抗氧化酶活性等測定方法

葉體提一、試劑配置1提L依次加入MES(195.2×0.05=9.76g)糖(0.33×182.2=60.126g)×58.5=0.585g200×0.0005=0.1g使用時(shí)加入2、懸浮液：將提中的換的HEPES3、80%Percol：80ml原+20ml水40%Percol+水；實(shí)際配制：PBS提取液2000ml(3個(gè)處*個(gè)品*3個(gè)重*20ml*3=1080ml),懸浮液100ml個(gè)理2個(gè)種3個(gè)重1ml*3次）;80%Percol200ml;40%Percol個(gè)處*2個(gè)品*個(gè)重*次162ml二、提取步驟1、10g鮮加20ml取PBS（50mMMES，0.33M山醇10mMMgCl，0.5POASA-Na用前現(xiàn)配現(xiàn)加）2、快速研磨，使葉片碎成綠豆大小層過濾，去除殘?jiān)ㄗ⒁膺^濾時(shí)不可用力擠壓，以葉綠體膜破碎）3、濾液2000g3min小心倒出清液，將離心管放入離心機(jī)后，使離心機(jī)的加速很快上升到預(yù)定平轉(zhuǎn)頭，加速度調(diào)到9)，經(jīng)30s快使其下降停止，整個(gè)離心持續(xù)大約左完成；4、沉淀用1ml提液漂洗表面浮物；5懸浮pH0.33mM山梨MgClmMKHPO，2mMASA-Na使現(xiàn)配加）將沉淀懸浮，在分散葉綠體時(shí)宜用毛筆輕輕刷，或者用手住離心管在冰塊之間攪動葉由震動分散開來要棉吸防壓破綠浮時(shí)濃點(diǎn)，含葉綠素2mg.ml以這樣有利于保持活性。6、2000g1min;7、沉淀再用懸浮液懸;懸液，可以不)8、用劑進(jìn)行梯度離心將3ml80%Percol（原液按100%算鋪在10ml離心層再把3ml鋪在離心管中層然后將葉體懸浮液輕輕鋪在離心管上層1500g（水離心頭的離心機(jī)，離心機(jī)加速要慢上升，加速度調(diào)到也慢下降，否則會破碎Percol度梯度層的形成會層色層破碎的葉綠體地為粗顆粒的Percol之間的界面有一層綠色層為完整葉綠;9、小心吸出，轉(zhuǎn)移到懸浮介質(zhì)，使葉綠體濃度達(dá)取體懸浮液0.1ml4.9ml80%的勻離2min清置于的色杯625nm比色照計(jì)

×50/34.5=葉mg/ml）10、葉綠體的完整性，完整達(dá)到；參考：TakedaK,T,KondaN.ParticipationofhydrogenperoxideininactivationCalvin-cycleSHenzymeinso2-furmugatedspinachleaves.PlantandcellPhysiology,1982,23:1009-1018.1

取上述制備的完整葉綠體進(jìn)行如測定：1、用50mM保護(hù)酶或其他定項(xiàng)目的緩沖液）稀釋倍，用于測定、POD、CAT、APX；2、用酮稀釋2倍0.5ML提液用于測定驗(yàn)0.2mol/LHClO稀釋3、用5%TCA釋2-5倍，取1.5ml用定MDA4、用：丙酮：4.5：4.5釋，用于測定葉綠素；（）活一、超氧化物歧化酶（SOD活性測定（氮藍(lán)四唑光化還原法）、試的制（1磷沖(PBSA液磷酸氫二鈉溶:取NaHPO·12H分子量358.14）71.7g；B液磷酸二氫鈉溶：取NaHPOO（分子量156.01分別用蒸餾水定容到0.05mol/L）配制分別取A液NaHPO，B母液NaHPO，餾水定容至。參考文獻(xiàn)合生主編：植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù).高等教育出版社，2000：267～268。（2甲氨酸溶液：取2.1637gMet用磷酸緩沖液pH7.8）至。（3）30μM溶取0.001gEDTA-Na用磷緩液容100ml。（4）60核素溶液：取0.0023g核素用磷酸緩沖液定容至100ml，避光保存。（5）2.25mM藍(lán)四(NBT)溶取0.1840g用PBS容至100ml避光保存。（上述試劑先配好，放到4度，用之前臨時(shí)按下面的方法配，然后放在4度中，不要在上層，避免見光，第一組樣品加好后拿來加，加完后放回冰箱，第二組的樣品加好后再拿出來加）酶制：（視況整品（新鮮葉片或根系）洗凈置于預(yù)冷的研缽中，加入.6ml預(yù)磷酸緩沖液pH7.8）冰浴上研磨成勻漿，轉(zhuǎn)入離心管中在℃、12000g下20min，上清液即為酶液。、酶性定（1應(yīng)混合液配(60個(gè)樣)別取Met溶162ml溶（量和面的濃度要核對緩液5.4ml，NBT溶6ml核黃素溶液6ml,混搖勻；SOD反應(yīng)混合液個(gè)處*種3次重*次定162ml(際配置200ml)（2）分別取3ml應(yīng)混合液和30（視況整最先一度梯度，看加多少合適，果量太少，最好稀釋后再加，這樣確）酶液于試管中（盡可能加到試管的底部，要靠著試管壁下去先加酶液，后加反應(yīng)液，加好后搖一，看看試管上是不是有霧氣，最好拿紗布把試管下邊擦一下免得霧氣擋住光線照過去（3管置于光照培養(yǎng)箱中l(wèi)ux照下反應(yīng)要要選擇相同規(guī)格，2

