腦科學研究的方法演示文稿

腦科學研究的方法演示文稿目前一頁\總數一百一十五頁\編于一點優(yōu)選腦科學研究的方法目前二頁\總數一百一十五頁\編于一點研究水平整體行為水平：行為學，軀體感覺，視聽覺，痛覺等

細胞水平：神經細胞培養(yǎng)、生物電活動檢測、通路示蹤、細胞染色、免疫化學、凋亡檢測分子水平的實驗：離子通道、受體、酶、遺傳物質等目前三頁\總數一百一十五頁\編于一點一、形態(tài)學方法二、生理學方法三、電生理學方法四、生物化學方法五、分子生物學方法六、腦成像（Brainimaging）技術目前四頁\總數一百一十五頁\編于一點一、形態(tài)學方法常規(guī)染色和特殊染色束（通）路追蹤法

熒光組織化學法原位雜交法受體定位法神經系功能活動形態(tài)定位法

目前五頁\總數一百一十五頁\編于一點1.常用普通染色方法TTC染色HE鋨酸染色氯化金浸染Cajal銀浸染色尼氏染色目前六頁\總數一百一十五頁\編于一點HE（蘇木素－伊紅）目前七頁\總數一百一十五頁\編于一點鋨酸染色是神經科學研究的一種常用而普遍的方法，它本來是用來固定脂質的，由于髓鞘的主要成分是脂質，所以用于有髓神經纖維的染色

鋨酸染色目前八頁\總數一百一十五頁\編于一點氯化金浸染運動終板Ach熒光染色氯化金浸染目前九頁\總數一百一十五頁\編于一點Cajal銀浸染色目前十頁\總數一百一十五頁\編于一點尼氏染色多種方法，HE、甲苯胺藍，焦油紫，硫堇，天青，派洛寧，中性紅以及棓花青等堿性苯胺染料均可以使尼氏體著色目前十一頁\總數一百一十五頁\編于一點2、束（通）路追蹤法：研究神經元之間的聯系

目前十二頁\總數一百一十五頁\編于一點束路追蹤原理：軸漿運輸示蹤物質：HRP，熒光染料，各種標記物標記的葡萄糖，放射性核素標記的氨基酸等。觀察：根據示蹤物質不同，采用組織顯色、熒光顯微鏡或放射自顯影等方法。目前十三頁\總數一百一十五頁\編于一點軸漿運輸法—利用神經元軸漿運輸現象的追蹤法.

追蹤劑：辣根過氧化物酶(horseradishperoxoidase,HRP)、熒光染料包括核黃(nuclearyellow)、固藍(fastblue)及熒光金(fluorogold)、植物凝集素如麥芽凝集素(wheatgermagglutinin,WGA)和菜豆凝集素(phaseolusvulgarisagglutinin)、細菌毒素如霍亂毒素、病毒如活的神經病毒

(胞疹病毒和彈狀病毒）

目前十四頁\總數一百一十五頁\編于一點l

變性法：利用神經元包體受損或神經軸突離斷后遠側軸突的變性，或軸突切斷后細胞的反應，來研究纖維的聯系。*物理性方法：刀的切割、電凝、電離破壞、超聲破壞等。*化學性破壞：興奮性氨基酸（海人酸和鵝高蕈氨酸）、單胺類神經毒（６－羥多巴胺、６－羥多巴、雙羥色胺）

