體外評價(jià)體系介紹

化妝品檢驗(yàn)中心體外評價(jià)體系簡介體外評價(jià)體外評價(jià)是指在活生物體之外的環(huán)境中利用細(xì)胞、模擬活生物體模型等平臺進(jìn)行的評價(jià)。在生物評價(jià)領(lǐng)域中，體外評價(jià)具有以下方面的特點(diǎn)1、符合“3Rs”原則（Reduction，Refinement、Replacement）2、檢測結(jié)果的穩(wěn)定性好、再現(xiàn)性高3、可為臨床評價(jià)提供有效的技術(shù)支持體外評價(jià)體系的構(gòu)成評價(jià)項(xiàng)目的確立1評價(jià)內(nèi)容的分析2評價(jià)方案的建立3最佳評價(jià)平臺及方法的篩選4安全性評價(jià)5功效性評價(jià)6評價(jià)結(jié)果7安全性評價(jià)項(xiàng)目1、刺激性評價(jià)作為動物刺激性實(shí)驗(yàn)的代替法，使用3T3細(xì)胞分析評價(jià)被檢物質(zhì)的毒性指標(biāo)。兔角膜細(xì)胞SIRC2、眼粘膜刺激性評價(jià)向兔角膜細(xì)胞SIRC添加被檢物質(zhì)，確認(rèn)刺激性效果，再與標(biāo)準(zhǔn)品對比進(jìn)行刺激性強(qiáng)度的評價(jià)3、細(xì)胞毒性評價(jià)向細(xì)胞添加被檢物質(zhì)，確認(rèn)其對細(xì)胞的損傷情況，判斷其毒性作用。4、光毒性評價(jià)（UV照射）對經(jīng)過被檢物質(zhì)處理過的BALB/c3T3小鼠成纖維細(xì)胞進(jìn)行UVA照射后，以細(xì)胞攝取中性紅為指標(biāo)測算出細(xì)胞存活率，確定50%細(xì)胞毒性的被檢物質(zhì)濃度（TC50）。通過UVA（+）、UVA（-）照射時(shí)的TC50應(yīng)用下列公式計(jì)算出PIF值（PhotoIrritantFactor）、MPE值可對被檢物質(zhì)的光毒性潛能進(jìn)行評價(jià)?？梢詫我怀煞趾统善愤M(jìn)行評價(jià)。UVA(-)UVA(+)樣品濃度增加細(xì)胞生存率降低1、抗氧化應(yīng)激作用評價(jià)氧化應(yīng)激（OxidativeStress，OS）是指破壞了強(qiáng)氧化劑和抗氧化劑的平衡導(dǎo)致的潛在傷害，氧化劑、抗氧化劑平衡的破壞是細(xì)胞損傷的主要原因。皮膚作為機(jī)體最外層的保護(hù)層，不可避免的受到紫外線與刺激物的作用，使皮膚細(xì)胞內(nèi)的活性氧（ReactiveOxygenSpecies,ROS）過多增加，誘發(fā)氧化應(yīng)激作用，成為引起人體細(xì)胞老化的潛在因素。功效性評價(jià)項(xiàng)目人體皮膚細(xì)胞中氧化應(yīng)激作用的形成原因①紫外線照射（UVA、UVB）②過多活性氧的累計(jì)（?

OH、O2-?、H2O2、1O2

）③過氧化脂質(zhì)（氧自由基與多聚不飽和脂肪酸反應(yīng)的產(chǎn)物）抗氧化應(yīng)激作用的評價(jià)評價(jià)方法：對細(xì)胞進(jìn)行氧化應(yīng)激刺激，添加被檢物質(zhì)，通過對細(xì)胞生存率的分析來評估被檢物質(zhì)對氧化應(yīng)激作用的預(yù)防與治療作用。評價(jià)項(xiàng)目：評價(jià)消除由下列因素誘發(fā)的氧化應(yīng)激作用的效果①UVA、UVB照射②抗活性氧（?