因?yàn)椴煌脑嚬芡腹饴适遣灰粯?，試管架不要選擇遮光的，這個(gè)最好分組做，同時(shí)幾組做相之間會遮光，每一組一個(gè)重復(fù)，就是每一中都要有所有的處理，且都要有一個(gè)最大管，處理多的話，根和葉分開做，最大管放在中間）同時(shí)做兩支對照管，其中1試取3ml反混液入30不加酶液）照光后測定作最大光還原管，另只加緩沖液于暗中測定時(shí)用于調(diào)零。（4）以不照光的對照管（只有沖液并置于暗處）調(diào)零后，避光測出顏色即可測)（5）酶活性計(jì)算SOD性單位抑制光還所需酶量（測的樣品值要在最大管的一左右才合適，否則要調(diào)整酶量）1個(gè)活單位uSOD總活性＝A×W×Vt）SOD比活力總性白質(zhì)量SOD總以鮮重酶單位每克表u/g力位以酶單位每毫克蛋白表示為光照管的吸光度為品管的吸光樣品液總體積，PBS的體)為定酶液用量ml，30ul為樣重g，測定時(shí)應(yīng)換算為葉綠體的質(zhì)量mg質(zhì)單位為。二、POD、CAT酶活性的測定粗酶液制備同SOD。、過氧物（POD活測（創(chuàng)酚）（1）試劑配制：磷緩沖(pH6.0)母(HPO)和B母液NaH)混為1000ml；（2）反應(yīng)混合液配制（以個(gè)樣準(zhǔn)取，pH6.0)，0.076ml液（液愈木2-甲氧基酚）加熱攪拌溶解冷卻后加入0.112ml％HO，混保存于冰箱中備用。POD反合液：3個(gè)2品種3次復(fù)*3ml*3次定(際配置200ml,0.076ml,0.112ml)（3）樣品測定：取反液并加入μl酶液PBS對照調(diào)零，而后測定OD470值測定40秒測定，測定前等待秒，要，如果慢的話，要保證每個(gè)樣品從加好樣到開始記時(shí)的時(shí)間相不大）（4）酶活性計(jì)算：以每minOD值（升高為1個(gè)活位uPOD=（ΔA470×Vt（W×Vs×0.01×t(u/gmin)ΔA470反應(yīng)時(shí)間內(nèi)吸光度的化W品鮮(；t為應(yīng)(min)；Vt為取酶液總積為時(shí)取酶液體積、過氧氫（CAT活測（1）試劑配制：0.15mol/L磷沖液（pH7.0A液NaHPO)和母液NaHPO)292.5ml后用蒸餾水定容至1000ml。3