目前十五頁\總數一百一十五頁\編于一點神經元質膜熒光染料法：

用羰花青（carbocynine）熒光染料，可以染出神經細胞的質膜，并可以在活體或固定的標本上追蹤纖維聯系。

目前十六頁\總數一百一十五頁\編于一點最新研究進展：

華人學者繪制小鼠大腦神經網絡圖不同的大腦區(qū)域必須相互溝通才能控制復雜的思想和行為，但目前對于這些區(qū)域組織成為廣闊神經元網絡的機制卻相對知之甚少。2014年2月27日《細胞》（Cell）雜志上的一項新研究中，南加州大學董宏偉等研究人員采用神經元示蹤技術繪制出了一張小鼠全腦圖譜，揭示了大腦皮質中數百條神經元通路。在顯微鏡下將可見的熒光分子注入到整個小鼠大腦皮質的不同區(qū)域，這些小分子沿著“細胞高速公路”運輸，標記了大約600個神經元通路。研究人員采用高分辨率顯微鏡掃描了這些大腦區(qū)域，構建出了皮質連接的圖像數據庫。目前十七頁\總數一百一十五頁\編于一點當研究人員分析這些連接時，他們發(fā)現大腦皮質是一個高度組織化的網絡，由八個子網絡構成，它們協調活動反映動物的情感和感覺。并且，子網絡之間以一種非常特殊的方式來共享這一信息?！斑@些研究發(fā)現挑戰(zhàn)了流行假說：大腦皮質是一個單一的網絡，在這一網絡中所有一切都密集連接在一起。”接下來，研究人員可將來自這一重要哺乳動物模型系統的解剖數據與大量現有的分子遺傳數據合并來鑒別神經細胞基本類型?！按_定全腦的結構組織將是朝著揭示腦功能以及在神經系統疾病中功能障礙的結構基礎邁出的基本且令人興奮的一步，”董宏偉說。目前十八頁\總數一百一十五頁\編于一點我們真的會永遠不老嗎？——從“科學狂人”的抗衰老研究說起JohnCraigVenter的身上從不缺乏話題。從單槍匹馬與人類基因組計劃展開競爭、時代雜志將他與人類基因組計劃代表FrancisCollins同時選為封面人物，到宣布制造出首個能夠自我復制的活細胞“Synthia”，轟動了整個學術界，Venter的每一個舉動，在學術界都會引起波瀾。前陣子，他又宣稱將組建新公司HLI，組建史上最大的基因組數據庫，結合基因組學、生物信息學及干細胞療法，致力于抗衰老研究，并延長人類壽命。目前十九頁\總數一百一十五頁\編于一點【為什么我們會追求不老和長壽】對于不老和長壽的探索，恐怕是除了“我們是誰”“我們從哪兒來”之外，人們思考的第三個問題了——“我們能否一直存在下去”。【對衰老和長壽的基因研究】有一個規(guī)律，很多問題，如果解釋不了，就說它是由于基因決定的，多半錯不到哪里去。也因此，生物學家、醫(yī)學家們紛紛開始將遺傳學和分子生物學結合，從基因的角度開始對長壽和衰老問題的探索。目前二十頁\總數一百一十五頁\編于一點目前基因方面的研究主要有兩個方向，長壽基因和衰老基因。這里說的并不是單一的基因，而是與長壽和衰老有關的多種基因，它們之間的相互作用帶來了不老和長壽的結果。衰老的表現為染色體端粒長度的改變、DNA損傷、甲基化等，衰老的終點就是死亡，這些因素也是影響長壽的原因。有科學家認為，端粒（細胞核兩端的特殊DNA片段）長度決定生物的壽命，端粒的縮短會導致細胞分裂的停止和死亡的來臨。發(fā)現端粒的三位科學家獲得了2009年諾貝爾生理學或醫(yī)學獎。目前“長壽基因”和“衰老基因”還不能完全確定，但有學者認為，消除自由基的某些酶類基因、與細胞生長調控有關的某些基因與長壽和衰老相關。對于長壽和衰老基因，科學上還需要繼續(xù)發(fā)現更多的相關基因，理清那些導致衰老、影響長壽的基因群及其之間的聯系，才能在理解基因組的基礎上，解決衰老、長壽的問題。目前二十一頁\總數一百一十五頁\編于一點【其他長壽和抗衰老的辦法】除了基因研究外，還有抗衰老制劑的研究。褪黑素與微量元素是被認為有抗衰老作用的物質。褪黑素的自由基清除能力在眾多自由基清除劑中表現特別突出，而微量元素攝入不協調，將導致衰老。還有一種說法，節(jié)食能夠延長壽命。這背后的生物學原理是：生長激素和胰島素信號途徑在起作用?？茖W家通過對猴子、酵母菌、果蠅等動物的研究中驗證了減少卡路里攝入能夠延長壽命的理論。另一些科學家提出引起機體衰老和疾病的是自由基的增多，這也是現實生活中那些宣稱“清除自由基，恢復年輕態(tài)”的保健品所依賴的理論基礎。這些保健品療效有限，請不要輕易嘗試。除了遺傳因素之外，人生活的環(huán)境、人的心理狀況等多方面因素都會影響到壽命。保持愉悅的心情，健康的生活方式，良好的飲食習慣，這樣即使軀體不可避免的老化，但還是有年輕的心態(tài)，總好過長壽但不快樂，年輕的外表下，卻住著一個老靈魂。目前二十二頁\總數一百一十五頁\編于一點對于長壽基因及衰老基因的發(fā)掘，也有不贊同的聲音。他們認為這違反了倫理道德，假使我們不老不死，那么進化的要領“生存和繁殖”，也會越來越少的被考慮，我們將剝奪后代的生存機會。技術的進步帶來的潛在社會問題，還有待進一步去解決。就目前的研究狀況來看，長壽不意味著不會永生，科學的幫助下，人們有機會將有限的生命拉長，將有限的生命過得更有質量，實現不老不病的愿望。此時又想到了Venter先生，據悉，Venter曾作為美國海軍醫(yī)療隊的醫(yī)院參加越戰(zhàn)，戰(zhàn)場的殘酷使他認識到生命和時間的寶貴，他認為人生的每一分鐘都應該有所創(chuàng)新。撇開進化的需要不談，試想有一天，我們不再會變老，沒有疾病，壽命很長，我們是否還會像出生即知將死的時候那樣，珍惜生命中的每一天，而努力奮斗呢。目前二十三頁\總數一百一十五頁\編于一點3、熒光組織化學法

