生物催化劑的修飾與改造

關(guān)于生物催化劑的修飾與改造第1頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月

第一節(jié)酶化學(xué)修飾及修飾目的一、酶化學(xué)修飾

1.限制酶大規(guī)模應(yīng)用的原因：

1)細胞外穩(wěn)定性差；

2)酶活性不夠高；

3)具有抗原性。

第2頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月2.改變酶特性有兩種主要的方法：

1)通過分子修飾的方法來改變已分離出來的天然酶的活性。

2)通過基因工程方法改變編碼酶分子的基因而達到改造酶的目的。第3頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月3.酶化學(xué)修飾的概念酶的化學(xué)修飾（chemicalmodification）：通過化學(xué)基團的引入或除去，使蛋白質(zhì)共價結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。酶選擇性化學(xué)修飾：描述肽鏈側(cè)鏈基團被化學(xué)試劑專一性地修飾。第4頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月二、酶化學(xué)修飾的目的1.研究酶的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。（50年代末）2.人為改變天然酶的某些性質(zhì)，擴大酶的應(yīng)用范圍。（70年代末之后）1）提高酶的生物活性（酶活力）。過氧化氫酶用右旋糖酐修飾后，在有機溶劑中的溶解性和酶活性也得到提高，如在三氯乙烷中酶活是天然酶的200倍，在水溶液中酶活是天然酶的15-20倍。

第5頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月2）增強酶的穩(wěn)定性（熱穩(wěn)定性）。α-胰凝乳蛋白酶表面的氨基修飾成親水性更強的-NHCH2COOH后，該酶抗不可逆熱失活的穩(wěn)定性在60°可提高1000倍。這種穩(wěn)定的酶能經(jīng)受滅菌的極端條件而不失活。

3）消除抗原性（針對特異性反應(yīng)降低生物識別能力）。4）產(chǎn)生新的催化能力。木瓜蛋白酶用黃素共價結(jié)合修飾后，蛋白酶變成氧化還原酶。第6頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月

第二節(jié)酶化學(xué)修飾的原理一、如何增強酶天然構(gòu)象的穩(wěn)定性與耐熱性

修飾劑分子存在多個反應(yīng)基團，可與酶形成多點交聯(lián)。使酶的天然構(gòu)象產(chǎn)生“剛性”結(jié)構(gòu)。二、如何保護酶活性部位與抗抑制劑大分子修飾劑與酶結(jié)合后，產(chǎn)生的空間障礙或靜電斥力阻擋抑制劑，“遮蓋”了酶的活性部位。第7頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月三、如何維持酶功能結(jié)構(gòu)的完整性與抗蛋白水解酶酶化學(xué)修飾后通過兩種途徑抗蛋白水解酶：1.大分子修飾劑產(chǎn)生空間障礙阻擋蛋白水解酶接近酶分子?！罢谏w”酶分子上敏感鍵免遭破壞。2.酶分子上許多敏感基團交聯(lián)上修飾劑后，減少了受蛋白水解酶破壞的可能性。第8頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月四、如何消除酶的抗原性及穩(wěn)定酶的微環(huán)境1.酶蛋白氨基酸組成的抗原決定簇，與修飾劑形成了共價鍵。破壞了抗原決定簇——抗原性降低乃至消除“遮蓋”了抗原決定簇——阻礙抗原、抗體結(jié)合2.大分子修飾劑本身是多聚電荷體，能在酶分子表面形成“緩沖外殼”，抵御外界環(huán)境的極性變化，維持酶活性部位微環(huán)境相對穩(wěn)定。第9頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月

第三節(jié)酶化學(xué)修飾的設(shè)計

一、充分認(rèn)識酶分子的特性包括酶的——1.活性部位情況

2.穩(wěn)定條件及反應(yīng)最佳條件

3.側(cè)鏈基團的化學(xué)性質(zhì)及反應(yīng)活潑性第10頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月二、修飾劑的選擇要考慮——

1.修飾劑的分子量及鏈的長度（要求有較大的分子量）

2.修飾劑上反應(yīng)基團的數(shù)目及位置（要求有較多的反應(yīng)活性基團）

3.修飾劑上反應(yīng)基團的活化方法與條件第11頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月三、反應(yīng)條件的選擇要注意——1.酶與修飾劑的分子比例

2.反應(yīng)體系的溶劑性質(zhì)、鹽濃度、pH條件

3.反應(yīng)溫度及時間第12頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月第四節(jié)酶化學(xué)修飾的種類及應(yīng)用

