植物組織培養(yǎng)

關(guān)于植物組織培養(yǎng)第1頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月一、實(shí)驗(yàn)室設(shè)置及儀器設(shè)備實(shí)驗(yàn)室是進(jìn)行組培研究的主要場(chǎng)所，應(yīng)能滿(mǎn)足清洗、培養(yǎng)基制備、儲(chǔ)藏、無(wú)菌操作、培養(yǎng)、鑒定等多方面的工作。（一）實(shí)驗(yàn)室設(shè)置組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室設(shè)置的總體要求：便于隔離便于操作便于滅菌便于觀察第2頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月基本實(shí)驗(yàn)室輔助實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)室組成準(zhǔn)備室緩沖室無(wú)菌操作室培養(yǎng)室細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室溫室生化分析實(shí)驗(yàn)室第3頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1、基本實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)臺(tái)擱架培養(yǎng)架培養(yǎng)架培養(yǎng)架培養(yǎng)架藥品及儀器柜無(wú)菌臺(tái)無(wú)菌臺(tái)擱架拉窗冰箱擱架水槽電爐門(mén)4.5m3.0m3.5m4.0m準(zhǔn)備室緩沖室無(wú)菌室培養(yǎng)室基本實(shí)驗(yàn)室布局平面圖第4頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月組織培養(yǎng)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)室第5頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月緩沖室第6頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月無(wú)菌室（一）第7頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月無(wú)菌室（二）第8頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月培養(yǎng)室第9頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2、輔助實(shí)驗(yàn)室

（1）細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室

其功能是對(duì)培養(yǎng)材料進(jìn)行細(xì)胞學(xué)鑒定和研究。要求清潔、明亮、干燥，使各種光學(xué)儀器不受潮濕和灰塵污染。應(yīng)配置各種顯微鏡、照相系統(tǒng)等。

（2）生化分析室在以培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)物為主要目的的實(shí)驗(yàn)室，應(yīng)建立相應(yīng)的分析化驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室，以便對(duì)培養(yǎng)物的有效成分隨時(shí)進(jìn)行取樣檢查。離心機(jī)、酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀、天平、PCR儀等。第10頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月為試管苗提供滿(mǎn)足生長(zhǎng)的適宜環(huán)境條件。（3）溫室第11頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（二）儀器與設(shè)備1、基本設(shè)備

冰箱

電爐

酸度計(jì)

純水器

天平

培養(yǎng)基分裝器

攪拌器等第12頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月冰箱酸度計(jì)電爐第13頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月天平純水器第14頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月培養(yǎng)基分裝器攪拌器第15頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2、滅菌設(shè)備

蒸汽壓力滅菌鍋

干熱消毒柜

過(guò)濾滅菌裝置

噴霧消毒器

紫外燈第16頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月蒸汽壓力滅菌鍋第17頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月干熱消毒柜第18頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月無(wú)菌瓶頂過(guò)濾裝置噴霧消毒器（參考圖）（參考圖）第19頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3、無(wú)菌操作設(shè)備

超凈工作臺(tái)第20頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月無(wú)菌接種箱第21頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月4、細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備

搖床第22頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月培養(yǎng)架第23頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月HZC-250恒溫振蕩培養(yǎng)箱

150C

250D

光照培養(yǎng)箱

第24頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5、細(xì)胞學(xué)鑒定設(shè)備倒置顯微鏡光學(xué)顯微鏡第25頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1、玻璃器皿（三）培養(yǎng)器皿及實(shí)驗(yàn)用具培養(yǎng)皿三角瓶培養(yǎng)瓶第26頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2、金屬材質(zhì)用具鑷子解剖刀接種針第27頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1、洗滌液的配制二、實(shí)驗(yàn)基本操作技術(shù)（一）洗滌技術(shù)第28頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（1）玻璃器皿洗滌