用特異性抗體顯示神經組織化學成分的方法。目前二十四頁\總數一百一十五頁\編于一點基本過程有：固定、制片、反應等三步。

l

免疫組織化學反應：有直接法和間接法

l雙重免疫組織化學染色：主要是為了研究兩種物質在同一細胞或突起內的共存現象，或含兩種不同化學物質的相互關系。目前二十五頁\總數一百一十五頁\編于一點免疫組化根據二抗標記的不同（熒光素、酶、鐵蛋白、膠體金或銀標記），免疫組化包括免疫熒光、免疫酶組織化學、免疫金銀及鐵標記技術目前二十六頁\總數一百一十五頁\編于一點核酸分子雜交技術，檢測細胞內mRNA和DNA序列片段，原位研究細胞合成某種多肽或蛋白質的基因表達。基本原理是根據兩條單鏈核苷酸互補堿基序列專一配對的特點，應用已知堿基序列并具有標記物的RNA或DNA片段即核酸探針（probe），與組織切片或細胞內的待測核酸（RNA或DNA片段）進行雜交，通過標記物的顯示，在光鏡或電鏡下觀察目的mRNA或DNA的存在與定位。4、原位雜交法

目前二十七頁\總數一百一十五頁\編于一點此項技術需首先制備某種核酸探針，其種類主要有三種：①利用大肝桿菌重組帶有目的基因的質粒DNA，制成互補DNA探針(cDNA)；②應用限制性核酸內切酶消化制成線性DNA模板，在體外轉錄獲得反義RNA探針(cDNA)；③依照待測核酸的核苷酸序列，應用DNA合成儀合成寡聚核苷酸探針。cRNA和cDNA的常用標記物有32S、32P、3H等放射性核素和熒光素、生物素、地高辛等非放射性物質。目前二十八頁\總數一百一十五頁\編于一點組織學應用的原位雜交術主要是染色體原位雜交和細胞原位雜交。前者是研究遺傳基因、抗原基因、受體基因、癌基因等在染色體上的定位與表達；后者是研究細胞某種蛋白質的基因轉錄物mRNA在胞質內的定位與表達。核酸分子雜交術有很高的敏感性和特異性，它是免疫細胞化學的基礎上，進一步從分子水平探討細胞功能的表達及其調節(jié)機制的，已成為當前神經生物學研究的重要手段。目前二十九頁\總數一百一十五頁\編于一點5、受體定位法：研究受體在神經系統內的定位

配體法：主要在組織切片上進行，利用標記的配體和受體結合以示蹤其部位

免疫組織化學法：用針對受體的抗體目前三十頁\總數一百一十五頁\編于一點6、神經系功能活動形態(tài)定位法

脫氧葡萄糖法：原理是：神經元活動時其能量代謝增加，而其能量代謝主要依賴葡萄糖。在腦內存在脫氧葡萄糖(2-deoxy-D-glucose,2DG)時，神經元可不加區(qū)別地將2DG與葡萄糖一起攝入細胞內，兩者都是己糖激酶的底物。但2DG在其被磷酸化成2DG-6-PO4后，不能被磷酸己糖異構酶進一步轉化為果糖-6-PO4，不能繼續(xù)在糖酵解循環(huán)中代謝。如在2DG上標以同位素。神經元內同位素的堆積程度反映了神經元的活動程度。

目前三十一頁\總數一百一十五頁\編于一點c-fos(Fos)法：

c-fos是一種原癌基因，屬于即刻－早期基因類(immediate-earlygene).很多刺激條件可通過第二信使引起神經元c-fos的表達增加，形成fosmRNA。由fosmRNA翻譯成的Fos蛋白，立即轉位至細胞核內，與另一即刻早基因c-jun所產生的蛋白Jun構成二聚體（第三信使），調節(jié)其靶基因的表達，引起一系列的細胞反應。

目前三十二頁\總數一百一十五頁\編于一點細胞色素氧化酶法：

神經元線粒體內的細胞色素氧化酶是提供神經元能量的重要酶，細胞色素氧化酶的水平與神經元能量需求密切相關，一般反映慢性刺激的結果。

目前三十三頁\總數一百一十五頁\編于一點二、生理學方法

損毀法

刺激法周身給藥法腦室注射法腦組織培養(yǎng)亞細胞分析神經遞質釋放量的測定

神經遞質的功能測定

行為學方法

最常用的有兩種：神經行為學、電生理學目前三十四頁\總數一百一十五頁\編于一點1、神經遞質釋放量的測定（在體invivo和離體invitro)推挽灌流法：

在體研究中樞核團遞質釋放的有用方法。通過推挽灌流套管，使灌流液直接灌流腦組織，從流出液中分析神經遞質的變化。

目前三十五頁\總數一百一十五頁\編于一點目前三十六頁\總數一百一十五頁\編于一點腦透析術(braindialysis)：在特定的腦區(qū)內，植入透析探頭，用生理溶液灌流時，細胞外液中的神經遞質可順濃度遞度從透析管擴散至灌流液中，收集和測定灌流液中神經遞質的含量，就能監(jiān)測該遞質的變化過程。腦透析術的裝置包括探頭、導管、微量灌流泵、樣品收集器和定量分析儀。

