基因?qū)嶒?yàn)診斷培訓(xùn)班 分子生物學(xué)在臨床中的應(yīng)用

分子生物學(xué)在臨床中的應(yīng)用天津市第三中心醫(yī)院劉樹業(yè)P

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.Contents分子生物學(xué)簡介分子生物學(xué)的發(fā)展歷史分子生物學(xué)研究的內(nèi)容分子診斷技術(shù)的發(fā)展分子生物學(xué)在臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用P

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.一、分子生物學(xué)是生物學(xué)研究的一個(gè)分支v

分子生物學(xué)（molecularbiology）

從分子水平研究作為生命活動(dòng)主要物質(zhì)基礎(chǔ)的生物大分子結(jié)構(gòu)與功能，從而闡明生命現(xiàn)象本質(zhì)的科學(xué)。重點(diǎn)研究下述領(lǐng)域：（1）蛋白質(zhì)（包括酶）的結(jié)構(gòu)和功能。（2）核酸的結(jié)構(gòu)和功能，包括遺傳信息的傳遞。（3）生物膜的結(jié)構(gòu)和功能。（4）生物調(diào)控的分子基礎(chǔ)。（5）生物進(jìn)化。分子生物學(xué)是第二次世界大戰(zhàn)后，由生物化學(xué)、遺傳學(xué)、微生物學(xué)、病毒學(xué)、結(jié)構(gòu)分析及高分子化學(xué)等不同研究領(lǐng)域結(jié)合而形成的一門交叉科學(xué)。目前分子生物學(xué)已發(fā)展成生命科學(xué)中的帶頭學(xué)科。P

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.生物學(xué)的發(fā)展過程分子水平整體水平細(xì)胞水平從整體水平到分子水平示意圖P

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.分子生物學(xué)的定義v分子生物學(xué)：從分子水平研究生命現(xiàn)象、生命本質(zhì)、生命活動(dòng)及其規(guī)律的科學(xué)。v醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)：

是分子生物學(xué)的一個(gè)重要分支，是從分子水平上研究人體在正常和疾病狀態(tài)下的生命活動(dòng)及其規(guī)律，從分子水平開展人類疾病的預(yù)防、診斷和治療研究的一門科學(xué)。P

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.二、分子生物學(xué)發(fā)展歷史1.

準(zhǔn)備和醞釀階段(

19世紀(jì)后期-

20世紀(jì)50年代初)v確定了蛋白質(zhì)是生命的主要基礎(chǔ)物質(zhì)。19世紀(jì)末Buchner

兄弟:

證明了酵母細(xì)胞提取液能使糖發(fā)酵產(chǎn)生酒精，第一次提出了酶的名稱，酶是催化劑。20世紀(jì)40年代:

提純和結(jié)晶了一些酶如：尿素酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶等，通過X射線衍射技術(shù)，從而證明了酶是蛋白質(zhì)。隨后陸續(xù)發(fā)現(xiàn):

生命的許多現(xiàn)象都與酶和蛋白質(zhì)相聯(lián)系。P

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.v確定了生物遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)是DNA1868年F.

米歇爾發(fā)現(xiàn)了核素；20世紀(jì)20-

30年代確認(rèn)了自然界有DNA和R

NA兩類核酸，并闡明了核苷酸組成；1944年Aver

y通過肺炎球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)證明了DNA是遺傳物質(zhì)；1952年Her

s

hey等人用同位素示蹤技術(shù)標(biāo)記T2噬菌體的蛋白質(zhì)和核酸，感染大腸桿菌的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明了DNA是遺傳物質(zhì)；P

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.2.現(xiàn)代分子生物學(xué)建立1953年Wat

s

on和Cr

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ck提出的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型是現(xiàn)代分子生物學(xué)誕生的里程碑，開創(chuàng)了分子遺傳學(xué)基本理論建立和發(fā)展的黃金時(shí)期。遺傳信息傳遞中心法則建立。1956年發(fā)現(xiàn)DNA聚合酶；1958年用同位素標(biāo)記和超速離心實(shí)驗(yàn)為DNA半保留復(fù)制模型提供證據(jù)；1968年岡畸提出不連續(xù)復(fù)制模型；1972年證實(shí)了DNA復(fù)制開始需要R

