FACSCanto流式細(xì)胞儀原理

BD公司介紹BD公司是由MaxwellW.Becton和FairleighS.Dickinson于1897年在紐約創(chuàng)立的,總部位于美國新澤西州目前一頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點(diǎn)BD公司介紹位居財(cái)富周刊500強(qiáng)的大型跨國公司產(chǎn)品涵蓋諸多醫(yī)療領(lǐng)域生物科學(xué)部:流式細(xì)胞儀及應(yīng)用于生物科學(xué)的試劑、耗材目前二頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點(diǎn)BD公司流式細(xì)胞儀產(chǎn)品FACSVantageSE-大型分選機(jī)FACSAria-高速分選的臺式機(jī)FACSDiva-高速分選的數(shù)字化大型機(jī)目前三頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點(diǎn)BD公司流式細(xì)胞儀產(chǎn)品FACSCount流式細(xì)胞儀FACSCalibur流式細(xì)胞儀FACSCantoII流式細(xì)胞儀目前四頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點(diǎn)BD公司流式細(xì)胞儀產(chǎn)品BDFACSCantoII流式細(xì)胞儀目前五頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點(diǎn)FACSCantoII流式細(xì)胞儀原理目前六頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點(diǎn)流式細(xì)胞儀可告訴我們一個(gè)細(xì)胞的什么指標(biāo)?細(xì)胞的相對大小（前向角散射光信號，F(xiàn)SC）細(xì)胞的相對顆粒性及內(nèi)部結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性（側(cè)向散射光信號，SSC）相關(guān)的熒光強(qiáng)度目前七頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點(diǎn)散射光信號的特征FSC和SSC當(dāng)顆粒通過聚集的激光束時(shí)，激光向各個(gè)方向散射。與激光束方向同軸的稱前向角散射光信號（FSC）。與激光束垂直的稱為側(cè)向角散色光信號（SSC）。488nm激光激發(fā)產(chǎn)生散射光目前八頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點(diǎn)前向角散射光信號FSC目前九頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點(diǎn)側(cè)向角散射光信號SSC目前十頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點(diǎn)散射光信號的特征紅細(xì)胞裂解的全血目前十一頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點(diǎn)熒光信號的特征什么是熒光信號當(dāng)熒光抗體或其他染料染色的顆粒通過激光束時(shí)，染料吸收光子躍遷到高能級，返回基態(tài)時(shí)，染料釋放出能量，大部分以光的形式釋放。這種發(fā)射出的光稱為熒光。目前十二頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點(diǎn)熒光信號的特征發(fā)射光的熒光強(qiáng)度與結(jié)合的位點(diǎn)成正比目前十三頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點(diǎn)信號產(chǎn)生熒光信號目前十四頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點(diǎn)熒光信號的特征常見熒光染料的發(fā)射波長目前十五頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點(diǎn)直方圖顯示熒光信號目前十六頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點(diǎn)點(diǎn)圖顯示熒光信號目前十七頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點(diǎn)什么是流式細(xì)胞儀？在流動的狀態(tài)中檢測細(xì)胞各種物理及生物特征的一種儀器；InjectorTipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheathfluid目前十八頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點(diǎn)流式細(xì)胞儀特點(diǎn)及檢測標(biāo)本特異性強(qiáng)，靈敏度高，速度快，并能實(shí)現(xiàn)多參數(shù)分析；可檢測的樣本種類多樣(1)外周血，骨髓，細(xì)針穿刺，洗脫液，實(shí)體組織，培養(yǎng)細(xì)胞(2)血清、血漿、培養(yǎng)上清、細(xì)胞裂解液目前十九頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點(diǎn)FACSCantoII流式細(xì)胞儀系統(tǒng)組成流式細(xì)胞儀液流車工作站目前二十頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點(diǎn)FACSCanto簡介配置空冷激光兩根激光:488nm、633nm、光路固定，無需調(diào)校液流系統(tǒng)信號檢測系統(tǒng)八角形和三角形光學(xué)收集系統(tǒng)，將光信號轉(zhuǎn)換成電信號電子系統(tǒng)將電信號轉(zhuǎn)換成數(shù)字化信號目前二十一頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點(diǎn)液流系統(tǒng)流動室鞘液工作液，可選PBS、血球稀釋液或蒸餾水。樣本流單細(xì)胞懸液，濃度51051106/mL目前二十二頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點(diǎn)液流系統(tǒng)鞘液是壓力驅(qū)動的。在壓力作用下，鞘液經(jīng)過濾器進(jìn)入流動室下部的小室中。檢測的樣本在壓力的作用下，也進(jìn)入流動室下部的小室中，樣本壓力略大于鞘液的壓力。在鞘液的包裹下，樣本由下向上通過流動室，經(jīng)激光激發(fā)后，樣本中的顆粒被檢測。目前二十三頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點(diǎn)液流系統(tǒng)