目前三十七頁\總數一百一十五頁\編于一點目前三十八頁\總數一百一十五頁\編于一點目前三十九頁\總數一百一十五頁\編于一點

抗體微探針法：是在玻璃微電極上涂上一層神經肽抗體，用于在中樞神經系統內定位神經肽的釋放。硼硅玻璃與r－氨丙基三乙氧硅烷（r-aminopropyltri-etriethoxysilane）反應后在玻璃表面形成一層帶有游離氨基的硅氧烷(siloxane)多聚體微粒。該玻璃再用戊二醛(glutaraldehyde)處理，使戊二醛與蛋白質A以共價鍵方式偶聯，蛋白質A再與神經肽抗體結合，制成抗體微探針目前四十頁\總數一百一十五頁\編于一點腦片灌流法

突觸體灌流法目前四十一頁\總數一百一十五頁\編于一點2、神經遞質的功能測定

微電泳：能將微量的神經遞質導入神經元附近，觀察其作用?？贵w微量注射：特異性的抗體注射在某些部位，可中和神經末梢釋放出而進入突觸間隙的神經肽，防止其與受體結合。因此，抗體微量注射所引起的功能變化可解釋為消除該神經肽的生理效應的結果。生物檢測（Bioassay）:經典的方法.如用水蛭背最長肌測定ACh的作用，靈敏度達10-10g.目前四十二頁\總數一百一十五頁\編于一點3、行為學方法

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經典條件反射：代表了刺激與強化的關系。l操作式條件反射：是通過動物自身的某個特定操作動作而獲得食物或回避有害刺激的反應活動。

目前四十三頁\總數一百一十五頁\編于一點Behavioralneuroscienceisthestudyoftheneuralmechanismsmediatingnormalandabnormalbehaviors.自主活動動物焦慮檢測：實施焦慮因素，如飲食或飲水剝奪，檢測反應，可以用于藥物篩選。性和生殖行為：進化，神經內分泌作用機制學習記憶攝食行為驚恐反射社會行為

……..目前四十四頁\總數一百一十五頁\編于一點自主活動箱實驗動物的自主活動標志著動物中樞神經系統的興奮狀態(tài)，當中樞神經系統興奮時，自主活動加強，抑制時則自主活動減少。觀察動物自主活動是評價中樞神經興奮狀態(tài)的一項主要指標。多種作用于中樞神經系統的藥物都可影響動物的自主活動，因而自主活動的記錄是研究中樞神經系統藥物的主要方法，而且在新藥研究中，觀察藥物對動物自主活動的影響也是評價藥物是否影響中樞神經系統的重要方法．目前四十五頁\總數一百一十五頁\編于一點自主活動箱實驗主要技術指標：運動次數目前四十六頁\總數一百一十五頁\編于一點洞板實驗檢測小鼠自動活動，可用于新藥，一般藥理，神經系統的研究和中樞興奮性，抑制性研究。主要技術指標：小鼠探洞次數。目前四十七頁\總數一百一十五頁\編于一點學習記憶的行為學檢測

學習記憶功能包括空間學習記憶功能和非空間學習記憶功能。隨著對大腦學習記憶機制研究的不斷深入以及尋找有效防治認知障礙類疾病方法的需要，使得動物行為學實驗成為研究腦高級功能及其他神經科學的不可缺少的重要手段，客觀準確地評價實驗動物的學習記憶水平已成為神經生物學和神經藥理學中非常重要的研究內容。目前四十八頁\總數一百一十五頁\編于一點學習記憶功能檢測的常用實驗程序空間學習記憶任務非空間學習記憶任務Morris水迷宮T迷宮6或8臂放射狀水迷宮LashleyⅢ