（2）反應(yīng)液配制：取200ml，pH7.0的H原液）搖勻即可CAT反應(yīng)液3個(gè)處*2個(gè)種*次重*3ml*3測=162ml(際配置200ml,)（3測定應(yīng)液加可視情況調(diào)整對照調(diào)零定（外40s（4）酶活性計(jì)算：以每minOD值0.01為1個(gè)性單位uCAT=[ΔA240×Vt（W×Vs×0.01×t）(u/gΔA240反應(yīng)時(shí)間內(nèi)吸光度的化W品鮮(；t為應(yīng)(min)；Vt為取酶液總積，1.6ml為時(shí)取酶液體積ml,0.1ml三、抗壞血酸過氧化物酶（）活性的測定（緩沖液為K）、試配（50個(gè)樣計(jì)：（1）0.05HPOPO緩液pH7.0的配制：）K·3H：228.22×0.05×0.61=6.9607g）KH136.09×0.05×0.39=2.6538g以上兩者混合起來用去離子水定容到1L）0.1mMEDTA-Na：0.01861gEDTA-Na用液定容到500ml（372.24g/M×0.1mM×500ml=0.01861（3）5mMAsA取0.044g壞酸用溶定容到50ml（現(xiàn)配176.13g/M5mM×50ml=0.044gO取0.2ml,30%H用離水釋100ml（30%H為550g×30%/(34.01g/M×0.5L)=9.703M實(shí)際配置0.1mMEDTA-Na個(gè)理2個(gè)品*次重*1.7ml*3測定實(shí)際配置250）5mM的3個(gè)處*2個(gè)*次重*0.1ml*3次定5.4ml;（際配置50ml,0.044g20mMH3個(gè)處*2個(gè)品*次重*次定5.4ml;實(shí)際配置50ml,0.1ml、酶性測（2ml系定（10.10酶可情況整ml0.1mMEDTA-Na的（0.05mol/L再加入0.10mlmM的AsA，加入0.10O立即在20下測定D290（）值40s內(nèi)（測定時(shí)間內(nèi)變化大可測定的時(shí)短點(diǎn)，否則長點(diǎn)）的變化，計(jì)算單位時(shí)間內(nèi)sA減量和酶活（室溫下測定，緩沖液調(diào)零計(jì)算公式：△OD/△t×Vr×VT△OD為應(yīng)時(shí)間內(nèi)吸光度的變40秒光0光度反應(yīng)時(shí)間40應(yīng)液體積2mL提液體積1.6mL光系數(shù)2.8mM為色杯厚度1cm測液體積0.1mL為品鮮重四、超氧陰離子自由基（O

2

.-

）產(chǎn)生速率的測定（羥胺氧化法）4

1、試劑的配制（1）1mM鹽酸溶液：稱取0.02085g鹽羥胺用蒸餾水定容至300ml；（2）17mM氨基苯磺酸溶液：取1.1776g對氨基苯磺酸用少量冰醋酸水溶液（冰醋酸：：3配制）加熱溶解后定容至400ml；（3α-胺溶液取0.4008g胺用冰醋酸水溶冰醋酸3配容400ml實(shí)際配置PBS，pH7.8）:3個(gè)理*個(gè)品*3次重*0.5ml*3定（配置100）1mM鹽酸羥胺溶3個(gè)處*個(gè)品*次重*次定=（實(shí)際配置）17mM氨基苯磺:3處*2個(gè)品*次重*1ml*3測=（配置100ml,0.2944g7mMα-萘胺溶液3個(gè)理2個(gè)品*次重*次=（實(shí)際配置ml,0.1004g）2、O.-2

含量的測定（1）樣品液提取方法同SOD；（2）取提（酶液情調(diào)整用量）中加入0.5ml（0.05M，pH7.8鹽酸羥胺溶液后搖勻。（3）在25℃保溫1時(shí)；（4）依次先加入1ml對苯磺酸，再加入萘胺，混合后快速搖勻；（5）在25℃保溫20min后3000×g下心3min后上行（或置于冰箱待測（6）以對照管調(diào)零（用水調(diào)零水相液測定OD530值定（7）O

含計(jì)算：由測得的OD530查NO標(biāo)準(zhǔn)曲線得[]根據(jù)羥胺與O的式NHOH

＋HNO＋HO＋HO計(jì)[O

][NO

]×2=[O

]；再根據(jù)樣品與羥胺反應(yīng)的時(shí)和樣品中的蛋白質(zhì)含量，求得O

產(chǎn)生速率（以nmolmg蛋示，也可以nmol

鮮重表示O產(chǎn)=（C×V）/（nmolming鮮C標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的濃(umol/L)為定所提液葉綠體稀釋后的體)為應(yīng)間(為品鮮(綠實(shí)際質(zhì)量參考文獻(xiàn)：愛國，羅廣華．植物生理學(xué)通訊，19901、試劑的配制（1馬斯亮藍(lán)溶液配制取100mg考斯藍(lán)50ml％醇中入100ml（W/V）的磷酸，再用蒸餾水定容到1Ｌ過夜后過濾并貯于棕色瓶中，常溫下可在暗中保存一個(gè)月。（2）100μg/ml血清蛋白BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取水溶解后定容至100，再從吸取用水定容至100也可取10mgBSA定至100ml即100μg/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液實(shí)際配置0.05M磷沖液個(gè)處*2個(gè)品*3次重*0.08ml*3測=（際配置100ml,）5