NA作為引物，從而逐步完善了對(duì)DNA復(fù)制機(jī)理認(rèn)識(shí)。P

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.DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型的建立諾貝爾醫(yī)學(xué)與生理學(xué)獎(jiǎng)1962年P(guān)

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.James

Dewey

Watsonv1928

出生1944

16歲

芝加哥大學(xué)動(dòng)物系1947

19歲

印第安納大學(xué)研究生1950

22歲

博士學(xué)位

丹麥1951

23歲

劍橋

卡文迪什實(shí)驗(yàn)室1953

25歲

發(fā)表DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)1962

34歲

獲得諾貝爾獎(jiǎng)Watson美國生物學(xué)家時(shí)年

25

歲P

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.3.20世紀(jì)70年代以來分子生物學(xué)飛速發(fā)展1970年，基因工程的興起和發(fā)展1972年，Paul

Berg：體外DNA重組1973年，Herb

Boyer,

Stanley

Cohen：質(zhì)粒與DNA重組方法克隆DNA1977年，Maxam-Gilbert,Frederick

Sanger：核酸測序方法1978年，基因工程生產(chǎn)人胰島素1985年，Kary

Mullins，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）1997年，英國羅斯林研究所，培育出世界上第一例體細(xì)胞克隆動(dòng)物多利羊P

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.RNAv1982年，美國Thomas

Cech在研究四膜蟲rRNA自我剪接時(shí)發(fā)現(xiàn)，同時(shí)加拿大的SidneyAltman

發(fā)現(xiàn)RNase

P分子中的RNA組分有催化活性；1989年分享了Noble化學(xué)獎(jiǎng)。

不僅拓寬了生物催化劑的領(lǐng)域，而且對(duì)RNA的生物學(xué)功能開創(chuàng)了一種歷史性的新認(rèn)識(shí)：RNA不僅具有儲(chǔ)存和傳遞遺傳信息的功能，而且還具有生物催化劑的功能，在一定程度上可以說，RNA一身兼有DNA和蛋白質(zhì)兩大類生物大分子的功能。P

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.GHtransgenic

miceDollysheepOb

mice降糖米GLP-1P

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.1982年，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物1990年，基因治療1990年，美國政府啟動(dòng)人類基因組計(jì)劃（Huma

n

Ge

nomePl

an,

HGP

)2001年，公布了人類基因組草圖2003年，完成人類基因組計(jì)劃P

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.種屬基因組（bp）5.1

x

1034.9

x

1043.0

x

1054.2

x

1061.3

x

1078.0X

1071.85

x1083.0

x

1093.3

x

1091.7

x

1010病毒SV40λ

噬菌體（

phage）支原體（mycoplasma）大腸桿菌（E.

coli）酵母（S.

cerevisiae）線蟲（C.

elegans）果蠅（fruitfly）小鼠（mouse）人（H.sapiens）小麥（wheat）P

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.v

生物體的C值(C-value):基因組的大小通常以一個(gè)基因組中的DNA含量來表示。v

C值悖理(Cvalue

paradox)v

染色體外基因組(extrachromosomalgenome)v

1)

遺傳圖譜

2)

物理圖譜

3)

轉(zhuǎn)錄圖譜

4)

序列圖譜v

營養(yǎng)基因組學(xué)（nutritionalgenomics）、環(huán)境基因組學(xué)（environmentalgenomics）、藥物基因組學(xué)（phamarcogenomics）、病理基因組學(xué)（pathogenomics）、生殖基因組學(xué)(reproductivegenomics)、群體基因組學(xué)(population

genomics)、生物信息學(xué)（bioinformatics）等得以誕生。P

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.v人類基因組計(jì)劃(

HGP)

全部基因測定的完成,

標(biāo)志著分子生物學(xué)已跨入后基因時(shí)代。v由于基因組學(xué)不能闡明蛋白質(zhì)表達(dá)的水平與時(shí)間、翻譯后修飾、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用等眾多問題,

人們于是提出了蛋白質(zhì)組學(xué)概念,

并以此來探討細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能以及生命活動(dòng)的本質(zhì)和規(guī)律。P