迷宮放射狀迷宮（8臂、12臂）H-W迷宮Y迷宮新奇物體認知環(huán)形平臺嗅覺辨別T迷宮穿梭箱實驗跳臺實驗目前四十九頁\總數一百一十五頁\編于一點Morris迷宮1981年，英國心理學家Morris首次設計應用了這種水迷宮及其程序。目的是幫助大腦學習記憶機制的研究。起初實驗動物主要為大鼠，此后該迷宮系統成為評估嚙齒類動物空間學習和記憶能力的經典程序，廣泛運用于神經生物學、藥學等領域的基礎和應用研究中。目前五十頁\總數一百一十五頁\編于一點Morris水迷宮應用:判斷動物空間學習記憶能力組成:觀察指標:潛伏期，路徑，不同象限的停留時間和長度，搜索策略等目前五十一頁\總數一百一十五頁\編于一點Morris水迷宮目前五十二頁\總數一百一十五頁\編于一點目前五十三頁\總數一百一十五頁\編于一點Morris水迷宮原理水是嚙齒類動物非常厭惡的刺激或環(huán)境。鼠在水池中就會急于尋找逃路。它們的習性為在水池四周尋找出口逃避，但深而光滑的垂直池壁阻礙了這種企圖。實驗中設置的水下平臺（用于小鼠的常為水面下1cm）可提供鼠棲身的場所。但在巨大的水面上，強迫游泳的動物不能看見平臺。它們若要快速找到平臺而避免淹沒就必須利用環(huán)境中的線索進行定位。從而檢測了鼠記住環(huán)境中的線索及其與平臺位置關系而對平臺進行定位的能力（學習記憶能力）。目前五十四頁\總數一百一十五頁\編于一點Morris水迷宮的優(yōu)點由于對年齡相關性空間記憶損害有可靠的敏感性，Morris水迷宮是判斷老年小鼠空間學習記憶能力的特別有用的工具。驅動動物逃避的是水刺激，而不需要食物和水的剝奪。因此，避免了剝奪食物和水后給實驗動物帶來的新陳代謝方面的問題。動物不必接受電休克，這在那些食欲促進任務（appetitivetasks）如輻射狀迷宮和T迷宮中是常規(guī)的要求。能提供較多的實驗參數，系統全面地考察實驗動物空間認知加工的過程，客觀地反映其認知水平。將實驗動物的學習記憶障礙和感覺、運動缺陷等分離開來，減少它們對學習記憶過程檢測的干擾。既可以檢測空間參考記憶又可以檢測空間工作記憶。在用固定平臺測試小鼠的空間參考記憶后再將平臺的位置改為不固定，就可檢測它們的工作記憶能力。顯然，尋找不固定平臺的認知過程要復雜一些，需要動物對時間和空間上的分離信息加以整合和判斷。操作簡便，數據誤差較小。目前五十五頁\總數一百一十五頁\編于一點Morris水迷宮的不足之處由于需要監(jiān)視系統及分析軟件，只有少數裝備較好的實驗室可以實施。實驗程序的設計需要考慮的因素較多，同時需要實驗者具備一定的神經生理學、認知生理學和數理統計方面的知識，給實驗的開展和結果的解釋帶來困難，同時也限制了該迷宮的深入廣泛的應用。由于體力消耗太大，體溫也喪失過多，年老體弱鼠完成任務較困難。并非所有鼠株都適合于Morris迷宮測試，如BALB/c不能學會該任務（成績并不隨天數的增加而進步），129/SvJ的學習成績也偏差。個體間的成績差異巨大。某些株，如129/SvJ株的小鼠由于有年齡相關性視路病變(visualpathology)，在衰老時完成以視覺為基礎的學習記憶任務時就會出現困難。在C57BL/6株，由于嚴重的禿頭癥（alopecia）存在，可能使某些小鼠產生抑郁，加上潰瘍性皮炎，最終可能影響小鼠的游泳能力而影響實驗成績。對輕微的學習記憶能力的減退，該迷宮程序可能不敏感。所占實驗場地過大。目前五十六頁\總數一百一十五頁\編于一點LashleyIII水迷宮目前五十七頁\總數一百一十五頁\編于一點LashleyIII水迷宮

是一種相對復雜的迷宮。它含有動物必須學會避免的盲端（culs-de-sac）和動物必須做出正確的左或右拐彎的T選擇。實驗進行5天，每天進行2次測試（上下午各1次）。每天的2次測試被平均。指標包括：學習指數（正確進入數/進入總數）、游向目標時的盲端進入數及T選擇錯誤數、向后進入總數、逃生所用時間等。目前五十八頁\總數一百一十五頁\編于一點八臂放射狀旱迷宮八臂放射狀旱迷宮，是Olten和Samnelson在1976年設計的，做為一種評估大鼠空間學習記憶的方法。它可以同時評估實驗動物的工作記憶和參考記憶。原理利用食物作為激勵措施而到達目的地，饑餓的動物需要實行特別的搜索順序或利用最短的時間或最小的錯誤來尋求獎賞。目前五十九頁\總數一百一十五頁\編于一點八臂放射狀旱迷宮裝置八臂放射狀旱迷宮是由從中央平臺伸出的8個相等的臂呈放射狀排列組成，8臂中有4臂的末端放有食物，在同一天的整個實驗過程中哪些臂中含有食物保持固定不變，但每天之間均有改變。迷宮周圍有若干空間線索。實驗前大鼠需被剝奪食物和水，實驗開始時，大鼠被放在中央平臺處后去尋找食物。在實驗中大鼠需記住哪些臂已被探索過，食物已被攝取，以避免再次進入，從而在最短的時間內獲得最大量的食物。同時，在每天的實驗結束后，大鼠還必須放棄當天的記憶信息，以準備適應第二天的實驗。目前六十頁\總數一百一十五頁\編于一點八臂放射狀旱迷宮應用評估動物工作記憶和參考記憶