考馬斯亮藍(lán)溶3理*2種3次*2.9ml*3測=156.6ml;（實(shí)置，20mg）2、樣品可溶性蛋白含量的測定（1）樣品可溶性蛋白含量測定取μl提取液（酶液）加入0μl磷酸緩沖液即稀釋成0.1ml提液入考馬斯亮藍(lán)溶液，反應(yīng)2min后OD595（μl緩沖加考馬斯亮藍(lán)為對照調(diào)零（2）蛋白質(zhì)含量計(jì)算：可溶性蛋白質(zhì)含量mg/g)/(W×V×1000)C標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的蛋白質(zhì)含為液總體稀釋后的體積測定時(shí)所用取液體積ml，20為重（g（H）含22一試配：1、0.2mol/L取溶0.5L中；2：112溶于0.5L的水中；3的磷酸緩沖HPOO5.6407g+NaHO5.3433g用離子水定容500ml；4、顯色液：、0.1mol/L、pH磷酸緩沖+25μL二苯+mg氨吡啉；5、過氧化物酶溶液250二測步：稱取植株根和葉片組織各，置于研缽中，加入1.6預(yù)至℃的0.2，勻漿，于10心5清加4調(diào)pH為7.5，再于心5min（4清1mL加0.4mL液和0.1mL化物酶溶液250UV-1601分光光度計(jì)測定波長550（）處光密度值的變化HO含mol/gFW表么）三計(jì)方要標(biāo)線參考：過氧化氫（H）含量的測定參照(2002)方法并加以改進(jìn)。還型胱肽GSH2．試制（1準(zhǔn)液10mL（用配蒸餾水至10mL要)（2）5％磺基水楊酸：25g溶于水（3DTNB稱取0.118905g50mL（0.1M中。（4：18.1mg溶10mL。（5）1mMGSSG標(biāo)液10mLGSSG。(要實(shí)際配置0.1MPBS(pH3處*2個(gè)品*3次重*0.5ml*3次定27ml;實(shí)際配置）6mMDTNB:處理2個(gè)品*3次*次定（配置ml量）2mMNADPH:處*品*3次重*次定=（際配置50ml,實(shí)用量18.1mg(1U)GR3個(gè)理2個(gè)品*次重*0.1ml*3次定5.4ml;實(shí)際配置50ml,實(shí)量10ml5％磺基水楊酸*2個(gè)品*3次重*測定（配置10ml際量0.5g/10ml)6

0.5mM個(gè)處*2個(gè)品*3次*1.5ml*3次定81ml;實(shí)際配置100ml）乙醚（二乙醚3個(gè)處*2個(gè)品*次重*10ml*3次=（配置1000ml）PBSBuffer個(gè)處*個(gè)品*3次重*1.5ml*3次定81ml;實(shí)際配置150）2-乙烯吡:3個(gè)處*2個(gè)*次重*0.2ml*3次定10.8ml;（際用量20）乙醚:3個(gè)*品*3次復(fù)次定540ml;際用量10001．標(biāo)線制作：配制濃度為0，0.02mM,0.04mM,0.06mM,0.08mM,0.1mM,0.12mM標(biāo)準(zhǔn)GSH溶液取上述標(biāo)準(zhǔn)各）加入0.5mL0.1M磷酸鈉（）(含5mM，0.2mL6mMDTNB,0.1mL2mMNADPH,0.1mL(1U)GR（谷胱甘還原酶(sigma),從0.1mLGSH啟反應(yīng)，測定的A412繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以代DTNB作空3．GSH還原型谷胱甘肽）GSSH

氧化型谷胱甘肽）（1）取1g新葉片，加入（可以取0.2g鮮，加1.6ml取液5基水楊酸，研磨在14000g離心10分，取1mL上，加入1.5mL,0.5mM（pH7.5），再用5mL乙（二醚）抽取二次（雜質(zhì)會融到乙醚層中，乙醚處于整個(gè)反應(yīng)體系得上層，你直接用槍吸取上層乙醚丟即可，反復(fù)進(jìn)行兩次即為抽取兩次液用于分析總谷胱苷肽含量。各取1mL上液，加入PBS(pH7.5),0.2mL烯吡啶（原裝試劑濃度）合至乳膠狀，在25℃應(yīng)1小用醚（原裝試劑濃度）抽2次，取液用于分析『GSSG－氧化型谷胱甘肽，還原谷胱甘肽不