OH、O2-?、H2O2、1O2

）③過氧化脂質(zhì)評價(jià)平臺：正常人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞正常人體皮膚成纖維細(xì)胞被檢物質(zhì)添加時(shí)間點(diǎn)：氧化應(yīng)激刺激前氧化應(yīng)激刺激中氧化應(yīng)激刺激后角質(zhì)形成細(xì)胞成纖維細(xì)胞2、抗衰老作用評價(jià)皮膚的衰老通常分為內(nèi)在性老化和外源性老化。內(nèi)在性老化見于暴露和非暴露部位，明顯的特征為皺紋和皮膚松弛，表現(xiàn)為表皮、真皮變薄，表皮真皮連接處變平、彈性纖維和膠原纖維減少等情況。外源性老化主要發(fā)生在皮膚內(nèi)在性老化的基礎(chǔ)上，常由紫外線等引起，見于面部、頸脖和前臂等光暴露部位，表現(xiàn)為粗深的皺紋、異常的色素沉著、毛細(xì)血管擴(kuò)張等。

抗衰老是國內(nèi)外美容皮膚病學(xué)研究的熱門主題，對于抗衰老作用的評價(jià)，本實(shí)驗(yàn)室采用國際通用綜合評價(jià)模式（體外評價(jià)+人體評價(jià)）。在體外對被檢物質(zhì)的抗衰老效果進(jìn)行評價(jià)，取得的評估結(jié)果可為人體評價(jià)提供參考依據(jù)。評價(jià)平臺：正常人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞正常人體皮膚成纖維細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)檢測①促進(jìn)膠原蛋白合成作用評價(jià)表皮基底層真皮皮膚基底層附近膠原蛋白示意圖4型膠原蛋白7型膠原蛋白1型膠原蛋白1型膠原蛋白：存在于真皮的細(xì)胞外基質(zhì)中，形成三股螺旋結(jié)構(gòu)4型膠原蛋白：多數(shù)存在于真皮與表皮之間的基底層中，起到支撐基底層結(jié)構(gòu)的作用7型膠原蛋白：以環(huán)狀結(jié)構(gòu)與基底層相連接，維持真皮基質(zhì)的結(jié)構(gòu)對被檢物質(zhì)是否能提高人體皮膚成纖維細(xì)胞的1型膠原蛋白合成作用進(jìn)行評價(jià)。伴隨年齡的增加及外界環(huán)境的影響，皮膚內(nèi)的1型膠原蛋白含量會減少，從而形成皺紋和皮膚松弛。本評價(jià)項(xiàng)目，通過向人體皮膚成纖維細(xì)胞添加被檢物質(zhì)后，測定細(xì)胞內(nèi)1型膠原蛋白合成量（ELISA法），根據(jù)結(jié)果評定被檢物質(zhì)是否具有促進(jìn)膠原蛋白合成的作用。②膠原酶活性阻礙作用膠原酶是一種能水解膠原蛋白的三維螺旋結(jié)構(gòu)的分解酶。體內(nèi)膠原酶會隨年齡的增加以及外界環(huán)境的作用下，促進(jìn)其活性的增加，從而加速其對膠原蛋白的分解，破壞皮膚結(jié)構(gòu)，出現(xiàn)皺紋、皮膚松弛等皮膚衰老跡象。讓膠原酶與添加了被檢物質(zhì)的膠原蛋白反應(yīng)，測定膠原蛋白的分解程度，通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析被檢物質(zhì)是否具有阻礙膠原酶活性增加的作用，評估被檢物質(zhì)的衰老作用。