工作記憶是指利用一個僅僅在短時間內的保留信息，或稱為實驗特定信息（trial-specificinformation）而獲得的記憶，它是對實驗中可變事物的記憶能力。

參考記憶是對持續(xù)存在的信息，或稱為任務特定信息（task-specificinformation）的記憶，它是對實驗中不變事物的記憶能力。目前六十一頁\總數一百一十五頁\編于一點八臂放射狀旱迷宮觀察指標時間測定和錯誤積分存在的問題優(yōu)點：同時評估實驗動物的工作記憶和參考記憶不足：氣味的影響。包括食物的氣味、其他動物的氣味以及動物自身的氣味。實驗動物被限制食物和水，由此會帶來的影響。并且不同的食物獎賞也可產生明顯的影響；另外，動物種屬的不同使其在食物需求上也可導致不同的結論。目前六十二頁\總數一百一十五頁\編于一點穿梭箱實驗試驗裝置實驗箱大小為50cm×16cm×18cm。箱底部格柵為可以通電的不銹鋼棒，箱底中央部有一高1.2cm的擋板，將箱底部分隔成左右兩列。實驗箱頂部有光源，蜂鳴音控制器。訓練時，將大白鼠放入箱內任何一側，20s后開始呈現燈光和（或）蜂鳴音，持續(xù)15s，后10s內同時給以電刺激(100V，O.2mA，50Hz，AC)。最初，動物只對電擊有反應，即逃至對側以回避電擊。20s后再次出現條件刺激并繼之在動物所在側施以電刺激，迫使動物跳至另一側……如此來往穿梭。當蜂鳴音或／燈光信號呈現時，大白鼠立即逃至對側安全區(qū)以躲避電擊，即認為出現了條件反應(或稱主動回避反應)。每閑天訓練一回，每回100次。約訓練4—5回后．動物的主動回避反應率可達80％～90％。此法可同時觀察被動和主動回避性反應.此外．從動物的反應次數也可以了解動物系處于興奮或抑制狀態(tài)。目前六十三頁\總數一百一十五頁\編于一點穿梭箱實驗自動記錄系統可以輸出以下內容：(1)動物序號；(2)遭受刺激次數；(3)遭受刺激時間；(4)主動回避反應時間。以上各值均為在設定的穿梭次數內反應的總和。遭受電激次數是被動回避的次數，該值與設定循環(huán)次數之差即為主動回避次數；刺激時間是指動物在被動回避過程受到電刺激的時間和，該值愈小，說明動物被動反應愈敏捷，主動回避時間是指動物在接受條件刺激的時間長短，該值越短，說明動物主動回避反應越迅速．目前六十四頁\總數一百一十五頁\編于一點跳臺試驗

跳臺實驗屬一次性刺激回避反應實驗（ONETRAILAVOIDANCETEST）。裝置：試驗裝置為一長方形反射箱，大小為10cm×10cm×60cm，用黑色塑板分割成5間。地面鋪以柵欄，間距0.5cm，可以通電，每間角落置一高和直徑均為4.5cm的平臺。目前六十五頁\總數一百一十五頁\編于一點跳臺試驗原理

在一個開闊的空間，動物大部分時間都在邊緣及角落里活動。在一個方形中心設置一個高的平臺，當把動物放在平臺時，它幾乎立即跳下平臺并向四周探索接近邊緣指標潛伏期：記錄動物從上平臺到第一次下平臺的時間操作步驟一個典型的例子包含三個過程：熟悉過程

學習過程

記憶檢測熟悉過程：將動物放在平臺上，開始計時，至動物跳下。此時間段為潛伏期。動物探索10s以后，放回籠中學習過程：動物一旦從平臺上跳下后，立即受到電刺激，然后放回籠中記憶檢測：學習試驗24h后，將實驗動物重新放回平臺上，記錄跳下平臺的潛伏期。動物跳下平臺或持續(xù)停留在平臺上標志著驗的結束（終止時間為60s）。將動物放入反應箱內適應環(huán)境3min，然后立即通以36V交流電。動物受到電擊，其正常反應是跳回平臺以躲避傷害性刺激。多數動物可能再次或多次跳至柵欄上，受到電擊后又迅速跳回平臺。如此訓練5min，并記錄每鼠受到電擊的次數或叫錯誤次數（numberoferrors），以此作為學習成績。24h后重做測試，此即叫記憶保持測試。記錄受電擊死亡動物數、第一次跳下平臺的潛伏期和3min內的錯誤次數。目前六十六頁\總數一百一十五頁\編于一點三、電生理學方法

