糖結構研究方法的進展經過分離純化的多糖在測定結構前需檢查其純度并確定相對分子質量。目前檢查其純度和確定相對分子質量最常用的方法是高效凝膠液相色譜法（HPGPC），即高效體積排阻色譜法（HPSEC），采用示差折射檢測儀（RI）直接檢測，如為對稱的單峰，說明其均一性良好。需要注意的是，有些樣品在水溶液中測定會出現不止一個峰，有可能是聚合所致，此時可換用二甲亞砜（DMSO）作溶劑，會變成一個峰。體積排阻色譜一示差折射檢測儀（SEC-RI）測定多糖的相對分子質量，需用一系列已知相對分子質量的標準多糖做標準曲線，通過測定樣品的洗脫體積，與標準曲線對比，得到相應的相對分子質量。目前最先進的檢測儀是小角激光散射儀（LLS），可以不用標準品而方便地測定多糖的相對分子質量及其分布，還可得到分子鏈的構象信息。近些年來，體積排阻色譜-小角激光散射儀（SEC-LLS）結合諸如紫外（UV）、折光指數（DRI）檢測器對于高度分散的聚合體系統(tǒng)的特征分析，被證明是一種非常好的有效的方法。組成多糖的單糖品種繁多，單糖的連接順序、連接位置的不同以及可能有的側鏈使多糖結構更具復雜性，其結構鑒定也更困難。目前常用的多糖結構分析方法主要分為3大類，即化學分析法、物理分析法和生物學分析法。包括酸水解、高碘酸氧化、Smith降解、甲基化分析等在內的化學分析法仍然是多糖結構分析常用的方法。物理方法主要包括紫外（UV）、紅外（IR）、質譜（MS）和核磁共振（NMR）。生物學方法主要是酶學方法，即利用各種特異性糖苷酶水解多糖分子得到寡糖片斷，通過分析寡糖片斷的結構來推測多糖的結構。近些年來，各種軟電離技術如快速原子轟擊電離質譜（FAB-MS）、液態(tài)二次離子質譜（LSI-MS）、電噴霧質譜（ESI-MS）、基質輔助激光解吸電離質譜（MALDI-MS）的出現使糖的分析有了很大的進展，可獲得提供相對分子質量信息的分子離子峰和提供化合物結構信息的碎片峰。二維NMR技術（2D-NMR）如COSY、TOCSY、ROESY、HMQC、HMBC等的迅猛發(fā)展，為多糖的結構解析提供了有力的工具。由于多糖中大部分氫化學環(huán)境相似，氫信號相互重疊嚴重，造成解析的困難。H，H-COSY譜揭示質子與質子間的自旋偶合關系，包括質子間孿生、鄰位和遠程偶合相關。通過糖上質子間的偶合關系，可從容易辨認的質子（如異頭質子或甲基質子）開始，尋找糖上其他碳位的質子。Laroeque等從Bordetellaavium中得到一個0-多糖，采用二維CO-SY，使每個質子的信號得到確認。TOCSY是分子內氫偶合鏈的接力相干信息，如果偶合常數較大，其信息會象接力賽一樣沿著碳鏈傳遞，中止于偶合常數小的部位，不同的單糖殘基有不同的偶合特征，根據TOCSY的特征可以判斷糖殘基的類型。如Proteusmirabilis040的脂多糖經緩和酸水解后，分離到一個0-多糖，建立在偶合常數J、J、J的基礎上，從其COSY和TOCSY譜中鑒定了1個半乳糖和2,3 3,4 4,52個乙酞氨基葡萄糖的自旋系統(tǒng)，并從偶合常數J判斷出單糖的構型。1,2NOESY與ROESY譜提供了糖環(huán)質子的殘基內的和殘基間的NOE相關，糖殘基內的NOE相關不僅能夠提供有關糖殘基相對立體化學的信息，并且可為歸屬殘基內采用CO-SY和TOCSY譜未能歸屬的質子信號提供有用的信息，而殘基間的NOE相關可為測定糖殘基的連接順序和糖基化位點提供關鍵性的信息。從Bordetellacerium中得到的0-多糖，單糖殘基內（％H4）和（H3，H5）強的NOE效應證實了葡萄糖殘基的存在，（H「H3）和（虬，H「強的NOE效^表明，其為6-構型，而（虬，H「NOE相關峰的出現為1，，4-糖苷鍵的特征。Mondal等從食用蘑菇Termitomyceseurhizus的子實體中得到2個多糖PS-I和PSTI，通過NOESY實驗確定了單糖殘基間的連接順序。Providenciastuartii044中得到的O-多糖，其ROESY揭示了各個殘基間的相關，a-FucH-1，a-GlcH-3在5.27/378；a-GlcH-1，a-QuiH-4在5.03/326；a-QuiH-1，a-G1cNAcH-3在5.01/388；a-G1cNAcH-1，a-Ga1NAcH4在84.86/4.02；a-GaINACH-1，a-FucH-3在65.24/4.05；p-G1cAH-1，a-FucH-4在04.55/411，證實了重復單元中單糖殘基間的連接順序和連接位置。