一、酶的表面化學(xué)修飾

（一）大分子修飾（大分子結(jié)合修飾）是目前應(yīng)用最廣的酶分子修飾方法。

1.定義：利用水溶性大分子與酶結(jié)合，使酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些精細的改變，從而改變酶的特性與功能的方法。第13頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月2.修飾劑：聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐（dextran）、肝素（heparin）、蔗糖聚合物（Ficoll）等。修飾方法：修飾前活化，然后在一定條件下與酶分子共價結(jié)合。第14頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月3.應(yīng)用：如：PEG－超氧化物歧化酶（SOD）

PEG－人血紅蛋白

PEG－天門冬酰胺酶（ASNase）降低了抗原性延長了酶在體內(nèi)的半衰期又如：用Dextran修飾-淀粉酶，－淀粉酶，胰蛋白酶、過氧化氫酶，提高了酶的熱穩(wěn)定性。第15頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）小分子修飾（酶蛋白側(cè)鏈基團修飾）定義：采用小分子試劑使酶分子側(cè)鏈上特定的功能基團發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。側(cè)鏈基團：組成蛋白質(zhì)氨基酸殘基上的功能團。主要有：氨基、羧基、胍基、巰基、酚基、咪唑基。側(cè)鏈基團修飾劑：采用的各種小分子化合物。

20種不同氨基酸的側(cè)鏈基團中只有極性氨基酸的側(cè)鏈易被修飾，它們一般具有親核性。第16頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月根據(jù)氨基酸側(cè)鏈R基的極性，20種氨基酸可分成4類。

1.非極性R基氨基酸（共8種）：丙氨酸(Alanine,Ala,A),

亮氨酸(Leucine,Leu,L),

纈氨酸(Valine,Val,V)),

異亮氨酸(Isoleucine,Ile,I),

苯丙氨酸(Phenylalanine,Phe,F),

色氨酸(Tryptophan,Trp,W),

甲硫氨酸(Methionine,Met,M),

脯氨酸(Proline,Pro,P)第17頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月2.無電荷的極性R基氨基酸（共7種）：絲氨酸(Serine,Ser,S),蘇氨酸(Threonine,Thr,T),酪氨酸(Tyrosine,Tyr,Y),半胱氨酸(Cysteine,Cys,C),天冬酰胺(Asparagine,Asn,N),甘氨酸(Glycine,Gly,G),谷氨酰胺(Glutamine,Gln,Q)3.帶正電荷的極性R基氨基酸（共3種）：賴氨酸(Lysine,Lys,K),精氨酸(Arginine,Arg,R),組氨酸(Histidine,His,H)4.帶負(fù)電荷的極性R基氨基酸（共2種）：天冬氨酸(Asparticacid,Asp,D),谷氨酸(Glutamicacid,Glu,E)第18頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月幾種重要的修飾反應(yīng)：烷基化反應(yīng)酰化反應(yīng)氧化還原反應(yīng)芳香環(huán)取代反應(yīng)第19頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月1.化學(xué)修飾反應(yīng)的類型

1)烷基化反應(yīng)試劑特點：烷基上帶活潑鹵素，導(dǎo)致酶分子的親核基團（如－NH2，-SH等）發(fā)生烷基化。可作用基團：氨基（Lys，Arg），巰基（Cys），羧基（Asp、Glu），甲硫基（Met），咪唑基（His）。修飾劑：2，4－二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺等。第20頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月烷基化反應(yīng)第21頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月

2)?；磻?yīng)試劑特點：含有結(jié)構(gòu)，作用于側(cè)鏈基團上的親核基團，使之?；?。可作用基團：氨基，巰基，醇羥基（Ser、Thr），酚羥基（Tyr）第22頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月?；磻?yīng)

第23頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月3)氧化和還原反應(yīng)試劑特點：具有氧化性或還原性。氧化劑：H2O2，N-溴代琥珀酰亞胺可被氧化的側(cè)鏈基團：巰基，甲硫基，吲哚基（Trp）、咪唑基，酚基等。還原劑：2－巰基乙醇、DTT等?？杀贿€原的側(cè)鏈基團：二硫鍵。第24頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月連四硫酸鹽氧化巰基，DTT還原逆回，用于保護巰基。第25頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月

4)芳香環(huán)取代反應(yīng)試劑：鹵（碘）化，硝化試劑。碘代：

I2＋

+HI

硝化：

(NO2)4C++(NO2)3CH

（四硝基甲烷）第26頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月2.特定氨基酸殘基側(cè)鏈基團的化學(xué)修飾1)氨基的化學(xué)修飾：來源：Lys,Arg,His,Gln修飾反應(yīng)：酰基化與烷基化?；揎梽?