電生理學的方法包括胞外記錄、胞內記錄、腦內電刺激、電壓鉗、膜片鉗、腦電圖等技術。1、電生理常用儀器

陰極射線示波器:高靈敏度，掃描速度慢

生物電放大器

電子刺激器

貯存和分析電生理實驗結果的儀器：如示波器照相機和計算機。目前六十七頁\總數一百一十五頁\編于一點2、電生理學的常用方法

細胞外記錄(Extracellularrecording)：把引導電極安放在神經組織的表面或附近引導神經組織的電活動。胞內記錄(Intracellularrecording)：研究神經元基本生物物理特性的有力手段。EPSP,IPSP,AP(動作電位)腦內電刺激：是研究中樞功能定位的方法之一。

目前六十八頁\總數一百一十五頁\編于一點順行沖動記錄法(Orthodromicimpulserecording)：就是電刺激某一突觸前的細胞體、樹突或軸突，在此突觸后神經元細胞體上記錄此刺激引起的電活動變化。逆行沖動記錄法(Antidromicimpulserecording)：逆行沖動記錄法即電刺激神經元的軸突主干或末梢，在同一神經元胞體記錄反相傳導的動作電位。

目前六十九頁\總數一百一十五頁\編于一點電壓鉗技術(VoltageClamp)：通過插入細胞內的一根微電極向細胞內補充電流，補充的電流量正好等于跨膜流出的反向離子流，這樣即使膜通透性發(fā)生改變時，也能控制膜電位數值的不變。經過離子通道的離子流與經微電極施加的電流方向相反，數量相等。

目前七十頁\總數一百一十五頁\編于一點SG:信號發(fā)生器，FBA:反饋放大器，V監(jiān)測膜電位目前七十一頁\總數一百一十五頁\編于一點膜(斑)片鉗技術（PatchClamp）：可以從分子水平研究細胞膜離子通道的功能，是用玻璃微電極吸管和只含１～３個離子通道，面積為幾個平方微米的細胞膜通過負壓吸引封接起來，由于電極尖端與細胞膜的高阻封接，此片膜內開放所產生的電流流進玻璃吸管，用一極敏感的電流監(jiān)視器（斑片鉗放大器）測量此電流強度，就代表單一離子通道電流。目前七十二頁\總數一百一十五頁\編于一點膜片鉗（patchclamp）

內爾(Neher)薩克曼(Sakmann)

（1944-）（1942-）（德國細胞生理學家）（德國細胞生理學家）

合作發(fā)明了膜片箝技術，并應用這一技術首次證實了細胞膜上存在離子通道。這一成果對于研究細胞功能的調控至關重要，可揭示神經系統、肌肉系統、心血管系統及糖尿病等多種疾病的發(fā)病機理，并提供治療的新途徑。二人共獲1991年諾貝爾獎。目前七十三頁\總數一百一十五頁\編于一點膜片鉗目前七十四頁\總數一百一十五頁\編于一點經典記錄模式：貼附式（Cell-attached或oncell)

內膜向外式(Inside-out)

外膜向外式(Outside-out)

全細胞記錄方式(Whole-cellrecording)目前七十五頁\總數一百一十五頁\編于一點目前七十六頁\總數一百一十五頁\編于一點

目前七十七頁\總數一百一十五頁\編于一點目前七十八頁\總數一百一十五頁\編于一點腦電波測定:

用雙極或單極引導法，將引導電極放在腦活動區(qū)顱骨表面之上，可以記錄出能變換方向的微弱電流。通過強力放大記錄出來的電位稱腦電圖（ＥＥＧ）。

目前七十九頁\總數一百一十五頁\編于一點誘發(fā)電位:

中樞神經的任何部位對于故意刺激感受器官，感受神經、感覺通路上的任何一點，或與感覺器官有關的任何結構上的一點，所產生的電變化，叫做誘發(fā)電位（evokedpotential)。

目前八十頁\總數一百一十五頁\編于一點經典的生物化學方法包括：離心電泳層析質譜等由于生物化學方法與藥理學、免疫學等其他學科相結合，又發(fā)展了：放射免疫(Radioimmunoassay，RIA)放射受體免疫印跡等方面四、生物化學方法

