2022骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及其外泌體在終末期肝病治療中的應(yīng)用(全文)

2022骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及其外泌體在終末期肝病治療中的應(yīng)用(全文)終末期肝病(ESLD)以肝功能不能滿足人體的正常生理需求為特征，是各種急、慢性肝損傷所致的晚期階段，主要包括病毒性肝炎、酒精性肝病、自身免疫性肝炎等疾病引起的失代償期肝硬化及肝衰竭。本類疾病病死率高、醫(yī)療負(fù)擔(dān)重，嚴(yán)重危害人民健康。肝移植作為臨床有效治療方法，存在供]。近年來(lái)細(xì)胞療法研究突顯間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)治療肝病的潛在臨床應(yīng)用優(yōu)勢(shì)。MSC可從骨髓、脂肪、臍帶血以及胚胎等組織分離，但不同來(lái)源的MSC的生物學(xué)特性不同。一項(xiàng)研究[2]表明，骨髓來(lái)源MSC遷移能力最強(qiáng)，而這種能力是組織再生修復(fù)過(guò)程中不可或缺的因素。同時(shí)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)具有強(qiáng)大的旁分泌功能，特別是其來(lái)源的外泌體在肝病治療中頗受關(guān)注。本文就BMSC及其外泌體在ESLD中的研究進(jìn)展作一綜述，為進(jìn)一步臨床應(yīng)用研究提供部分參考。BMSC是源于中胚層的成體干細(xì)胞，具有自我更新及多向分化潛能，可在原性低，不易觸發(fā)受體免疫反應(yīng)，BMSC適用于同種異體或自體移植。BMSC可以遷移到受損肝組織并直接分化為肝細(xì)胞，也可旁分泌可溶性因子，如前列腺素E2、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)、吲哚胺2，3-雙加氧酶和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子等以改善肝組織微環(huán)境，促進(jìn)受損肝細(xì)胞修復(fù)[3-4]。外泌體是由細(xì)胞內(nèi)的多泡小體與細(xì)胞膜融合并釋放到細(xì)胞外空間的細(xì)胞外囊泡，直徑40~160nm，是一種新的非細(xì)胞性的信號(hào)傳遞方式。外泌通過(guò)不同的信號(hào)通路誘導(dǎo)靶細(xì)胞活性的改變。外泌體幾乎可由各種細(xì)胞類型分泌和吸收，BMSC是其重要細(xì)胞來(lái)源[5]。與BMSC相比，BMSC來(lái)源外泌體(BMSC-Ex)更容易獲取，不存在免疫排斥反應(yīng)，安全性更好，且送載體。BMSC-Ex向受損肝臟傳遞生物信息，參與調(diào)控肝細(xì)胞再生、肝纖維化與肝臟炎癥損傷等病理生理過(guò)程[6-7]。已有大量臨床研究表明，BMSC移植治療以失代償期肝硬化與肝衰竭為代表的ESLD具有顯著的臨床效果。2.1治療失代償期肝硬化的臨床研究失代償期肝硬化是慢性肝病的終末階段，由于廣泛的肝細(xì)胞壞死與肝組織多種原因引起的失代償期肝硬化具有良好療效。一項(xiàng)臨床試驗(yàn)[9]招募了56例乙型肝炎肝硬化患者，經(jīng)肝動(dòng)脈注入自體BMSC，隨訪24周，共39例患者完成試驗(yàn)，其中移植組20例，對(duì)照組19例。結(jié)果顯示，自體BMSC移植組患者的肝功能、終末期肝病模型(MELD)評(píng)分和Child-Pugh療丙型肝炎肝硬化[10]，經(jīng)肝動(dòng)脈移植治療酒精性肝硬化[11]均能改善患者肝功能并減輕纖維化程度。然而，并非所有研究均呈現(xiàn)BMSC移植對(duì)肝硬化患者有理想療效。如一項(xiàng)隨機(jī)對(duì)照臨床研究[12]招募了27例肝硬化失代償期患者，其中15例患者從外周靜脈注射自體BMSC，12例患者注評(píng)分、MELD評(píng)分、國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比值(INR)變化均無(wú)顯著差異。這可能與BMSC移植的細(xì)胞數(shù)量、移植途徑以及移植前是否預(yù)處理等因素有關(guān)。2.2治療肝衰竭的臨床研究腹水、凝血功能障礙、肝性腦病等為主要表現(xiàn)的一組臨床癥候群。