三硝基苯磺酸（TNBS）、丹磺酰氯（DNS）烷基化修飾劑：

2，4－二硝基氟苯（DNFB）、碘乙酸、碘乙酰胺、亞硝酸等第27頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月第28頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月2)羧基的化學(xué)修飾修飾羧基的反應(yīng)專一性較差。常用水溶性碳化二亞胺修飾天冬氨酸和谷氨酸?？啥繙y定酶分子中羧基的數(shù)目。

+

水溶性碳化二亞胺第29頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月3)胍基的化學(xué)修飾來源：Arg修飾反應(yīng)：本質(zhì)上是羰基對氨基?；Ｐ揎梽?/p>

丁二酮二羰基化合物

1，2－環(huán)己二酮苯乙二醛第30頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月第31頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月4)巰基的化學(xué)修飾來源：Cys

修飾反應(yīng):烷基化修飾劑：碘乙酸(IAA)

碘乙酰胺(IAM)

E-SH+R-X－>E-SR+HXN-乙基馬來酰亞胺（NEM）（常用的專一修飾巰基試劑）E－SH＋

第32頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月5)二硫鍵的化學(xué)修飾還原：巰基乙醇、二硫蘇糖醇（DTT）第33頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月氧化：過甲酸:Performicacid第34頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月

6)咪唑基的化學(xué)修飾

來源：His

修飾反應(yīng):酰基化與烷基化

?；揎梽?

常用焦碳酸二乙酯（diethylparacarbonate）

++C2H5OH+CO2

烷基化修飾劑：碘乙酸+ICH2COOH+HI第35頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月7）酚羥基的化學(xué)修飾來源：Tyr修飾反應(yīng)：芳香環(huán)取代反應(yīng)修飾劑：碘、硝化試劑（四硝基甲烷）第36頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月8）吲哚基的化學(xué)修飾來源：Trp

修飾反應(yīng)：氧化反應(yīng)修飾劑：

N-溴代琥珀酰亞胺

2-羥基-5硝基芐溴第37頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月氨基酸側(cè)鏈基團修飾劑Lys氨基三硝基苯磺酸、丹磺酰氯；2，4－二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺、亞硝酸Asp、Glu羧基水溶性碳化二亞胺Arg胍基苯乙二醛，1,2－環(huán)己二酮、丁二酮Cys巰基碘乙酸、碘乙酰胺、N-乙基馬來酰亞胺二硫鍵巰基乙醇、DTTHis咪唑基焦碳酸二乙酯、碘乙酸Tyr酚羥基碘、四硝基甲烷Trp吲哚基N-溴代琥珀酰亞胺

各種氨基酸側(cè)鏈的修飾劑第38頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月

但解釋修飾效果須十分小心，因為：①任何一種修飾劑不是絕對專一的。②有些修飾劑引起蛋白質(zhì)構(gòu)象變化——失活，不一定是活性中心基團被共價修飾。③不同部分的相同基團，修飾效果不同，分子內(nèi)部的必需基團，不易被修飾。第39頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月蛋白質(zhì)化學(xué)修飾的局限性化學(xué)修飾的專一性是相對的；酶的構(gòu)象有些改變；化學(xué)修飾只能在具有極性的氨基酸殘基側(cè)鏈上進行。第40頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月（三）交聯(lián)修飾（交聯(lián)法）用雙功能基團試劑(如戊二醛)，與酶分子內(nèi)不同肽鏈部分共價交聯(lián)，使酶分子空間構(gòu)象更加穩(wěn)定。分子間交聯(lián)、分子內(nèi)交聯(lián)（四）固定化修飾（共價偶聯(lián)法）通過酶表面的酸性或堿性殘基，將酶共價連接到惰性載體上，由于酶所處的微環(huán)境發(fā)生改變，使酶的最適pH、最適溫度和穩(wěn)定性發(fā)生改變。第41頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月二、酶分子內(nèi)部修飾（一）蛋白主鏈修飾（肽鏈有限水解修飾）

蛋白主鏈修飾采用酶法（用專一性較強的蛋白酶或肽酶為修飾劑）。（與前面化學(xué)修飾區(qū)別）

第42頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月

酶蛋白的肽鏈被水解后，可能出現(xiàn)以下三種情況中的一種：1引起酶活性中心的破壞，酶失去催化功