Lemercini-er等主要利用2D-NMR（DQFCOSY,TOCSY,ROESY,HSQC）確定了從Streptococcuspneumoniae中得到的一個復雜多糖的結構。從Proteusvulgaris045中得到0-多糖，通過HSQC與HMBC實驗，結合其他二維譜，確認了組成多糖的各個單糖的自旋系統(tǒng)。2近年來研究報道的真菌多糖的結構到目前為止，從真菌里分離出來的多糖有幾十種，分聚糖、雜多糖、蛋白糖和肽糖，糖的種類與真菌種屬間無明顯的相關性。由于研究糖類方法的復雜性與技術的局限性，目前分離得到的多糖純品實際上為糖鏈長短不一的混合物，結構分析多局限于一級結構，高級結構的研究比較少。2.1聚糖近年來研究報道的真菌聚糖中，以葡聚糖居多。Bao等從Ganodermalucidum孢子中分得一葡聚糖，重均相對分子質量（M）為1.0X104，主鏈為（1一3）-P-D-葡聚糖，在主鏈的C-6位有一個、兩個和幾個葡萄糖取代，通過甲基化分析、Smith降解、1D和2D-NMR、ESI-MS確定了其復雜的結構。Mondal等從食用蘑菇Termitomyceseurhizus的子實體中得到2個多糖PS-I和PSTI，均為a-葡聚糖，其中PS-I結構主鏈由（1一6）-a-D-葡萄糖和（1一3）-a-D-葡萄糖組成，比例為2.5:1，無分枝；PS-II則為（1-.6）-a-D-葡聚糖。Wu等從Cordycepssinensis中得到的葡聚糖，主鏈為（1一4）-a-D-葡萄糖，并有微量的（1一6）-a-D-葡萄糖側鏈。葡聚糖A62-2N,來源于食用真菌巴西蘑菇Agaricusblazei,主鏈為（1一6）-p-D-葡聚糖，每3個葡萄糖殘基中在C-3位有1個側鏈取代，側鏈包括1個末端的葡萄糖和1個C-3位取代的a-D-葡萄糖殘基。來源于真菌Botryosphaeriasp細胞外液的胞外多糖botryosphaeran，主鏈為（1一3）-P-D-葡聚糖，每5個葡萄糖殘基中在C-3位有1個側鏈取代，側鏈由單個的（1一6）-P連接的葡萄糖基和（1一6）-p連接的龍膽二糖殘基組成。從Phytophthoraparasitica中得到的幾個胞外葡聚糖，M從1.0X104?5.0X106不等，均有一個（1一3）-P-D-葡聚糖主鏈，分別有一個、兩個、幾個糖鏈通過（1一6）連接取代。海產絲狀真菌Phomaherbarum多糖YCP為a-（1—4）連接的葡萄糖主鏈，側鏈通過（1一6）連接取代oCordycepssinensis多糖為（1一3）-p-D-葡聚糖。張麗萍等從金頂側耳（Pleu-rotuscitrinopileatus）子實體中分離的多糖Pc-4,Mw為1.89X104,可能的結構是主鏈為a-（1—3）連接的葡聚糖，支鏈為P-（1一6）連接的葡聚糖。黑石耳（Dermatocarponminiatum）子實體多糖為a-（1—4）、（1一6）連接的葡聚糖。以上提及的葡聚糖多數具有免疫調節(jié)或抗腫瘤活性，目前在臨床上廣泛應用的香菇多糖、裂褶菌多糖、云芝多糖、小菌核葡聚糖均為（1一3）-p-D-葡聚糖。2.2雜多糖從Hericiumerinaceus子實體中分離到一個新的雜多糖HEP-1，M為1.8X104，由鼠李糖、半乳糖和葡萄糖組成，摩爾比為1.19:3.81:1.00。Hep-1有一個（1一6）連接的a-D-半乳糖骨架，某些單元的O-2位上為（1一6）-p-D-葡萄寡糖單元和少量的鼠李糖殘基；鼠李葡萄糖側鏈在骨架上分布不均一，其一端有高分枝，其他末端幾乎無分枝；大多數葡萄糖殘基側鏈有0-2位取代的鼠李糖作為末端，側鏈的平均聚合度是3.7。Gao等從Tremellafuciformis中分得4種酸性雜多糖T?T，Mw分別為55.0X104、42.0X104、5.5X104、4.8X104,糖鏈分析表明「它們均有一個甘腐糖骨架，約一半的甘腐糖在0-2、0-4或0-6上有葡萄糖、甘露糖、巖藻糖、木糖或葡萄糖醛酸基團取代。