一項(xiàng)隨機(jī)對(duì)照臨床試驗(yàn)[13]經(jīng)外周靜脈輸注自體BMSC治療乙型肝炎相關(guān)肝衰竭存活率(73.2%)顯著高于常規(guī)治療組(55.6%)，且BMSC移植可顯著降低患者血清TBil水平、改善MELD評(píng)分以及降低嚴(yán)重感染的發(fā)生率，提高24周生存率。另有研究[14]對(duì)BMSC進(jìn)行預(yù)處理后注入丙型肝炎相關(guān)肝衰竭患者體內(nèi)觀察其療效。20例患者經(jīng)皮下注射粒細(xì)胞集落刺激因子5d周以上，移植組中54%患者的血清ALT、AST恢復(fù)正常，肝臟合成功能改善。另一項(xiàng)研究[15]將自體BMSC向肝細(xì)胞樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化后移植入體內(nèi)，隨訪6個(gè)月，結(jié)果顯示，BMSC移植可顯著改善肝衰竭患者的腹水、下肢水腫、血清白蛋白含量和Child-Pugh評(píng)分。ESLD的病理學(xué)特點(diǎn)是大量肝組織炎癥壞死及膠原纖維沉積。對(duì)重度肝損減輕肝臟炎癥及抑制肝纖維化進(jìn)程(圖1)。圖1BMSC及其外泌體治療ESLD的作用機(jī)制3.1BMSC促進(jìn)肝細(xì)胞再生肝細(xì)胞作為肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的主要組成部分，負(fù)責(zé)肝臟生物合成、轉(zhuǎn)化、代謝等功能，維持肝臟穩(wěn)態(tài)。持續(xù)的慢性肝損傷造成大量肝細(xì)胞壞死、凋亡，肝細(xì)胞增殖能力嚴(yán)重不足，無(wú)法滿足機(jī)體肝功能需求。因此，有效促進(jìn)肝細(xì)胞再生是治療ESLD的重要途徑。BMSC移植療法促進(jìn)肝再生。如給D-半乳糖胺/脂多糖[16]以及90%肝切除[17]誘導(dǎo)的肝衰竭大鼠注射BMSC，肝組織增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、Ki-67陽(yáng)性染色面積顯著增加，且肝細(xì)胞中β-catenin發(fā)生核易位，上調(diào)原癌基因和細(xì)胞周期蛋白D1(cyclinD1)的表達(dá)，促進(jìn)肝細(xì)胞增殖。這種現(xiàn)象與BMSC歸巢至受損肝臟，通過(guò)直接分化或旁分泌功能促進(jìn)肝細(xì)胞再生有關(guān)。給CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠[18]尾靜脈注射BMSC，綠色熒光蛋白標(biāo)記的BMSC遷移到受損肝臟，肝組織肝細(xì)胞標(biāo)志物Alb的表達(dá)升高。在細(xì)胞因子包括HGF、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、半乳糖凝集素-3或巨噬細(xì)胞集落刺激因子的作用下[3,19-20]，BMSC向肝臟歸巢并分化為肝細(xì)胞樣細(xì)胞的能力增強(qiáng)。BMSC向肝臟歸巢的機(jī)制并未完全闡明，研究[21]表明與SDF-1/CXCR4軸活化有關(guān)。肝損傷時(shí)肝組織SDF-1表達(dá)升高，刺激其受體CXCR4在BMSC表面的表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而介導(dǎo)BMSC遷移至受損肝組織。外泌體是BMSC旁分泌機(jī)制的重要組成部分，發(fā)揮與其母體細(xì)胞類似的生誘導(dǎo)的肝損傷小鼠肝臟，抑制肝細(xì)胞凋亡，同時(shí)促進(jìn)肝組織再生修復(fù)。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)[23]證實(shí)，BMSC-Ex通過(guò)自噬途徑抑制肝細(xì)胞凋亡，顯著降低促凋亡蛋白Bax和cleavedcaspase-3的表達(dá)，而上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平。同時(shí)，可誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷模型中G0期肝細(xì)胞重新進(jìn)入G1期，顯著上調(diào)cyclinD1和PCNA的表達(dá)，加速肝細(xì)胞再生周期[24]。3.2BMSC抑制肝纖維化進(jìn)展肝纖維化是響應(yīng)慢性肝損傷的病理變化，是失代償期肝硬化的重要病理基礎(chǔ)。肝損傷刺激肝星狀細(xì)胞(HSC)活化，并轉(zhuǎn)分化為表達(dá)α-SMA的肌成纖發(fā)揮顯著的抗肝纖維化作用。