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.v

基因敲除技術(shù)v

利用重組DNA技術(shù)將編碼該蛋白的基因從有機(jī)體基因組中敲除掉觀察缺失該蛋白的個(gè)體出現(xiàn)的表型變化，然后再推測蛋白在體內(nèi)的可能功能。部分情況下這種敲除實(shí)驗(yàn)可以幫助我們了解被去除的基因所編碼的蛋白分子在體內(nèi)的可能功能。但很多情況下，結(jié)果是不明朗的。無法下肯定的結(jié)論。v

細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)v

將編碼某種蛋白的目的基因（真核生物中一般使用的是對(duì)應(yīng)蛋白的cDNA序列）插入到一DNA載體上，使之能夠在待轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中表達(dá)，產(chǎn)生出具有活性的蛋白分子。然后觀察轉(zhuǎn)染后，所產(chǎn)生的蛋白對(duì)被轉(zhuǎn)染細(xì)胞的行為的影響。并進(jìn)而推測蛋白在細(xì)胞內(nèi)的可能功能。P

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.v酵母雙雜交系統(tǒng)v在過去的十多年的實(shí)踐中已經(jīng)被證明的確是一個(gè)研究蛋白-蛋白相互作用的系統(tǒng)?，F(xiàn)在有人正試圖將這種方法應(yīng)用到對(duì)某種生物的細(xì)胞中全部的蛋白-蛋白相互作用的研究中去。P

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.v1995年WasingerVC等人提出了蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)的科學(xué)概念,

其主要任務(wù)是研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能。蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的最終體現(xiàn)者。v蛋白質(zhì)組學(xué)（

Proteomics

）是從整體的角度出發(fā)來研究細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的組成及其活動(dòng)規(guī)律的一門科學(xué)。P

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.蛋白質(zhì)組學(xué)不同于傳統(tǒng)蛋白質(zhì)學(xué)科之處:v研究的目的是闡明生物體全部蛋白質(zhì)的表達(dá)模式與功能模式v研究的內(nèi)容十分廣泛,涵蓋了某個(gè)機(jī)體或某個(gè)細(xì)胞全部的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能,包括鑒定蛋白質(zhì)的表達(dá)、存在方式(化學(xué)修飾)、結(jié)構(gòu)與功能的相互依賴關(guān)系,從某個(gè)生物體或某個(gè)細(xì)胞全部蛋白質(zhì)(現(xiàn)已知單個(gè)細(xì)胞可容納2萬種蛋白質(zhì))整體活動(dòng)角度揭示與闡明生命活動(dòng)的基本規(guī)律P

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.蛋白質(zhì)組學(xué)可分為三種類型:v蛋白表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)(

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essi

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)v結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)(

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)v功能蛋白質(zhì)組學(xué)(

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.蛋白表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)pr

ot

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cs是定量研究蛋白質(zhì)表達(dá)的技術(shù),

如鑒定某種疾病的特異性標(biāo)志蛋白,

應(yīng)用它已從乙型肝炎病毒(

HB

V)

感染者血清,

原發(fā)性口舌鱗狀上皮癌細(xì)胞組織中鑒定出生物標(biāo)志蛋白。P

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.結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)st

r

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cs其主要任務(wù)是闡明蛋白質(zhì)復(fù)合體或一個(gè)細(xì)胞器內(nèi)的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu),例如闡明存在于線粒體、葉綠體、細(xì)胞核內(nèi)的全部結(jié)構(gòu)蛋白以及轉(zhuǎn)錄組中蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)的相互作用。P

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.功能蛋白質(zhì)組學(xué)f

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cs其主要任務(wù)是從分子水平分析亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中蛋白質(zhì)在功能上的組織構(gòu)成及蛋白質(zhì)表達(dá)譜,

如研究線粒體外膜、內(nèi)膜、胞液、基質(zhì)間隙的各種蛋白質(zhì)定位,

并進(jìn)行其功能分析。P

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.與研究核酸分子生物學(xué)相比,

完成以上三類蛋白質(zhì)組學(xué)的研究任務(wù),需要更為復(fù)雜的高端技術(shù),

并需要通過生物學(xué)、分子生物學(xué)、生物物理學(xué)、生物醫(yī)學(xué)與生物信息學(xué)多學(xué)科聯(lián)合攻關(guān)才可望實(shí)現(xiàn)這個(gè)宏偉的目標(biāo)。P