A、新購(gòu)買(mǎi)的玻璃器皿

表面常附著有游離的堿性物質(zhì)，可先用0.5％的去污劑洗刷，再用自來(lái)水洗凈，然后浸泡在1％～2％鹽酸溶液中過(guò)夜（不可少于四小時(shí)），再用自來(lái)水沖洗，最后用無(wú)離子水沖洗兩次，在100℃～120℃烘箱內(nèi)烘干備用。2、洗滌方法第29頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月先用自來(lái)水洗刷至無(wú)污物，再用合適的毛刷沾去污劑（粉）洗刷，或浸泡在0.5％的清洗劑中超聲清洗（比色皿決不可超聲），然后用自來(lái)水徹底洗凈去污劑，用無(wú)離子水洗兩次，烘干備用（計(jì)量?jī)x器不可烘干）。清洗后器皿內(nèi)外不可掛有水珠，否則重洗，若重洗后仍掛有水珠，則需用洗液浸泡數(shù)小時(shí)后（或用去污粉擦洗），重新清洗。

B、使用過(guò)的玻璃器皿的清洗第30頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月新購(gòu)置玻璃器皿1%稀HCl浸漬12h洗衣粉洗滌清水沖洗烘干備用已用過(guò)的玻璃器皿第31頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（2）塑料器皿的清洗新的塑料器皿打開(kāi)即用已用過(guò)的塑料器皿2%NaOH浸泡12h清水沖洗2%—5%鹽酸浸泡30min清水沖洗蒸餾水沖洗晾干備用第32頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

金屬用品一般不宜用各種洗滌液洗滌（新的可以用熱洗衣粉水洗凈），需要清洗時(shí)，一般用酒精擦洗，然后火焰干燥。

（3）金屬用品洗滌（4）除菌過(guò)濾器洗滌

用清水沖洗后，用洗液沖洗，再用清水沖洗，最后用蒸餾水沖洗，晾干備用。第33頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

（二）滅菌技術(shù)1、滅菌的方法（具體參見(jiàn)第二章）干熱滅菌玻璃器皿、金屬器械濕熱滅菌培養(yǎng)基、蒸餾水、器械、棉塞等熏蒸滅菌接種室、培養(yǎng)室過(guò)濾滅菌液體培養(yǎng)基、蒸餾水藥劑滅菌培養(yǎng)材料燒灼滅菌器械、瓶口、棉塞、包頭紙輻射滅菌

接種室、培養(yǎng)間第34頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月**外植體滅菌流水沖洗10—20min或更長(zhǎng)時(shí)間70%—75%酒精中浸泡30s0.1%—0.2%氯化汞液中浸泡10min左右蒸餾水沖洗4—5次在10%的次氯酸鈉、飽和漂白粉浸泡30min左右備用第35頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月人為因素（工作人員本身）：工作服、帽、口罩、酒精擦手。物品因素器皿和用具培養(yǎng)皿玻璃器皿接種用具培養(yǎng)基：濕熱培養(yǎng)材料外部細(xì)菌：用水沖洗→化學(xué)藥劑處理內(nèi)部細(xì)菌莖尖培養(yǎng)加抗生素：青霉素、利福平操作的空氣：洗刷地板、95%酒精擦超凈工作臺(tái)用化學(xué)試劑薰蒸污染來(lái)源（三）無(wú)菌操作技術(shù)第36頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1、實(shí)驗(yàn)器具和材料的準(zhǔn)備

2、用75%的酒精擦拭超凈工作臺(tái)，然后室內(nèi)及超凈工作臺(tái)用紫外燈殺菌20min-30min。注意：臺(tái)面上的用品不要放置太多或重疊放置，以免降低滅菌效果。

3、關(guān)紫外燈、打開(kāi)風(fēng)機(jī)，過(guò)5-10min進(jìn)入緩沖間，以75%洗手和手臂，更換無(wú)菌服、帽子和口罩。進(jìn)入接種室。（注：沒(méi)有特別情況，盡量不要下工作臺(tái)）

第37頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月4、用70－75％的酒精拭擦臺(tái)面并消毒雙手。試驗(yàn)用具也應(yīng)該用酒精消毒。點(diǎn)燃酒精燈，將金屬器械在其火焰上灼燒，冷卻待用。

注意：所有操作應(yīng)在火焰近處并經(jīng)過(guò)灼燒進(jìn)行。金屬器械不能過(guò)度灼燒，以防退火。移液管不能灼燒，培養(yǎng)瓶口、塑料材料、橡膠材料過(guò)火焰不能時(shí)間太長(zhǎng)。第38頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5、取流水沖洗（至少30min）過(guò)的外植體，用一定的消毒劑浸泡消毒，用無(wú)菌水沖洗3~4次，放入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，置于酒精燈火焰下方，用無(wú)菌的接種器械進(jìn)行分離、切割或其他處理。第39頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月6、打開(kāi)培養(yǎng)瓶，瓶口在燈焰處旋轉(zhuǎn)灼燒，用鑷子將培養(yǎng)材料置于培養(yǎng)基上，灼燒鑷子放回，灼燒瓶口，蓋上瓶塞。