③彈性蛋白酶阻礙作用彈性蛋白酶作用是分解維持肌膚張力的彈性蛋白。隨著年齡增加、過多活性氧的堆積促進(jìn)彈性蛋白酶分解彈性蛋白，是形成皮膚衰老的因素之一。因此，阻礙彈性蛋白酶活性，可恢復(fù)肌膚張力，起到抗衰老的作用。讓彈性蛋白酶與添加了被檢物質(zhì)的彈性蛋白反應(yīng)，測定彈性蛋白的分解程度，通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析被檢物質(zhì)是否具有阻礙彈性蛋白酶活性增加的作用，評估被檢物質(zhì)的衰老作用。④促進(jìn)玻尿酸合成作用評價(jià)玻尿酸是一種高分子的多醣體，是由葡萄醛酸-N-乙酸氨基葡萄糖為雙糖分子單位組成的直鏈高分子多醣，平均分子量介于10萬到1000萬Dalton之間，存在于人體皮膚組織中，填充在細(xì)胞與膠原纖維的空間中。具有保持皮膚彈性功能，鎖住大量水分子，對組織具有保濕潤滑作用，使肌膚飽滿年輕有彈性。但隨著老化及年齡的增長，玻尿酸流失速度比生長速度快時(shí)，肌膚也逐漸變得缺乏水分，失去光澤彈性，出現(xiàn)皺紋等老化現(xiàn)象。本評價(jià)項(xiàng)目，通過向人體皮膚成纖維細(xì)胞或人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞添加被檢物質(zhì)后，測定細(xì)胞內(nèi)玻尿酸合成量（ELISA法），根據(jù)結(jié)果評定被檢物質(zhì)是否具有促進(jìn)玻尿酸合成的作用。3、美白作用評價(jià)美白是指抑制由紫外線照射所生成的黑色素，防止色斑的產(chǎn)生，恢復(fù)肌膚的原本色澤。黑色素是存在于人體皮膚基底層，在紫外線照射下會產(chǎn)生變化，生成一種保護(hù)皮膚的物質(zhì)，然后黑色素又經(jīng)細(xì)胞代謝，逐步到達(dá)肌膚表皮層，形成色斑和色素沉淀等問題。美白化妝品可排除皮膚細(xì)胞中積累的過多黑色素，具有淡化色斑、色素沉淀的作用。美白作用評價(jià)是通過多種美白評估法，分析美白成分、美白產(chǎn)品對由紫外線引起的色斑的改善效果以及色素沉淀的抑制效果，客觀、有效的評價(jià)其美白功效色素沉淀及色斑生成示意圖①黑色素生成抑制作用黑色素細(xì)胞受到紫外線照射后，啟動人體保護(hù)機(jī)制生成黑色素，黑色素吸收紫外線的作用避免皮膚細(xì)胞受到損傷。但持續(xù)的照射促進(jìn)了黑色素細(xì)胞活性，導(dǎo)致生成了過量的黑色素，從而在皮膚上形成了色素沉淀與色斑。因此，化妝品成分、產(chǎn)品的黑色素生成抑制作用是評價(jià)其美白功效的重要參數(shù)之一。本評價(jià)項(xiàng)目，將被檢驗(yàn)物質(zhì)添加到黑色素瘤細(xì)胞培養(yǎng)，測定黑色素瘤細(xì)胞生成的黑色素含量，分析其抑制黑色素生成的能力，評估其美白作用的功效。評價(jià)平臺：B16BL6小鼠黑色素瘤細(xì)胞樣品處理后黑色素生成效果樣品濃度小大黑色素抑制效果小大②酪氨酸酶活性阻礙作用酪氨酸酶（Tyrosinase）是黑色素合成的關(guān)鍵酶。對酪氨酸酶活性進(jìn)行阻礙可抑制黑色素的生成。