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.三、分子生物學(xué)研究的內(nèi)容v核酸和蛋白的結(jié)構(gòu)功能，基因組結(jié)構(gòu)和功能，基因表達(dá)的調(diào)控；v生物大分子的相互作用及細(xì)胞間、細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；v與理論相關(guān)的分子生物學(xué)技術(shù)體系P

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.vDNA和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)對(duì)轉(zhuǎn)錄的調(diào)控v

DNA甲基化:在真核生物基因表達(dá)調(diào)控中，甲基化起著重要作用。一般認(rèn)為，DNA甲基化與基因的表達(dá)呈反比關(guān)系。甲基化程度高，基因的表達(dá)則降低。去甲基化，又可使基因的表達(dá)增加。v

組蛋白對(duì)基因表達(dá)的抑制作用:組蛋白與DNA結(jié)合，可保護(hù)DNA免受損傷，維持基因組穩(wěn)定性，抑制基因的表達(dá)。v

染色質(zhì)結(jié)構(gòu)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控作用:真核生物的染色質(zhì)（chromatin）或染色體（chromosome）是由DNA與組蛋白、非組蛋白和少量RNA及其它物質(zhì)結(jié)合而形成，具有核小體結(jié)構(gòu)。v

基因重排（gene

rearrangement）:基因重排是指某些基因片段改變?cè)瓉泶嬖陧樞颍ㄟ^調(diào)整有關(guān)基因片段的銜接順序，再重排成為一個(gè)完整的轉(zhuǎn)錄單位P

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染色質(zhì)的丟失:一些低等生物（如線蟲等）的細(xì)胞發(fā)育過程中發(fā)現(xiàn)染色質(zhì)丟失現(xiàn)象及高等動(dòng)物紅細(xì)胞在發(fā)育成熟中過程也有染色質(zhì)的丟失，都是一些不可逆的調(diào)控。v

基因擴(kuò)增（gene

amplification）:細(xì)胞在發(fā)育分化或環(huán)境改變時(shí)，對(duì)某種基因產(chǎn)物的需要量劇增，而單純靠調(diào)節(jié)其表達(dá)活性不足以滿足需要，只有增加這種基因的拷貝數(shù)（即基因的擴(kuò)增或基因放大）來滿足需要。P

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.v轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)控v轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控v翻譯的可調(diào)控性及調(diào)控方式v翻譯后加工的調(diào)控意義P

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.四、分子診斷技術(shù)的發(fā)展v利用DNA分子雜交技術(shù)進(jìn)行遺傳病的基因診斷P

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.細(xì)胞膜細(xì)胞核DNA基其

因它

診診

斷斷

的方

物法

質(zhì)的

基區(qū)

礎(chǔ)別

及與4基因診斷轉(zhuǎn)錄mRNA翻譯蛋白質(zhì)3免疫學(xué)診斷2生化診斷1形態(tài)學(xué)診斷臨床診斷P

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以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的DNA診斷，不僅可以檢測存在于宿主的多種DNA和RNA病原體載量，還可檢測多基因遺傳病細(xì)胞中mRNA的表達(dá)量。P

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.（1）等位基因特異性寡聚核苷酸（al

l

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AS

O)

探針斑點(diǎn)雜交：

P

CR-

ASO該方法是診斷已知點(diǎn)的突變：需分別合成野生型和突變型探針．在基因診斷時(shí)，只需用P

CR擴(kuò)增受檢者目的DNA片段，再分別與上述探針雜交．P

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.（２）單鏈構(gòu)象多態(tài)性（si

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andc

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mat

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pl

oymor

phi

sm,

SSCP)

分析是一種基于單鏈DNA構(gòu)象差別來檢測點(diǎn)突變的方法．DNA變性形成單鏈，在中性條件下長度相同的單鏈DNA,

如果堿基組成和(

或)

排列順序不同,

形成的構(gòu)象就不同,

這樣就形成了單鏈構(gòu)象多態(tài)性.