這種作用主要?dú)w結(jié)于BMSC可抑制HSC活化并誘導(dǎo)活化的HSC凋亡。在采用TGFβ1誘導(dǎo)人HSC活化細(xì)胞模型[26]中觀察到，BMSC干預(yù)后，HSC的活化能力顯著減弱，且α-SMA和Ⅰ型膠原的表達(dá)顯著下降。BMSC可通過(guò)調(diào)控多條信號(hào)通路作用于HSC發(fā)揮抗肝纖維化作用。給硫代乙酰胺誘導(dǎo)的肝硬化大鼠移植BMSC后，肝組織TGFβ1及其下游受體Smad3的表達(dá)水平顯著降低，且α-SMA的表達(dá)減少，提示BMSC可通過(guò)調(diào)控TGFβ/Smad信號(hào)通路抑制HSC活化進(jìn)而改善肝纖維化[27]。NADPH氧化酶是自由基(ROS)的主要來(lái)源，ROS參與肝纖維化病理過(guò)程。BMSC降低HSC中ROS的標(biāo)志物4-HNE與NOX的亞型p47phox的表達(dá)，通過(guò)調(diào)控NADPH氧化酶通路抑制HSC活化[26]。另外，細(xì)胞外基質(zhì)的合成與降解受基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)和金屬蛋P下調(diào)肝組織TIMP-1的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)降解[28]。BMSC-Ex也能有效干預(yù)HSC活化環(huán)節(jié)，阻止肝纖維化進(jìn)展。在CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠模型[29]中，人來(lái)源BMSC-Ex能抑制HSC中Wnt/β-catenin通路信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，減少HSC增殖、活化，從而減輕肝纖維化。此外，外泌體可作為信號(hào)遞送載體在細(xì)胞間傳遞。通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染環(huán)狀DNAcircDIDO1進(jìn)入BMSC中，隨后circDIDO1成功包裝到BMSC-Ex內(nèi)，分離攜帶circDIDO1的BMSC-Ex并與LX2細(xì)胞共孵育，發(fā)現(xiàn)BMSC-Ex介導(dǎo)的circDIDO1轉(zhuǎn)移通過(guò)上調(diào)PTEN以抑制AKT信號(hào)通路活性，從而抑制HSC的活化[30]。3.3BMSC參與免疫調(diào)控BMSC具有強(qiáng)大的調(diào)控免疫的能力，通過(guò)改善肝臟免疫細(xì)胞狀態(tài)，抑制促炎因子分泌，減輕肝臟炎性損傷。巨噬細(xì)胞是固有免疫的主要參與者，通常認(rèn)為M1型巨噬細(xì)胞具有促炎作用，而M2型巨噬細(xì)胞具有抗炎作用。在CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠模型[31]中，BMSC干預(yù)后促進(jìn)巨噬細(xì)胞向肝損傷小鼠后，M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量增多，且血清IL-10水平上調(diào)并刺激信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3的磷酸化，進(jìn)而降低肝組織TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞也可調(diào)控Hedgehog/SMO/Gli1通路和Notch1信號(hào)發(fā)揮抑制炎癥作用，BMSC上的CD47和巨噬細(xì)胞中SIRPα直接結(jié)合可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞Gli1和Notch1胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(NICD)的核易位，而NICD與Gli1相互作用并調(diào)節(jié)其靶基因Dvl2，進(jìn)而抑制NLRP3炎癥小體驅(qū)動(dòng)的炎癥反應(yīng)[33]。T淋巴細(xì)BMSC抑制肝臟T淋巴細(xì)胞向CD4+亞型分化，進(jìn)而降低血清促炎因子與Becn1-shRNA慢病毒載體轉(zhuǎn)染的BMSC也顯示出抑制CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞的增殖能力[36]。