7、用酒精擦洗工作臺(tái)和手。進(jìn)行下一輪操作。第40頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月接種時(shí)在近火焰處打開(kāi)瓶口，使瓶?jī)A斜，以免空氣中微生物落入瓶中。正

確

錯(cuò)

誤第41頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月整個(gè)接種操作應(yīng)在近火焰處進(jìn)行，且動(dòng)作要迅速。正

確

錯(cuò)

誤第42頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月接種過(guò)程中盡可能達(dá)到懸空要求正

確

錯(cuò)

誤第43頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月接種時(shí)不得用手接觸瓶蓋內(nèi)壁或瓶口正

確

錯(cuò)

誤第44頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月瓶蓋朝上放，接種完畢后立即蓋好瓶口正

確

錯(cuò)

誤第45頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月接種完一瓶用火燒用具以防止交叉污染產(chǎn)生

第46頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月接種莖段：注意形態(tài)學(xué)下端插入培養(yǎng)基內(nèi)，而形態(tài)學(xué)上端露于空氣中正

確

錯(cuò)

誤第47頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月用于外植體分離的母體植物材料一般有3種來(lái)源：一是生長(zhǎng)在自然環(huán)境下的植物；二是在溫室控制環(huán)境條件下生長(zhǎng)的植物；三是無(wú)菌環(huán)境下已經(jīng)過(guò)離體培養(yǎng)的植物。（四）外植體的選擇與處理技術(shù)第48頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（1）選擇優(yōu)良的基因型

試驗(yàn)首先要明確目的。例如，蔬菜、作物等的脫毒快繁，是為了脫去病毒，提高產(chǎn)量和質(zhì)量，就應(yīng)選擇當(dāng)?shù)卦耘啻_認(rèn)的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的品種作為脫毒的材料，并且品種一定要可靠?；ɑ?、觀賞植物的快繁，也應(yīng)選擇有價(jià)值的植物。

（2）取材

從生長(zhǎng)旺盛、健壯、無(wú)病蟲(chóng)害的植株上取材。母株代謝旺盛期切取的外植體再生能力強(qiáng)，試驗(yàn)容易成功。1、外植體的選擇第49頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（3）外植體大小選擇

因外植體不同而不同。如利用莖尖培養(yǎng)，莖尖大小對(duì)脫毒效果非常明顯。再如幼胚培養(yǎng)，胚齡也非常重要。（以后具體講）

（4）選擇外植體的時(shí)期

外植體的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)往往與該物種的生長(zhǎng)規(guī)律（生物鐘）有關(guān)。因此，最好在植物生長(zhǎng)的最適宜時(shí)期取材培養(yǎng)，會(huì)得到較好的結(jié)果。

第50頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（1）外植體休眠的處理

有些植物的種子、幼胚、或芽，存在休眠。為了打破休眠，可利用低溫處理，或赤霉素等化學(xué)物質(zhì)處理。因植物不同處理溫度和時(shí)間有所不同。

（2）組織內(nèi)生菌的處理

A.加入抗生素，注意抗生素的用量，高濃度容易造成培養(yǎng)物的死亡。

B.取生長(zhǎng)期旺盛的生長(zhǎng)點(diǎn)部位作為起始培養(yǎng)的外植體。

C.取被內(nèi)生菌污染的培養(yǎng)物的莖尖不停的轉(zhuǎn)接。

2、外植體的處理第51頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月三、培養(yǎng)基的成分及其配制（一）培養(yǎng)基的成分及其作用1、無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)培養(yǎng)的植物組織、器官、細(xì)胞或者原生質(zhì)體需要連續(xù)的供給某些無(wú)機(jī)化學(xué)物質(zhì)，除了C、H、O之外，需要量比較多的元素叫大量元素，需要量比較少的元素叫微量營(yíng)養(yǎng)元素。第52頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月培養(yǎng)基的大量元素使用量一般在每升幾十至幾千毫克。大量元素包括N,P,K,Ca,Mg,S。