這些分子在非變性P

AGE中電泳中表現(xiàn)出不同的遷移率.SSCP特別適于分析小于400bp的

P

CR產(chǎn)物。據(jù)認(rèn)為SSCP可以區(qū)分1bp的差異P

CR-

SSCP分析不能確定基因變異的內(nèi)容，因此電泳后結(jié)果有差異后還需進(jìn)行測序分析，確定變異性質(zhì)P

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3)

限制性片段長度多態(tài)性（

r

est

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ct

i

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agment

l

e

ngt

h

pol

ymor

phi

sms,

RFLP）分析檢測DNA在限制性內(nèi)切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小。因此凡是可以引起酶切位點(diǎn)變異的突變?nèi)琰c(diǎn)突變（新產(chǎn)生和去除酶切位點(diǎn)）和一段DNA的重新組織（如插入和缺失造成酶切位點(diǎn)間的長度發(fā)生變化）等均可導(dǎo)致RFLP的產(chǎn)生。P

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.v

以生物芯片（biochip）技術(shù)為代表的高通量密集型檢測技術(shù)，生物芯片技術(shù)包括基因芯片，蛋白質(zhì)芯片，組織芯片等，由于其工作原理和結(jié)果處理過程突破了傳統(tǒng)的檢測方法，不僅具有樣品處理能力強(qiáng)、用途廣泛、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)，而且具有廣闊和應(yīng)用前景和商業(yè)價(jià)值，因此成為分子診斷技術(shù)領(lǐng)域的一大熱點(diǎn)。P

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.v原位合成芯片（In

situ

syntheticGeneChip）Affymetrix公司vDNA微集陣列（DNA

microarray）斯坦福大學(xué)Patrick

Brown研究小組P

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.密度大于1000/cm2原位合成芯片SyntheticChips顯微光蝕刻寡聚核苷酸合成合成DNA芯片**Affymetrix

Inc.AffymexInc.P

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w驥w

wU.f

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.基因組研究臨床疾病的基因診斷后基因組計(jì)劃生物信息學(xué)藥物研究開發(fā)法醫(yī)學(xué)鑒定DNA芯片動(dòng)植物檢疫生物戰(zhàn)劑檢測P

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w?ww.

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.分子診斷學(xué)的發(fā)展方向1）分子診斷的內(nèi)容從傳統(tǒng)的DNA診斷發(fā)展到核酸及其表達(dá)產(chǎn)物（mR

NA、蛋白質(zhì)）的全面診斷；2）分子診斷的策略從利用分子雜交、P

CR等單一技術(shù)的診斷發(fā)展到有機(jī)組合多項(xiàng)技術(shù)的聯(lián)合診斷；3）分子診斷的方法從定性診斷發(fā)展到半定量和定量診斷，核酸標(biāo)記技術(shù)，特別是熒光標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，熒光定量PCR技術(shù)等方法日益成熟；4）分子診斷的范圍從單基因疾?。ㄩT德爾遺傳性疾病，諸如白血病、早老癥、血紅蛋白病、甲型肝炎病毒，人類免疫缺陷病毒，人乳頭瘤病毒等）的診斷發(fā)展到多基因?。[瘤、心腦血管疾病、代謝病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、自身免疫性疾病等）的診斷；P

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.五、分子生物學(xué)廣泛滲透到醫(yī)學(xué)各學(xué)科領(lǐng)域，成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)重要的基礎(chǔ)臨床醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)P

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.通過致病基因的檢測診斷疾病已經(jīng)基本清楚基因突變與疾病發(fā)生之間的分子機(jī)制，相關(guān)的基因已被克隆，測序，并被定位在染色體上。如：一些與疾病有關(guān)的內(nèi)源基因-

癌基因，抑癌基因和血紅蛋白基因突變型。診斷方法：根據(jù)突變的基因序列設(shè)計(jì)探針.P

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.許多基因病，雖然它們的基因結(jié)構(gòu)還沒有闡明，但通過染色體分析已被定位在染色體的特定位置上，這些基因是通過檢測與特定染色體位點(diǎn)連鎖的遺傳標(biāo)記來發(fā)現(xiàn)的。原理：同一染色體上位置十分靠近的相鄰基因或其它遺傳標(biāo)記，在遺傳過程中分離的幾率很低，常常一起遺傳，形成連鎖?？梢酝ㄟ^一個(gè)或幾個(gè)基因或遺傳標(biāo)記的分析，了解另一個(gè)或幾個(gè)基因。P