目前八十一頁\總數一百一十五頁\編于一點1、用離心法分離制備突觸小體及突出小體膜突觸小體:是指腦組織在等滲溶液中勻漿時，神經末梢的細胞膜從軸突上自發(fā)斷裂、封閉而形成的神經末梢單位。它包括突觸前膜、突觸后膜及致密斑和包圍在突觸前膜的突觸小泡(vesicle內含神經遞質)，線粒體及胞漿蛋白質。由于突觸小體是神經介質及受體的主要聚集部位，突觸小體的制備便成了神經介質及受體的基本制備手段。

目前八十二頁\總數一百一十五頁\編于一點離心（centrifuge）離心技術主要用于各種生物樣品的分離和制備，生物樣品懸浮液在高速旋轉下，由于巨大的離心力作用，使懸浮的微小顆粒（細胞器、生物大分子的沉淀等）以一定的速度沉降，從而與溶液得以分離，而沉降速度取決于顆粒的質量、大小和密度。目前八十三頁\總數一百一十五頁\編于一點離心離心機種類制備型離心機

普通：（6000rpm以下）高速冷凍（25000rpm以下）超速（可達50000～80000rpm）分析型離心機目前八十四頁\總數一百一十五頁\編于一點離心制備型離心方法差速沉降離心法

密度梯度區(qū)帶離心法（簡稱區(qū)帶離心法）

目前八十五頁\總數一百一十五頁\編于一點2、層析法:

特點：分離生物活性物質時不使其失活，可大量制備?；驹恚罕环蛛x物質與支持物相互作用的緊密程度不同，流洗時被洗脫的難易程度不同。

目前八十六頁\總數一百一十五頁\編于一點常用層析方法離子交換層析凝膠過濾層析親和層析疏水層析高效液相目前八十七頁\總數一百一十五頁\編于一點目前八十八頁\總數一百一十五頁\編于一點離子交換層析目前八十九頁\總數一百一十五頁\編于一點凝膠過濾層析目前九十頁\總數一百一十五頁\編于一點親和層析目前九十一頁\總數一百一十五頁\編于一點3、放射免疫(radioimmunoassay,RIA)測定神經介質：利用抗體(Ab)特異地識別其抗原（Ag）的原理，將抗原標記放射性同位素（*Ag），用來測定與*Ag抗原性相同的物質。

目前九十二頁\總數一百一十五頁\編于一點4、放射受體測定受體法：

利用標記能作用于不同靶組織內各種受體的遞質和激素，從而達到直接測定配體與其受體形成絡合物的過程和理化特性。目前九十三頁\總數一百一十五頁\編于一點5、免疫印跡法（immunoblotting或westernblotting）鑒定生物分子：是將電泳凝膠分離出來的電泳帶移到特殊的濾膜上，再利用標記抗體與濾膜上某一蛋白質或肽的特異結合，使其顯色。優(yōu)點：一是將傳統的電泳凝膠染色法的敏感度提高了100~1000倍，二是RIA與相似，能從多種蛋白質中選擇鑒定出一種特異的蛋白質，其敏感性可達1ng，同時又能知道這一蛋白質的分子量，這又是RIA無法達到的。目前九十四頁\總數一百一十五頁\編于一點6.電泳電泳是指帶電顆粒在電場的作用下發(fā)生遷移的過程。電泳技術就是利用在電場的作用下，由于待分離樣品中各種分子帶電性質以及分子本身大小、形狀等性質的差異，使帶電分子產生不同的遷移速度，從而對樣品進行分離、鑒定或提純的技術。電泳技術有很多種方法，介紹最常用的兩種：目前九十五頁\總數一百一十五頁\編于一點水平板式電泳槽垂直板式電泳槽穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀目前九十六頁\總數一百一十五頁\編于一點蛋白質SDS電泳目前九十七頁\總數一百一十五頁\編于一點目前九十八頁\總數一百一十五頁\編于一點染色結果目前九十九頁\總數一百一十五頁\編于一點瓊脂糖凝膠電泳天然瓊脂（agar）是一種多聚糖，主要由瓊脂糖（agarose，約占80%）及瓊脂膠（agaropectin）組成。瓊脂糖是由半乳糖及其衍生物構成的中性物質，不帶電荷，而瓊脂膠是一種含硫酸根和羧基的強酸性多糖，由于這些基團帶有電荷，在電場作用下能產生較強的電滲現象。因此，目前多用瓊脂糖為電泳支持物進行平板電泳。

瓊脂糖凝膠電泳常用于分離、鑒定核酸:如重組質粒的鑒定，DNA酶譜制作等。目前一百頁\總數一百一十五頁\編于一點瓊脂糖濃度與DNA分離范圍瓊脂糖濃度/%線狀DNA大小/kb0.5

0.7

1.0

1.2

1.5

2.030-1

12-0.8

10-0.57-0.4

3-0.2

2-0.05目前一百零一頁\總數一百一十五頁\編于一點凝膠的制備與電泳目前一百零二頁\總數一百一十五頁\