-FLOWCELL(流動室)InjectorTip熒光信號聚焦的激光光束鞘液目前二十四頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點(diǎn)液流系統(tǒng)目前二十五頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點(diǎn)液流系統(tǒng)-樣本流速目前二十六頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點(diǎn)樣本流速的選擇高流速：一般用于定性分析，如免疫分型。采集速度快,但分辨率低.低流速：一般用于對分辨率要求較高的分析，如DNA分析。目前二十七頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點(diǎn)光學(xué)系統(tǒng)目前二十八頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點(diǎn)光學(xué)系統(tǒng)染色的細(xì)胞或其他顆粒通過聚焦的激光束時(shí)，會散射激光或熒光。因?yàn)榧す馐且粋€(gè)小斑點(diǎn)，顆粒快速通過流動室，散射光或熒光持續(xù)的時(shí)間非常短-只有幾微秒。這些短暫的光信號被收集、過濾然后被檢測器轉(zhuǎn)換成電信號。目前二十九頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點(diǎn)信號采集系統(tǒng)激光488nm，633nm，激發(fā)樣本中的顆?；蚣?xì)胞產(chǎn)生散射光信號和熒光信號信號檢測組件-八角形和三角形光學(xué)濾片將激光激發(fā)后產(chǎn)生的散射光信號和熒光信號引導(dǎo)至相應(yīng)的PMTPMT-將光信號轉(zhuǎn)換成電信號目前三十頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點(diǎn)常用熒光染料的特性熒光染料激發(fā)波長(nm)發(fā)射波長(nm)用途顏色FITC488525免疫熒光綠色PE(RD1)488575免疫熒光橙色PerCP 488 670免疫熒光深紅APC633 670免疫熒光紅色PI488620DNA染色

橙紅ECD488620免疫熒光橙紅PeCy5488675免疫熒光紅目前三十一頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點(diǎn)

常用熒光染料(488nm,633nm激發(fā))FluoresceinIsothiocyanate(FITC)異硫氰酸熒光素Phycoerythrin(PE)藻紅素Allophycocyanin(APC)異藻藍(lán)蛋白Peridinin-ChlorophyllProtein(PerCP)多甲藻黃素-葉綠素蛋白TandemDyesPE-TexasRed(ECD)PE-Cy5(PC5)PE-Cy5.5(PC5.5)(futures)PE-Cy7(PC7)(futures)目前三十二頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點(diǎn)FACSCantoⅡ信號檢測組件種類八角形三角形構(gòu)成檢測器濾片目前三十三頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點(diǎn)FACSCantoⅡ信號檢測組件八角形檢測組件目前三十四頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點(diǎn)FACSCantoⅡ信號檢測組件三角形檢測組件目前三十五頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點(diǎn)FACSCantoⅡ信號檢測組件檢測器鞘液流中的顆粒通過激光束時(shí)會產(chǎn)生光信號，光信號到達(dá)檢測器生成電脈沖信號，電子系統(tǒng)對電脈沖信號進(jìn)一步處理。FACSCanto兩類檢測器光電二極管：FSC光電倍增管PMT：SSC和熒光信號目前三十六頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點(diǎn)FACSCantoⅡ信號檢測組件光學(xué)濾片用于調(diào)整光譜的分布。當(dāng)光子遇到濾片時(shí)，光子或通過濾片，或被濾片吸收，或被濾片反射。目前三十七頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點(diǎn)FACSCantoⅡ的濾片長通濾片（LP）：長于設(shè)定波長的光通過，并反射短于設(shè)定波長的光目前三十八頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點(diǎn)FACSCantoⅡ的濾片帶通濾片：允許一定帶寬波長的光通過。目前三十九頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點(diǎn)FACSCantoⅡ的濾片目前四十頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點(diǎn)FACSCantoⅡ的濾片目前四十一頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點(diǎn)FACSCantoⅡ電子系統(tǒng)將與電脈沖信號強(qiáng)弱相關(guān)的電壓數(shù)字化有三類電脈沖信號高度信號H面積信號A寬度信號W目前四十二頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點(diǎn)幾個(gè)概念信號放大PMT將光信號轉(zhuǎn)換成電信號，調(diào)整PMT的電壓，信號強(qiáng)度將隨之改變。閾值信號放大過程會產(chǎn)生不需要的脈沖信號，通常來自于碎片。通過設(shè)定某一信號的最低強(qiáng)度值，可將不需要的脈沖信號去除，這一設(shè)定值稱為閾值。目前四十三頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點(diǎn)幾個(gè)概念顏色補(bǔ)償采用合適的方法校正熒光染料之間疊加所造成的誤差。在完成雙色以上熒光標(biāo)記的樣本時(shí)，都需要作顏色補(bǔ)償。目前四十四頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點(diǎn)顏色補(bǔ)償FITC主要由FITC的檢測器檢測，但部分光也會進(jìn)入PE檢測器目前四十五頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點(diǎn)幾個(gè)概念顏色補(bǔ)償帶通濾片接受的是一定帶寬波長的熒光，故會有干擾光同時(shí)被接收，然后一同進(jìn)入PMT進(jìn)行光電轉(zhuǎn)換并放大。目前四十六頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點(diǎn)幾個(gè)概念顏色補(bǔ)償通常干擾光占該染料所發(fā)出熒光總量的X%目前四十七頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點(diǎn)