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.90-

今:

表型克隆,不考慮基因在染色體上的位置信息,而是直接在疾病與正常樣本之間尋找分子水平上的差異.方法：根據(jù)克隆到的一組基因制作相應(yīng)的一組探針，用這組探針檢測一組與疾病相關(guān)的基因來診斷多基因病P

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.表型克隆：對(duì)疾病相關(guān)的一組基因進(jìn)行克隆一些多基因，多因素的疾病，如：肥胖，哮喘，高血壓，冠心病，腫瘤，精神病，自體免疫性疾病等，由于疾病發(fā)生的原因復(fù)雜，不僅涉及多基因互作，還涉及基因與環(huán)境互作。不可能通過前面的方法來診斷，必須利用差異顯示等技術(shù)找出正常人和疾病患者之間的差異序列，鑒定與疾病相關(guān)的多個(gè)基因，確定導(dǎo)致疾病的分子缺陷。P

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.分子生物學(xué)在遺傳性疾病中的應(yīng)用v

血紅蛋白病血紅蛋白病是由于血紅蛋白合成異常所致的遺傳性血液病。習(xí)慣上分為異常血紅蛋白病和地中海貧血２類。1.

異常血紅蛋白病是珠蛋白肽鏈結(jié)構(gòu)的改變導(dǎo)致主要功能部位氨基酸的置換，影響Hb的溶解度、穩(wěn)定性及生物學(xué)功能。２.

地中海貧血（α地中海貧血和β地中海貧血）是珠蛋白合成速率降低，導(dǎo)致鏈和非鏈合成的不平衡→多余的珠蛋白鏈沉積在Rbc膜上→改變了膜的通透性和硬度→導(dǎo)致溶血性貧血。P

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.Hb

Punjabα地中海貧血（

α珠蛋白合成↓）β地中海貧血（

β珠蛋白合成↓

）占我國新疆異常Hb病55.6%（1）產(chǎn)前診斷為主要目

每一民族或群體有的。特異突變類型譜，中國人主要突變類型有6種Hbβ鏈121密碼單個(gè)堿基替代：GAA（Glu)

→CAA（Gln）→改變了EccRI一個(gè)識(shí)別位點(diǎn)分子基礎(chǔ)大多數(shù)是α珠蛋白基因缺失所致。點(diǎn)突變、缺失或插入往往不涉及限制酶識(shí)別位點(diǎn)。DNA診斷：PCR擴(kuò)增（

β珠蛋白第3個(gè)外顯子和基因3′端DNA序列、全

譜分析，或PCR擴(kuò)增電液體分子雜交C1限制酶PCR/ASO探針法（主要方法）長144bp）EcoRI酶切電泳分析。泳分析結(jié)果正常對(duì)照HbPuN

Job

144bp,40/104bp兩種類型雜合子（同理擴(kuò)增β40/104bp兩個(gè)片段正常對(duì)照有正常雜交信號(hào)（C1）酶切片段不缺（C2）PCR產(chǎn)物有（C3）PCR/RFLP連鎖分析法珠蛋白DNA片段MnlI酶譜分析

α地貧與正常結(jié)果反之。診斷HbE（

β26

Glu→Lys))RNA診斷：異常Hb病人mRNA的RT/PCR

RT-PCR介導(dǎo)的α珠蛋白

①PCR介導(dǎo)的產(chǎn)物測序知編碼區(qū)堿基變化—推導(dǎo)相應(yīng)氨基酸變化。mRNA定量↓。mRNA定量法。②mRNA的剪切缺陷檢測P

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.P

CR技術(shù)應(yīng)用實(shí)例（α地中海貧血）P

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.v

血友病是一種遺傳性凝血功能障礙的出血性疾病，由于正常凝血過程中血漿凝血的活力有缺陷所致?；颊叱Ｒ虺鲅恢够蚶^發(fā)病而夭折，治療主要靠替代療法，輸入缺乏的血漿因子。重型血友病甲和乙的男性發(fā)病率為1/