PL-1和PL4是來源于Ga-nodermalucidum的2個雜多糖，經結構分析PL-1主鏈為（1一4）連接的a-D-葡萄糖殘基和（1一6）連接的盡D-半乳糖殘基，在葡萄糖0-6位和半乳糖的0-2位有分枝，分枝由末端葡萄糖、（1一6）連接的葡萄糖殘基和末端鼠李糖組成；PL-4由（1—3）、（1—4）、（1—6）連接的p-D-葡萄糖殘基和（1—6）連接的p-D-半乳糖殘基組成。灰樹花（Grifolafrondo-sa）菌絲體多糖G.F.-1的M為1.23X106，由木糖、甘露糖和葡萄糖組成，摩爾比為0.9:1.4:4.7,其一級結構是由以P-（1—3）、P-（1—6）糖苷鍵為主，分枝點大部分發(fā)生在主鏈糖基C-6位的p-D-葡聚糖構成。從Laetiporussulphureus中得到的1個雜多糖，其中部分的0-2位有3-0-D-甘腐糖-a-L-巖藻糖、a-D-甘露糖、a-L-巖藻糖取代。從蛹蟲草（Cordycepsminlitaris）、紅栓菌（Pronoporuscinnbarius）、鳳尾側耳（Pleurotusostreatus）等真菌里也分離得到了雜多糖。2.3蛋白糖和肽糖Kim等從Phellinuslinteas中得到一個酸性蛋白雜多糖，M為15.0X106,此酸性多糖包含72.2%的多糖和22.3%的蛋白質，多糖部分由甘露糖、半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖和木糖組成，蛋白質部分由門冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、甘氨酸和絲氨酸組成；1R光譜860,910cm-1分別為a-和p-多糖的特征，NMR光譜表明，此酸性蛋白雜多糖為一混有a-和盡連接、具有（1—6）分枝的（1—3）多糖。蛋白多糖和肽多糖也有從蛹蟲草菌（Cordycepsmillitaris）和赤靈芝（Trametesrobiniophila）中分離得到。3真菌多糖的構象研究多糖的化學結構是其生物活性的基礎，而探討結構與功能的關系，構象尤為重要。在水溶液中多糖糖鏈間的相互締合是比較普遍的，這是由于糖鏈上存在著許多自由羥基，易形成氫鍵。例如茯苓葡聚糖的羥乙基和羥丙基衍生物在水溶液里用SEC-LLS法測得M分別為76.8X104和224.3X104,而在二甲亞颯溶劑里測得w它們的實際MM為20.1X104和19.1X104，由于樣品在水溶液中締合，造成相對分子質量測定結果偏大很多，在二甲亞颯中則不存在氫鍵締合的問題。適宜的離子基團的引進可引起糖鏈的聚合，從而在水溶液里形成與原來多糖不同的構象。Wang等從茯苓（Poriacocos）里分離的水不溶性（1一3）-。-D-葡聚糖，無抗腫瘤活性，將其分別進行硫酸化、羧甲基化、甲基化、羥乙基化、羥丙基化得到三個水溶性衍生物。硫酸化、羥甲基化衍生物在水溶液里呈相對擴展的鏈狀，鏈剛性較大，表現出明顯的抗腫瘤活性；羥乙基化、羥丙基化衍生物由于在水溶液里的聚合，導致一個偏高的相對分子質量，抗腫瘤活性較低。這些衍生物的抗腫瘤活性隨著水溶性的增大而增加。香菇多糖、裂褶菌多糖、小菌核葡聚糖均為（1一3）-6-D-葡聚糖，均具有三股螺旋鏈，有很高的剛性，在水溶液里趨向形成有序的結構。據報道它們的生物活性與其（1一3）-6-D-葡聚糖主鏈的三股螺旋鏈結構緊密相關。這類多糖可與剛果紅形成絡合物，在0?0.5mol-L-1氫氧化鈉溶液內，表現為最大吸收波長的特征變化。但（1一3）-6-D-葡聚糖主十鏈的長短、主鏈的取代度、支鏈的長短等均可影響三股螺旋鏈的穩(wěn)定性。例如靈芝孢子葡聚糖SP及降解葡聚糖SP-1，剛果紅實驗證明，降解葡聚糖SP-1較原始葡聚糖SP有著與香菇多糖相似的三股螺旋鏈，在水溶液里有較規(guī)則有序的構象，降解葡聚糖SP-1的免疫活性明顯強于原始葡聚糖SP。從斜頂菌中分出三種多糖，結構相似，但相對分子質量大小不同，它們與剛果紅形成的絡合物曲線不同，主十長、相對分子質量大者其三股螺旋鏈穩(wěn)定，表明主鏈的取代度和側鏈的長度對于真菌中（1一3）-6-D-葡聚糖在水溶液中的構象和生物活性有著重要的影響。SEC-LLS可以不用標準品方便的測定多糖的相對分子質量、相對分子質量分布及分子鏈的構象。用M和回轉半徑（Vs2>z1/2）數據，可以在色譜圖上得到Mw或VS2>Z1/2的分布情況。通過描述M和VS2>Z1/2的依賴性幕法則（VS2>Z1/2aMa），由a值可獲得關于聚合體構象的有用信息。一般a值0.3表明聚合體為球狀，0.5為可曲伸的