培養(yǎng)基中加入量最多的是N，N一般以硝酸鹽或氨鹽，或者兩者結(jié)合的鹽提供。大量元素第53頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月微量元素的用量一般每升不高于幾十毫克。植物所需的微量元素有Fe、Cu、Zn、B、Mo、Mn、Co，Cl。

其他一些化學(xué)藥品常帶有微量元素雜質(zhì)，因此要注意微量元素的用量不能過(guò)多，多會(huì)引起生長(zhǎng)抑制等毒害現(xiàn)象。

微量元素第54頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2、有機(jī)化合物（1）維生素類(lèi)物質(zhì)維生素類(lèi)物質(zhì)在酶系統(tǒng)中有催化功能。硫胺素（VB1）與愈傷組織的產(chǎn)生和生活力有關(guān)，可能是所有植物組織培養(yǎng)初期需要的維生素；而鹽酸吡哆醇（VB6）促進(jìn)根的生長(zhǎng)，煙酸（VB3，又稱(chēng)維生素PP）促進(jìn)胚的發(fā)育。有的配方中還使用了泛酸鈣（VB5）、生物素（VH）、鈷胺素（VB12），VC等。第55頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（2）AA類(lèi)物質(zhì)

絕大多數(shù)AA適量時(shí)對(duì)培養(yǎng)效果都有正向效應(yīng)。常用的有Gly（甘氨酸）、Asn（天冬酰胺）、Gln（谷氨酰胺）。在植物組織培養(yǎng)中，有時(shí)也用水解乳蛋白和水解酪蛋白。

第56頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（3）糖類(lèi)

糖在培養(yǎng)基中的作用：

1）為細(xì)胞提供合成新物質(zhì)的碳骨架

2）為細(xì)胞的呼吸代謝提供底物和能量

3）維持滲透壓

蔗糖是廣泛應(yīng)用的一種碳源。葡萄糖和麥芽糖也是常用的碳源。

第57頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（4）其它有機(jī)物質(zhì)

1）肌醇（環(huán)己六醇）

肌醇可以形成果膠物質(zhì)，是細(xì)胞壁的構(gòu)建物質(zhì)另外還可以形成植酸，與陽(yáng)離子結(jié)合或形成磷脂，參與細(xì)胞膜的組成。利于胚和芽的形成

2）天然有機(jī)物

一些天然的有機(jī)物如椰乳、番茄提取物、酵母提取物、馬鈴薯煮汁也常用于植物組織培養(yǎng)，并表現(xiàn)出了良好的促進(jìn)作用。

第58頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月植物激素是在植物體內(nèi)合成的，對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育有顯著調(diào)節(jié)作用的微量有機(jī)物，而植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑是外源的調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育的物質(zhì)。無(wú)機(jī)元素和有機(jī)營(yíng)養(yǎng)構(gòu)成的培養(yǎng)基僅保證培養(yǎng)物的生存與最低生理活動(dòng)，只有加入植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，才能誘導(dǎo)細(xì)胞分裂、脫分化和再分化。3、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)第59頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（1）生長(zhǎng)素類(lèi)

1）吲哚類(lèi)：IAA（吲哚乙酸）、IBA（吲哚丁酸）、IPA（吲哚丙酸）

2）萘酸類(lèi)：NAA（萘乙酸）

3）苯氧羧酸類(lèi)：2,4-D（2,4-二氯苯氧乙酸）、2,4,5-T（2,4,5-三氯苯氧乙酸）、2,4,5-TP（2,4,5-三氯苯氧丙酸）等。

其中吲哚乙酸在植物體內(nèi)普遍存在，是生理活性最強(qiáng)的生長(zhǎng)素。

第60頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

生長(zhǎng)素的生理作用

1、促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞分裂

2、誘導(dǎo)受傷組織表面細(xì)胞恢復(fù)分裂能力

3、形成愈傷組織，促進(jìn)生根

4、與一定量的細(xì)胞分裂素配合共同誘導(dǎo)不定芽的分化、側(cè)芽的萌發(fā)與生長(zhǎng)、胚狀體的誘導(dǎo)。

第61頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月A：NAA0mg/L，芽（少），根（無(wú)）

