環(huán)境污染物的蠶豆根尖微核試驗

環(huán)境污染物的蠶豆根尖微核試驗實驗內(nèi)容隨著工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的迅速發(fā)展，新的化學(xué)物質(zhì)和工業(yè)“三廢”不斷地進(jìn)入人們的生活環(huán)境，它們中有許多可能對遺傳物質(zhì)產(chǎn)生損害并造成致癌、致畸、致突變等遺傳毒理效應(yīng)的環(huán)境致突變物，可對人類健康和生存構(gòu)成嚴(yán)重危害。微核試驗(Themicronucleustest,MNT)是以動植物為材料，采用細(xì)胞生物學(xué)手段，觀測其出現(xiàn)的微核率來表示材料受遺傳損傷程度的一種檢測遺傳毒物的方法。微核是無著絲點(diǎn)的染色體斷片，在有絲分裂后期不能向兩極移動，所以游離于細(xì)胞質(zhì)中，在間期細(xì)胞核形成時，即可在它附近看到一到幾個很小的圓形結(jié)構(gòu)，直徑大約是細(xì)胞直徑的1/20—1/5，這就是微核(micronucleus)。微核是常用的遺傳毒理學(xué)指標(biāo)之一，指示染色體或紡錘體的損傷。由于這種損傷會因細(xì)胞受到的外界誘變因子的作用而加劇，而微核產(chǎn)生的數(shù)量又可與誘變因子劑量的強(qiáng)弱呈正比，因此可以用微核出現(xiàn)的頻率來評價環(huán)境誘變因子對生物遺傳物質(zhì)的損傷程度。蠶豆(VKk拘矗)是一種理想的細(xì)胞遺傳學(xué)研究材料。蠶豆的染色體大，數(shù)量少(2n=12),根尖中含有較多的分裂相細(xì)胞，非常適合顯微觀察，而且蠶豆根尖細(xì)胞周期中的大部分時間對誘變劑敏感，便于遺傳毒性檢測實驗，因此，早在1959年，放射生物學(xué)家已經(jīng)用蠶豆的根尖細(xì)胞來進(jìn)行X射線的遺傳損傷研究。到了上世紀(jì)70年代，蠶豆根尖染色體畸變技術(shù)已發(fā)展得相當(dāng)成熟，作為一種檢測化學(xué)品遺傳學(xué)毒性的方法為人們所知并被廣泛采用。蠶豆根尖微核試驗在1986年已被中國環(huán)保局列為一種環(huán)境生物測試的規(guī)范方法，它作為一種環(huán)境變異的檢測手段，在我國不少地區(qū)的環(huán)保部門和醫(yī)療衛(wèi)生系統(tǒng)中都有廣泛的應(yīng)用。蠶豆根尖微核試驗在對水體污染物、空氣污染物、農(nóng)藥、重金屬、化妝品、工業(yè)化學(xué)品等的致突變性檢測方面，都得到了較廣泛的應(yīng)用，在此僅以農(nóng)藥污染的蠶豆微核實驗為例介紹其相應(yīng)的實驗方法與步驟，學(xué)生在具體開展相關(guān)環(huán)境污染物的蠶豆根尖微核試驗時可參考使用。(一)實驗儀器、試劑和材料實驗材料：蠶豆種子實驗器材光學(xué)顯微鏡試管(10ml)X2蠶豆發(fā)芽盒其它：鑷子、手術(shù)刀、載玻片、蓋玻片、濾紙等。試劑[1]環(huán)磷酰胺：用其與水可溶劑配置系列溶液：0%(對照)，5%，10%，20%?？ㄖZ氏固定液：將乙醇和冰醋酸以3：1（V/V）混和配制；水解分離液：鹽酸與95%酒精1：1混合；改良苯酚品紅染液母液：將3.0g堿性品紅溶解在100ml70%乙醇中，以1:9的比例將其與5%苯酚溶液混和，即得到改良苯酚品紅染液母液。苯酚品紅染液：將45ml母液，6ml冰醋酸，6ml37%甲醛混合均勻。改良苯酚品紅染液：20ml苯酚品紅染液加入180ml45%乙酸和3.6g山梨醇，靜置兩周后使用。（二）實驗方法與步驟蠶豆種子的浸種與催芽浸種準(zhǔn)備好的蠶豆種子，按需要量放入盛有自來水的燒杯中，置于25攝氏度的溫箱中預(yù)熱。如室溫超過25度，即可在室溫下進(jìn)行浸種催芽（約24小時）。催芽待種子吸脹后，用紗布松松包裹置解剖盤或燒杯中，保持濕度，在25攝氏度的溫箱中催芽12h-24h，待種子出生根露出2mm-3mm時，選取發(fā)芽良好的種子，放入鋪有薄薄一層的濕脫脂棉的解剖盤中，仍置于25攝氏度溫箱中繼續(xù)催芽，注意保持濕度。再經(jīng)過36h-48h，種子大部分初生根長至1.5—3.0cm，根尖發(fā)育良好，這時就可用于監(jiān)測水樣或檢測藥物溶液誘變效應(yīng)。染毒與修復(fù)培養(yǎng)每組選擇6-8粒發(fā)芽良好的蠶豆種子，用配制好的不同濃度的農(nóng)藥溶液染毒處理6小時后（使根尖完全浸入處理水樣中，）取出后用蒸餾水沖洗（3次，每次2-3分鐘），并移至蒸餾水中修復(fù)培養(yǎng)22—26小時（蒸餾水浸住根尖）。材料固定借助于物理方法或化學(xué)藥劑的作用，迅速透入組織和細(xì)胞將之殺死，并且使其結(jié)構(gòu)和內(nèi)含物如：蛋白質(zhì)，脂肪，糖類以及核物質(zhì)與細(xì)胞器等，在形態(tài)結(jié)構(gòu)上盡可能保持生活時的完整和真實狀態(tài)，同時更易于染色，可以較清楚的顯現(xiàn)細(xì)胞在生活時不易看清的結(jié)構(gòu)。吸取約5ml卡諾氏固定液于10ml試管中，用刀片或小剪刀切取經(jīng)過處理的長約0.5-1.0cm的幼根，放入試管內(nèi)，用試管塞蓋緊，室溫下固定20-24h，固定液的用量為材料體積的15倍以上。水解分離水解分離的作用是去除細(xì)胞內(nèi)未固定的蛋白質(zhì)，同時使胞間層的果膠類物質(zhì)解體，細(xì)胞分散而易于觀察。用鑷子取固定好的蠶豆根尖，放在試管內(nèi)，加水解分離液2ml，室溫下處理8-20min，倒去水解分離液，再加入固定液2ml，軟化5min，軟化對細(xì)胞壁起腐蝕作用。然后倒去固定液，用蒸餾水反復(fù)沖洗使材料呈白色微透明，以鑷子柄輕壓能壓碎為佳。染色和壓片切取蠶豆根尖分生組織放在載玻片上縱橫切成幾段，放在載玻片上，以十字壓片法覆以載玻片，用鑷子柄或鉛筆頭輕敲幾下，再用拇指用力下壓使細(xì)胞充分分散，注意不要移動玻片，然后分開兩玻片，各滴上1-2滴染液，染色20-30min后加上蓋玻片，注意不要產(chǎn)生氣泡，最后用吸水紙吸去多余染液。6.鏡檢在40X10倍鏡顯微鏡下，凡小于主核1/4以下的，同主核有相同染色效果的，圓形、橢圓形或其他類似的形狀的染色物質(zhì)都可以算作微核。注意事項：經(jīng)過固定的材料如不及