實(shí)驗(yàn)原代培養(yǎng)

細(xì)胞原代培養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)與醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆占?xì)胞原代培養(yǎng)的基本方法和無(wú)菌操作技術(shù)。

了解體外培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)變化特征和生長(zhǎng)特點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)原理細(xì)胞培養(yǎng)（cellculture）是從生物體中取出某種器官、組織或細(xì)胞，在體外模擬體內(nèi)生理?xiàng)l件對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)，使之生長(zhǎng)和繁殖的技術(shù)方法。細(xì)胞培養(yǎng)分為原代培養(yǎng)（primaryculture）和傳代培養(yǎng)（secondaryculture）。原代培養(yǎng)是指直接從機(jī)體內(nèi)取材后所進(jìn)行的首次培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)是指原代細(xì)胞增殖到一定密度后，經(jīng)處理，分散轉(zhuǎn)移到其它培養(yǎng)瓶中繼續(xù)的擴(kuò)大培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)的累積次數(shù)即為細(xì)胞的代數(shù)。培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)方式及類型

貼附生長(zhǎng)型細(xì)胞

必須貼附于支持物才能生長(zhǎng)的細(xì)胞。從形態(tài)上大體分為上皮細(xì)胞型及成纖維細(xì)胞型，還有一些難以確定其穩(wěn)定形態(tài)的細(xì)胞。懸浮生長(zhǎng)型細(xì)胞

不需要附著于支持物，在懸浮狀態(tài)下即可生長(zhǎng)。多是來(lái)源于中胚層的細(xì)胞。如來(lái)自血、脾或骨髓的培養(yǎng)細(xì)胞。形形色色的培養(yǎng)瓶器材細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程受溫度、滲透壓、PH值、無(wú)機(jī)鹽、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、生長(zhǎng)因子等諸多因素影響，另外還要求嚴(yán)格的無(wú)菌條件，細(xì)胞培養(yǎng)所需的一切器皿、試劑、實(shí)驗(yàn)材料等都要嚴(yán)格按照規(guī)范進(jìn)行洗刷、消毒。因此，細(xì)胞培養(yǎng)是一種復(fù)雜、條件要求嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。

無(wú)菌操作的嚴(yán)格與否是細(xì)胞培養(yǎng)成敗的關(guān)鍵。實(shí)驗(yàn)預(yù)備★無(wú)菌操作室★消毒（1）物理消毒法：紫外線消毒，干熱消毒，濕熱消毒，過(guò)濾消毒（2）化學(xué)消毒法：來(lái)蘇爾，新潔爾滅，過(guò)氧乙酸，

75%酒精（3）抗生素消毒：適合殺滅不同的微生物，因此多用于培養(yǎng)液消毒。無(wú)菌操作室不同于一般的實(shí)驗(yàn)室，它要求實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部處于嚴(yán)格無(wú)菌狀態(tài)。包括實(shí)驗(yàn)室空氣，操作器械，培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱，工作臺(tái)等，都需要達(dá)到規(guī)定的無(wú)菌要求?！餆o(wú)菌操作室組成：更衣室，緩沖間，操作室。注意：三個(gè)房間之間的兩扇門絕對(duì)不可以同時(shí)敞開(kāi)，否則空氣的對(duì)流會(huì)直接把外界的細(xì)菌等污染物帶入實(shí)驗(yàn)室，或者把實(shí)驗(yàn)室中潛在的危險(xiǎn)物品帶出室外。超凈臺(tái)消毒：將超凈工作臺(tái)用75％酒精擦拭，然后紫外燈照射消毒20min～25min。關(guān)閉紫外燈后，打開(kāi)風(fēng)機(jī)，使工作臺(tái)內(nèi)保持無(wú)菌環(huán)境。注意避免培養(yǎng)細(xì)胞和培養(yǎng)液等受紫外線照射。

洗手：實(shí)驗(yàn)前將兩手洗凈，75％酒精認(rèn)真擦拭，必要時(shí)可一直清洗擦拭到肘部。實(shí)驗(yàn)步驟1、處死乳鼠及消毒在緩沖間中把乳鼠浸入75%酒精中2～3s，帶回超凈工作臺(tái)，點(diǎn)燃酒精燈。用鑷子使乳鼠窒息而死。2、取材用消過(guò)毒的解剖剪取乳鼠內(nèi)臟，放入培養(yǎng)皿中，用PBS溶液漂洗組織2-3次，每次1-2ml，棄廢液。3、剪碎將組織剪碎至0.5～1mm3的小塊，用PBS溶液漂洗2-3次，每次1-2ml，棄廢液。4、接種加入2滴小牛血清，吹打均勻制成懸液。用吸管吸取懸液，均勻排種在培養(yǎng)瓶底壁，并做標(biāo)記。5、培養(yǎng)翻轉(zhuǎn)180°使瓶底向上，加入2ml培養(yǎng)液1640，擰緊瓶蓋后置于恒溫箱中培養(yǎng)30min，再翻轉(zhuǎn)過(guò)來(lái)，加入2ml左右培養(yǎng)液，將瓶蓋調(diào)整在略微松弛狀態(tài)置恒溫箱中培養(yǎng)。6、觀察

3d后對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行觀察。注意事項(xiàng)※一定注意無(wú)菌操作：實(shí)驗(yàn)前：室內(nèi)消毒，無(wú)菌操作臺(tái)消毒，白大衣，口罩，帽子，鞋套，風(fēng)淋，開(kāi)啟無(wú)菌操作臺(tái)。試驗(yàn)中：乳鼠的消毒，手的消毒，“燒”（瓶口，管口，蓋子等），瓶子開(kāi)啟后速度合上，吸管的拿取，雙手始終不能出來(lái)直至實(shí)驗(yàn)