B：NAA0.1mg/L，芽（少），根（無(wú)），愈傷組（少量）

C：NAA5.0mg/L，芽（少），根（多），愈傷組織（一定量）

AB

C第62頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（2）細(xì)胞分裂素是一類(lèi)腺嘌呤衍生物。主要有6-芐基氨基嘌呤（6-BA）、玉米素（ZT）等。其中最常用的是6-芐基氨基嘌呤。功能：促進(jìn)細(xì)胞的分裂和分化誘導(dǎo)芽的分化促進(jìn)側(cè)芽的萌發(fā)和生長(zhǎng)抑制衰老第63頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月ABA：BA(0mg/L)，芽（減少），根（增多）愈傷組織（一定量）

B：BA(0.1mg/L)，芽（適量），根（適量）愈傷組織（一定量）

第64頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月控制植物細(xì)胞分化分裂素/生長(zhǎng)素的比例是控制芽和根形成的一個(gè)重要條件比例高時(shí)——產(chǎn)生芽,比例低時(shí)——產(chǎn)生根第65頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月生理作用：

1、誘導(dǎo)莖的細(xì)胞伸長(zhǎng)，對(duì)矮生型植物恢復(fù)成高生型特別有效，對(duì)根無(wú)效。

2、對(duì)形成層的細(xì)胞分化有影響，往往同生長(zhǎng)素有協(xié)同作用。IAA/GA比值高有利于木質(zhì)部的分化，比值低有利于韌皮部的分化。

3、破除種子、鱗莖、塊莖休眠，使之提前萌發(fā)。

4、對(duì)生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的活性有增效作用。

注：不耐熱，應(yīng)采用過(guò)濾滅菌加入。（3）赤霉素（GA3）第66頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月生理作用：

1、抑制蛋白質(zhì)的合成

2、抵消和抑制生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素、GA的作用

3、誘導(dǎo)休眠、促進(jìn)衰老和脫落

（4）脫落酸（ABA）第67頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月以上四種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，前兩類(lèi)用的多，后兩類(lèi)只是補(bǔ)充，對(duì)某些植物有利、對(duì)某些植物不僅沒(méi)有利，還有害，實(shí)際工作中要具體分析。

生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)在生物體內(nèi)存在甚微，濃度很低，一般用ppm表示

1ppm=1mg/L第68頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月(1)固化劑

瓊脂、瓊脂糖（用于原生質(zhì)體、細(xì)胞培養(yǎng)及某些作物的花藥培養(yǎng)）

瓊脂的用量一般在4-10g/L，所購(gòu)回的瓊脂要先試一下它的凝固力，一般只要能穩(wěn)定的凝固就不要多加。瓊脂以顏色淺、透明度好、潔凈的為上品。

(2)懸浮劑

Ficoll（聚蔗糖）

4、固化劑和懸浮劑第69頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1、根據(jù)無(wú)機(jī)鹽的濃度，培養(yǎng)基分為：

（1）高無(wú)機(jī)鹽含量培養(yǎng)基

鉀鹽、銨鹽及硝酸鹽含量較高，微量元素種類(lèi)齊全，比例適當(dāng)，離子平衡性好，具有較強(qiáng)的緩沖性，養(yǎng)分?jǐn)?shù)量及比例比較合適，廣泛用于植物的器官、花藥、細(xì)胞及原生質(zhì)體的培養(yǎng)。主要有MS、LS、BL、BM、ER培養(yǎng)基。（二）培養(yǎng)基的種類(lèi)第70頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（2）高硝態(tài)氮培養(yǎng)基

硝酸鉀含量高，氨態(tài)氮的含量低，含有較高的VB1。主要適合于十字花科植物、單子葉植物的組織和花藥培養(yǎng)。主要有B5、N6、SH培養(yǎng)基。

第71頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（3）中等無(wú)機(jī)鹽含量培養(yǎng)基

大量元素約為MS培養(yǎng)基的一半，微量元素種類(lèi)減少，但含量較MS的高，維生素種類(lèi)比MS多，如增加了生物素、葉酸等。適合于花藥培養(yǎng)，主要有Nitch，NT、H、Miller培養(yǎng)基。第72頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（4）低無(wú)機(jī)鹽含量培養(yǎng)基