補(bǔ)償模型圖

目前四十八頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點(diǎn)顏色補(bǔ)償判斷標(biāo)準(zhǔn)

未作顏色補(bǔ)償目前四十九頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點(diǎn)顏色補(bǔ)償判斷標(biāo)準(zhǔn)

補(bǔ)償后目前五十頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點(diǎn)怎樣進(jìn)行顏色補(bǔ)償CompBeads用于流式細(xì)胞儀多色分析時(shí)調(diào)整熒光補(bǔ)償。含兩種微球，抗小鼠/大鼠免疫球蛋白鏈的微球，可與小鼠/大鼠免疫球蛋白的鏈結(jié)合；及陰性對照微球，不與免疫球蛋白結(jié)合。這兩種微球與鼠源性的熒光抗體混合時(shí)，顯示為清晰的陽性群與陰性群（背景熒光），可據(jù)此手動調(diào)整顏色補(bǔ)償。Anti-MouseIg補(bǔ)償微球組合，產(chǎn)品號：552843Anti-RatIg補(bǔ)償微球組合，產(chǎn)品號：552844Anti-Rat/hamsterIg補(bǔ)償微球組合，產(chǎn)品號：552845目前五十一頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點(diǎn)儀器運(yùn)作需要的質(zhì)控品儀器校準(zhǔn)需要微球BDFACS7-ColorSetupBeads（CatNo.335775）補(bǔ)償調(diào)整需要微球BDCompBeadsAnti-MouseIg,(CatNo.552843)BDCompBeadsAnti-RatIg,(CatNo.552844)儀器清潔BDFACSRinse漂白水目前五十二頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點(diǎn)流式細(xì)胞儀的應(yīng)用目前五十三頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點(diǎn)流式細(xì)胞儀可以告訴我們什么？目前五十四頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點(diǎn)細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外發(fā)生了什么事件？目前五十五頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點(diǎn)流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用細(xì)胞生理學(xué)研究細(xì)胞膜表面標(biāo)記胞內(nèi)標(biāo)記細(xì)胞周期分析凋亡分析分選CBA目前五十六頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點(diǎn)細(xì)胞生理學(xué)研究細(xì)胞相對大小和顆粒性胞內(nèi)pH值檢測Ca++流動性檢測膜電勢檢測細(xì)胞活性檢測細(xì)胞活力(增殖能力)的檢測目前五十七頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點(diǎn)細(xì)胞生理學(xué)研究細(xì)胞相對大小和顆粒性分析目前五十八頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點(diǎn)細(xì)胞生理學(xué)研究胞內(nèi)pH值的檢測目前五十九頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點(diǎn)細(xì)胞生理學(xué)研究Ca2+流動性檢測Ca2+是非常重要的細(xì)胞內(nèi)離子，在胞膜到胞漿的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要的作用。細(xì)胞受到刺激后，胞內(nèi)Ca2+濃度會發(fā)生改變。最常用的染料Indo-1excitedatUVFluo-3excitedat488nmFuraredexcitedat488nm目前六十頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點(diǎn)細(xì)胞生理學(xué)研究Ca2+流動性檢測目前六十一頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點(diǎn)細(xì)胞生理學(xué)研究細(xì)胞膜電位的改變超極化的細(xì)胞攝取更多的染料，細(xì)胞總的熒光強(qiáng)度增大；細(xì)胞去極化時(shí)，染料釋放到細(xì)胞外，總的熒光強(qiáng)度減少。染料和試劑DiOC6(3)DiOC5(3)DiOC1(3)DiOC1(5)ValinomycinGramicidinDCCCP目前六十二頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點(diǎn)細(xì)胞生理學(xué)研究細(xì)胞膜電位的改變目前六十三頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點(diǎn)細(xì)胞生理學(xué)研究細(xì)胞活性分析

FluoresceinDiacetate進(jìn)入活細(xì)胞后,被胞內(nèi)酯酶降解,生成熒光底物.活細(xì)胞會發(fā)綠色熒光目前六十四頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點(diǎn)細(xì)胞生理學(xué)研究細(xì)胞活力分析CFSE(CarboxyfluoresceinSuccinimidylester)是一種親脂性染料，可被細(xì)胞膜吸收。細(xì)胞標(biāo)記CFSE后再誘導(dǎo)增殖，分裂后的細(xì)胞將含半量的CFSE，如此可監(jiān)控細(xì)胞分裂的數(shù)目。目前六十五頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點(diǎn)細(xì)胞生理學(xué)研究細(xì)胞活力分析上圖中人T細(xì)胞被標(biāo)記并刺激后，可跟蹤六代的分裂。如果配合使用Modfit軟件分析，可確定每代的細(xì)胞數(shù)。目前六十六頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點(diǎn)細(xì)胞膜表面標(biāo)記CD2CD4CD#=clusterdesignationnumber目前六十七頁\總數(shù)七十八頁\編于十三點(diǎn)細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記胞內(nèi)多種肽類已被成功標(biāo)記，包括病毒顆粒、免疫球蛋白、雌激素受體、細(xì)胞因子、特殊蛋白如Bcl-2和cycl