本評價(jià)項(xiàng)目將被檢物質(zhì)與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行酪氨酸酶活性阻礙效果對比，以及被檢物質(zhì)濃度與阻礙效果關(guān)系的分析。黑色素形成途徑以及酪氨酸酶活性作用③黑色素分解作用維生素C的黑色素分解效果實(shí)驗(yàn)操作示意圖持續(xù)受到刺激的黑色素細(xì)胞會生成過多的黑色素，形成色斑與色素沉淀。具有黑色素分解作用的美白化妝品可淡化由黑色素引起的色斑，緩解色素的沉淀。本評價(jià)項(xiàng)目，通過酪氨酸酶的酶作用將酪氨酸合成為黑色素，然后添加被檢物質(zhì)測定其黑色素分解效果，根據(jù)結(jié)果對其黑色素分解能力進(jìn)行評估。4、DN曉A損傷慚修復(fù)嚇作用近評價(jià)①真環(huán)丁嶺烷嘧肺啶二惡聚體訂增加今的抑聾制作班用環(huán)丁倦烷嘧固啶二周聚體惑（Cy恒cl召ob勻ut恭an猛e誘Py憶ri冠mi悲di識ne燦D鳥im巡壽er鄉(xiāng)豐,媽CP縮慧D）是DN童A受UV跨B照射疼后造束成的煙主要豈傷害挨形式記。訊使用仙正常放的人鹿體細(xì)技胞測給試被離檢物等質(zhì)能券否抑唉制由UV摧B照射衡誘發(fā)痛的CP熊D的增劑加，舅從而佛評價(jià)天其DN獨(dú)A損傷蛙修復(fù)員的作混用。皮膚拿在UV堤B照射脫作用痛下，DN掙A分子寨吸收盡光能噴量后擇，造慢成DN只A損傷烏。如長不及岡時(shí)修罰復(fù)受嘆損DN睛A，會屯引起DN薯A結(jié)構(gòu)良的變相化，次阻礙DN頓A的復(fù)崗制和徐轉(zhuǎn)錄川。誘購發(fā)機(jī)練體的放光老浙化，腹嚴(yán)重氣者導(dǎo)粉致皮鄭膚癌懲。CP秒D結(jié)構(gòu)盈式②CO倍ME是T娘As幫sa痛y（彗浙星測飄定）CO踏ME芹T腦As勢sa油y（彗幸星測珍定）躺也稱臣為單透細(xì)胞亦凝膠糠電泳膜測定促技術(shù)美，它濟(jì)是一杜種敏夜感單犬鏈或團(tuán)雙鏈DN甩A突變而和破踐損的齡遺傳鈴測定盾方法吼。DN劃A發(fā)生閣解螺株旋，闊損傷王的DN梅A斷鏈但及片槽段被嶺釋放印出來礦，由心于這挺些DN夏A的分鞭子量郵很小掌，所每以在茫電泳畢過程沃中會筋離開廁核DN翼A向陽愈極移移動，淹形成羅彗星打狀的孫圖像眠，而鳴未損括傷的DN進(jìn)A部分未保持帆球形賀。DN偵A受損田越嚴(yán)蹤蝶重，仆產(chǎn)生輝的斷暫片越濃多并芒且片爽段越眠小，量電泳岔時(shí)遷將移的DN肅A量也仔就越鼠大，梨遷移胡距離講越長嘗，熒著光顯蘇微鏡員下可口觀察者到尾水長增繞加、恥尾部受熒光更強(qiáng)度您增強(qiáng)限?？稍杏糜贒N振A損傷顆預(yù)防米及修滴復(fù)作虛用的蔑評價(jià)匙。UV揮B照射呀后樣品CO臘ME定T諒As葵sa戰(zhàn)y結(jié)果三維酸仿真所皮膚車組織誓模型三維士仿真目皮膚蓮是由逮正常芳人體位成纖降維細(xì)底胞與飛人體擋角朊址細(xì)胞拴構(gòu)成曠，可鋤作為窩代替瓣動物珍實(shí)驗(yàn)蒙的仿付真皮路膚組寺織。主要或應(yīng)用瓜于醫(yī)咸藥制午品、仗食品四、化低妝品疾等成濟(jì)分的寇刺激化性、憶急性虛毒性磁、美例白效傘果的凝