大量元素含量大幅度降低而且種類(lèi)減少，有機(jī)含量相對(duì)也很低。多數(shù)用于生根培養(yǎng)基，主要有White、Heller、WS、HE、HB培養(yǎng)基。

第73頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（1）初代培養(yǎng)基

用來(lái)第一次接種外植體的培養(yǎng)基。

（2）繼代培養(yǎng)基

用來(lái)接種繼初代培養(yǎng)物的培養(yǎng)基。2、根據(jù)培養(yǎng)物的培養(yǎng)過(guò)程，培養(yǎng)基分為：第74頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3、根據(jù)其作用不同，培養(yǎng)基分為：

（1）誘導(dǎo)培養(yǎng)基

（2）增殖培養(yǎng)基

（3）生根培養(yǎng)基第75頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月4、根據(jù)其營(yíng)養(yǎng)水平不同，培養(yǎng)基可分為：

（1）基本培養(yǎng)基（就是通常稱(chēng)呼的培養(yǎng)基）

主要有MS、White、N6、B5、改良MS、Heller、Nitsh、SH、Miller等。

（2）完全培養(yǎng)基

就是基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，根據(jù)試驗(yàn)的不同需要，附加一些物質(zhì)，如生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)和其他復(fù)雜有機(jī)物質(zhì)等。第76頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1、無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)成分：一般在現(xiàn)有培養(yǎng)基配方中選擇?？梢詤⒖记叭说慕?jīng)驗(yàn)，例如：MS是廣譜性培養(yǎng)基，N6用于單子葉植物的培養(yǎng)。豆科多用B5培養(yǎng)基。

2、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑：必須進(jìn)行篩選試驗(yàn)。總體原則-當(dāng)誘導(dǎo)愈傷組織形成時(shí)，細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素相對(duì)平衡；誘導(dǎo)芽分化時(shí)，細(xì)胞分裂素水平應(yīng)高于生長(zhǎng)素，誘導(dǎo)根則要低。

3、有機(jī)成分：要根據(jù)培養(yǎng)類(lèi)型考慮，如進(jìn)行器官和組織培養(yǎng)，一般不加復(fù)雜有機(jī)成分，而進(jìn)行細(xì)胞和原生質(zhì)體培養(yǎng)則要加。（三）培養(yǎng)基的篩選第77頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

貯備液（母液）的配制

為什么要配制母液？

1）方便

2）準(zhǔn)確（有些成分量太?。?/p>

（四）培養(yǎng)基的配制第78頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1、大量元素母液的配制

各成分按照表1培養(yǎng)基濃度含量擴(kuò)大10倍，按順序逐步混合。后用蒸餾水定容到1000mL的容量瓶中，即為10倍的大量元素母液。倒入細(xì)口瓶，貼好標(biāo)簽保存于冰箱中。

配制培養(yǎng)基時(shí)，每配1L培養(yǎng)基取此液100mL。第79頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月注意：(1)某些無(wú)機(jī)成分如Ca2+、SO42-、Mg2+和H2PO4-等在一起可能發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生沉淀物。為避免此現(xiàn)象發(fā)生，母液配制時(shí)要用純度高的重蒸餾水溶解，藥品采用等級(jí)較高的分析純，各種化學(xué)藥品必須先以少量重蒸餾水使其充分溶解后才能混合，混合時(shí)應(yīng)注意先后順序。特別應(yīng)將Ca2+、SO42-、Mg2+和H2PO4-等離子錯(cuò)開(kāi)混合，速度宜慢，邊攪拌邊混合。

(2)CaCl2·2H2O要在最后單獨(dú)加入，在溶解CaCl2·2H2O時(shí)，蒸餾水需加熱沸騰，除去水中的CO2，以防沉淀。另外，CaCl2·2H2O放入沸水中易沸騰，操作時(shí)要防止其溢出。

第80頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月２、微量元素母液的配制

MS培養(yǎng)基的微量元素?zé)o機(jī)鹽由7種化合物（除Fe）組成。微量元素用量較少，特別

是

CuSO4·5H2O、

CoCl2·6H2O

，因此在配制中分微量Ⅰ、Ⅱ配制。按照表2，表3配方，用感量為0.0001g的分析天平稱(chēng)量，其它同大量元素。配制培養(yǎng)基時(shí)，每配制1L培養(yǎng)基，取微量Ⅰ10mL，微量Ⅱ１mL。第81頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第82頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3、鐵鹽母液的配制