此外，將肝臟脫細(xì)胞生物支架植入大鼠體內(nèi)，外周靜脈輸注BMSC后能減輕中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和纖維組織形成，但這作用僅能維持2周左右[37]。性肝損傷環(huán)境下，肝臟血管內(nèi)皮黏附分子1表達(dá)升高，招募中性粒細(xì)胞與CD8+T淋巴細(xì)胞，促進(jìn)膽道周?chē)仔該p傷以及纖維化；而B(niǎo)MSC-Ex可降低血管內(nèi)皮黏附分子1的表達(dá)，減少免疫細(xì)胞浸潤(rùn)，保護(hù)肝臟免受炎癥損傷[38]。另外，外泌體包含的miRNA是其發(fā)揮作用的重要生物活性物質(zhì)之一。研究[39]發(fā)現(xiàn)使用慢病毒轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)miR-223的BMSC-Ex能夠改善小鼠肝功能與肝組織炎性損傷，且顯著降低肝組織NLRP3和Caspase-1的表達(dá)，而抑制BMSC-Ex中miR-223的表達(dá)后其治療作用消失，提示BMSC-Ex中miR-223通過(guò)抑制NLRP3炎癥小體信號(hào)通路發(fā)揮抗炎作用。4、中醫(yī)藥聯(lián)合BMSC移植干預(yù)ESLD的作用BMSCESLD，常用方法如基因編輯技術(shù)、細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子對(duì)BMSC進(jìn)行預(yù)處理，但是基因重編程具有潛在的安全風(fēng)險(xiǎn)。值得關(guān)注的是，已有研究[41-42]表明中醫(yī)藥能促進(jìn)BMSC增殖分化能力，且具有低成本、安全性高的優(yōu)點(diǎn)，有望開(kāi)發(fā)成為潛在的BMSC移植的輔助治療投入應(yīng)用。如BMSC聯(lián)用一貫煎[43]、鱉甲煎丸[44]、濟(jì)生腎氣丸[45]均能改善CCl4誘導(dǎo)的肝硬化大鼠肝功能，減輕肝纖維化，兩者聯(lián)用的效果優(yōu)于單用BMSC移植。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)中藥復(fù)方及其有效成分可增強(qiáng)BMSC歸巢至受損肝臟并分化為肝細(xì)胞的能力。如在CCl4誘導(dǎo)的肝硬化大鼠模型[41]中，柔肝化纖顆粒聯(lián)用BMSC移植組肝組織內(nèi)綠色熒光蛋白標(biāo)記的BMSC數(shù)量明顯多于單用BMSC移植組。體外采用蟲(chóng)草多糖含藥血清培養(yǎng)大鼠BMSC，發(fā)現(xiàn)蟲(chóng)草多糖組7天時(shí)細(xì)胞可見(jiàn)AFP的表達(dá)，14天時(shí)細(xì)胞表達(dá)CK18與Alb，提示蟲(chóng)草多糖能誘導(dǎo)BMSC向肝細(xì)胞分化[42]。課題組前期采用膽管結(jié)扎誘導(dǎo)大鼠膽汁淤積性肝纖維化模型，發(fā)現(xiàn)肝臟Notch信號(hào)通路活化并促進(jìn)肝祖細(xì)胞向膽管上皮細(xì)胞分化，伴隨Notch信號(hào)通路的負(fù)向調(diào)節(jié)因子Numb表達(dá)水平降低，阻斷Notch信號(hào)可抑制肝纖維化進(jìn)展[46]。黃芪湯干預(yù)可顯著抑制Notch信號(hào)的活化及肝纖維化進(jìn)展，并顯著提高Numb的表達(dá)水平[47]。進(jìn)一步在膽管結(jié)扎的同時(shí)將BMSC和Numb敲減的BMSC(BMSCNumb-KD)經(jīng)脾臟注射大鼠肝內(nèi)，發(fā)現(xiàn)BMSC移植可顯著降低肝組織膠原沉積，并抑制膽管反應(yīng)和HSC活化，提示BMSC移植可抑制膽汁性肝纖維化進(jìn)展；而B(niǎo)MSCNumb-KD移植后，可見(jiàn)其主要分化為膽管上皮細(xì)胞，促進(jìn)膽管反應(yīng)及肝纖維化進(jìn)展，BMSCNumb-KD細(xì)胞移植后再給予黃芪湯干預(yù)，盡管肝纖維化程度有所的表達(dá)水平等均顯著高于BMSC和黃芪湯單用組，提示Numb可能是黃芪湯抗膽汁性肝纖維化的潛在作用靶點(diǎn)[48]。5問(wèn)題與展望BMSC及其外泌體治療ESLD具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，尤其是大部分臨床試驗(yàn)均顯示出BMSC移植的安全性與有效性。但仍有一些研究報(bào)道在體外培養(yǎng)BMSC時(shí)會(huì)發(fā)生染色體畸變致瘤[49]，且長(zhǎng)期體外培養(yǎng)會(huì)降低BMSC增殖與分