鐵鹽不是都需要單獨(dú)配成母液，如檸檬酸鐵，只需和大量元素一起配成母液即可。目前常用的鐵鹽是硫酸亞鐵和乙二胺四乙酸二鈉的螯合物，必須單獨(dú)配成母液。這種螯合物使用起來(lái)方便，又比較穩(wěn)定，不易發(fā)生沉淀。配制方法同上，直接用蒸餾水加熱攪拌溶解。配制培養(yǎng)基時(shí)，配制1L取此液10mL。第83頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月在配制鐵鹽時(shí)，如果加熱攪拌時(shí)間過(guò)短，會(huì)造成FeSO4和Na2EDTA鰲合不徹底，此時(shí)若將其冷藏，F(xiàn)eSO4會(huì)結(jié)晶析出。為避免此現(xiàn)象發(fā)生，配制鐵鹽母液時(shí)，F(xiàn)eSO4和Na2EDTA應(yīng)分別加熱溶解后混合，并置于加熱攪拌器上不斷攪拌至溶液呈金黃色(約加熱20-30min)，調(diào)pH值至5.5，室溫放置冷卻后，再冷藏。第84頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月4、有機(jī)母液的配制

MS培養(yǎng)基的有機(jī)成分有甘氨酸、肌醇、煙酸、鹽酸硫胺素和鹽酸吡哆素。培養(yǎng)基中的有機(jī)成分原則上應(yīng)分別單獨(dú)配制。配制直接用蒸餾水溶解，注意稱(chēng)量時(shí)用電子分析天平。并貯存在棕色無(wú)菌瓶中。

配制生物素、葉酸，用稀氨水溶解，然后定容。第85頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月一般植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑母液配制的終濃度以0.5mg/mL為好，需要注意的是：

（１）配制生長(zhǎng)素類(lèi)例如IAA（吲哚乙酸）、NAA（萘乙酸）、2,4-D、IBA（吲哚丁酸），應(yīng)先用少量95%乙醇或無(wú)水乙醇充分溶解，或者用1mol/L的NaOH溶解，然后用蒸餾水定容到一定的濃度。以后者效果好。

（２）細(xì)胞分裂素應(yīng)先用少量95%乙醇或無(wú)水乙醇加3-4滴1mol/L的鹽酸溶解，或直接用1mol/LHCl溶解，再用蒸餾水定容。

（３）GA3(赤霉素)以95%酒精溶解（不耐高溫，過(guò)濾滅菌）

保存在棕色試劑瓶中。

5、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑母液配制第86頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

注意：

所有母液都要貼上標(biāo)簽，注明名稱(chēng)、配制倍數(shù)、日期，所有的母液都應(yīng)保存在0-4℃冰箱中，若母液出現(xiàn)沉淀或霉團(tuán)則不能繼續(xù)使用。第87頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月在培養(yǎng)基的配制過(guò)程中，常需要用氫氧化鉀或氫氧化鈉和鹽酸來(lái)調(diào)整培養(yǎng)基的酸堿度：

（1）1摩爾/升KOH液的配制:稱(chēng)取57.1克KOH,加蒸餾水至1000毫升.

2）1摩爾/升NaOH液的配制:稱(chēng)取40克NaOH,加蒸餾水至1000毫升.

3）1摩爾/升HCl液的配制:取濃鹽酸(比重1.19)、82.5毫升加蒸餾水至1000毫升.配制時(shí)先將濃鹽酸緩緩加入約800毫升的蒸餾水中,然后用蒸餾水補(bǔ)足至1000毫升.第88頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1、計(jì)量

根據(jù)配制培養(yǎng)基的量和母液的濃度計(jì)算需要吸取母液的量，計(jì)算公式：吸取量mL=培養(yǎng)基中物質(zhì)的含量（mg/L）×1000mL/母液濃度（mg/L）。

2、移液

取醫(yī)用瓷缸一只，加入少量的蒸餾水，按照計(jì)算吸取母液的量依次吸取各母液置于醫(yī)用瓷量杯中備用。

培養(yǎng)基配制過(guò)程第89頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月注意：

（1）用量筒或移液管量取培養(yǎng)基母液之前，必須用所量取的母液將量筒或移液管潤(rùn)洗2次。

（2）量取母液時(shí)，不要漏掉或多加。

（3）移液管不能混用。

第90頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3、稱(chēng)取瓊脂、蔗糖備用

4、融化

用搪瓷量杯量取600～700mL的蒸餾水放在電爐上，加入瓊脂，邊加熱邊用玻璃棒攪拌，直到液體呈半透明狀將其取下，加入蔗糖。

大燒杯底的外表面不能沾水，否則加熱時(shí)燒杯容易炸裂，使溶液外溢，造成燙傷。第91頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月5、混合

將融化的瓊脂和母液充分混合，用蒸餾水定容到1000ml，來(lái)回混合幾次。

6、調(diào)pH

用滴管吸取物質(zhì)的量濃度為1mol/L的NaOH或HCl溶液，逐滴滴入溶化的培養(yǎng)基中，邊滴邊攪拌，并隨時(shí)用精密的pH試紙(5.4～7.0)測(cè)培養(yǎng)基的pH，一直到培養(yǎng)基的pH達(dá)到要求為止(在調(diào)制時(shí)要比目標(biāo)pH值偏高0.2～0.5個(gè)單位，因?yàn)榕囵B(yǎng)基在滅菌過(guò)程中由于糖等物質(zhì)的降解，pH值會(huì)下降0.2～0.5個(gè)單位左右)。

第92頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月7、分裝

溶化的培養(yǎng)基應(yīng)該趁熱分裝。注意不要讓培養(yǎng)基沾到瓶口和瓶壁上。錐形瓶中培養(yǎng)基的量約為錐形瓶容量的1/5～1/4。每1L培養(yǎng)基，可分裝20～30瓶。

8、包扎

用封口膜封口，外邊可加一層牛皮紙，扎好繩子，用鉛筆或碳素墨水筆在牛皮紙上寫(xiě)上培養(yǎng)基的代號(hào)。

9、培養(yǎng)基的滅菌第93頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月溫度、光照、濕度等各種環(huán)境條件，培養(yǎng)基組成、pH值、滲透壓等各種化學(xué)環(huán)境條件都會(huì)影響組織培養(yǎng)。四、培養(yǎng)條件的選擇第94頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（一）光照的影響培養(yǎng)中光照是重要的條件之一，主要表現(xiàn)在光強(qiáng)、光質(zhì)、以及光周期等方面：

光周期：黑暗與光照交替的時(shí)間

光強(qiáng)：光照強(qiáng)度

光質(zhì)：光的波長(zhǎng)第95頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月例1：黑暗中培養(yǎng)的煙草花藥，其胚狀體的分化與幼植物的生長(zhǎng)，同經(jīng)光照培養(yǎng)一樣的多

例2：短日照敏感的葡萄品種，它的莖切段，僅在短日照條件下才能分化成根

例3：對(duì)日照不敏感的葡萄品種，可在任何光周期下分化成根

結(jié)論：光周期的需要與否，應(yīng)根據(jù)植物種類(lèi)、培養(yǎng)的目的來(lái)決定

1、光周期對(duì)植物細(xì)胞脫分化和再分化的效應(yīng)第96頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

最常用的周期是16h的光照，8h的黑暗。

愈傷組織誘導(dǎo)階段：一般采用三種做法：全暗、周期性光照、散射性光照。依據(jù)植物種類(lèi)不同做法不同，多數(shù)植物適合全暗或周期性光照。

器官發(fā)生階段：一般給予周期性光照比較好。

離體培養(yǎng)中光周期的調(diào)節(jié)第97頁(yè)，課件共107頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月光照強(qiáng)度對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的增殖和器官的分化有重要影響，從目前的研究情況看，光照強(qiáng)度對(duì)外植體、細(xì)胞的最初分裂有明顯的影響。

一般來(lái)說(shuō)，光照強(qiáng)度較強(qiáng)，幼苗生長(zhǎng)的粗壯；而光照強(qiáng)度較弱，幼苗容易徒長(zhǎng)。

離體培養(yǎng)條件下常用的光量，一般為1000-4000

lx（勒克斯）。離體培養(yǎng)中通常難以達(dá)到4000lx，一般光量在2000-3000

lx。光照強(qiáng)度的高低直接影響器官分化的頻率