5000~1/

50000。為甲型血友病和乙型血友病。主要特征：①也是X連鎖遺傳的凝血缺陷疾病。①是一組X連鎖遺傳凝血缺陷疾病。②約1%左右乙型血友病人FI

X基因缺失（因而在用替代療法過程中會(huì)產(chǎn)生FI

X的抑制物）。③在非缺失（FI

X基因）型中，已發(fā)現(xiàn)398種不同的基因突變。②缺乏Xq遠(yuǎn)端的FⅧ（凝血因子Ⅷ）所致。③基因突變具極為異質(zhì)性，與β地貧不同。（因子占X染色體全長0,

1%，共186kb包括26個(gè)外顯子）不存在存族和群體特異性，幾乎每一種不同的甲型血友病家系都具有自已獨(dú)特的突變類型。（所以該病基因診斷不宜用P

CR/

AS

O探針直接檢測點(diǎn)突變，而主要依賴RFLP連鎖分析）（FI

X基因定位在Xq26→q27，全長34kb包括8個(gè)外顯子）。P

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.診斷情況：①

應(yīng)

用

克

隆

化FⅧc

DNA①已克隆化FI

Xc

DNA和DNA片段，鑒定了FI

X基因的5個(gè)限制者多態(tài)性位點(diǎn)，故可用RFLP連鎖分析進(jìn)行產(chǎn)前診斷和攜帶者檢測。與VI

I

I

基因連鎖DNA片

段

和

DX1

8

、

St

14等分析了基因或旁側(cè)的限制酶酶切位點(diǎn)多態(tài)性，并采用P

CR/

BCL

I

或

XbaIRFLP連

鎖

分

析

法

進(jìn)行了甲型血友病的產(chǎn)前診斷和攜帶者檢測。②病例：乙型血友家系分析FI

X基因

發(fā)

現(xiàn)

某

患

者

缺

失

該

基

因5k

bDNA序列（第2~3外顯子+第2內(nèi)含子全部+部分第1，第3內(nèi)含子）a、對(duì)該家系一例乙型血友病變高危妊娠產(chǎn)前基因診斷，診斷胎兒為男性乙型血友病患者。②用P

CR/

SSCP法檢查了FVI

I

I

內(nèi)

含

子

18

處BCL

I

的多態(tài)性。（終止妊娠對(duì)胎兒作凝血子測定和DNA分析、證

實(shí)

產(chǎn)

前

診

斷

正確。）b、對(duì)該孕婦第二胎產(chǎn)前診斷為女性乙型血友病基因攜帶者。（上海醫(yī)遺傳所淅江乙型血友病家系）P

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.應(yīng)用P

CR技術(shù)對(duì)4例DMD家系進(jìn)行產(chǎn)前基因診斷v

Duchenne

型肌營養(yǎng)不良癥(

Duchenne

muscul

ardys

t

r

ophy

,

DMD)

是一種具有嚴(yán)重危害的X染色體連鎖隱性遺傳疾病,

發(fā)病率為1/

3

500活產(chǎn)男嬰。該病是由于肌營養(yǎng)不良蛋白基因dys

t

r

ophi

n突變導(dǎo)致肌細(xì)胞膜上骨架蛋白發(fā)生結(jié)構(gòu)和功能改變所致。MD

患者常于5歲左右發(fā)病,約20歲因嚴(yán)重合并癥死亡。v

該病尚無有效的治療方法,

因此建立高效、準(zhǔn)確、快速的D

MD

產(chǎn)前診斷方法,預(yù)防患兒出生,

是降低本病發(fā)病率的重要措施。v

通過Y染色體性別決定基因判斷胎兒性別,運(yùn)用聚合酶鏈反應(yīng)檢測4個(gè)Duchenne

型肌營養(yǎng)不良癥家系中先證者dys

t

r

ophi

n

基因缺失熱區(qū)內(nèi)16個(gè)外顯子是否缺失,并對(duì)胎兒進(jìn)行相應(yīng)外顯子檢測;

對(duì)家系成員和胎兒進(jìn)行第45

、49、50內(nèi)含子以及5’和3’端短片段串聯(lián)重復(fù)序列的基因連鎖分析能準(zhǔn)確地對(duì)Duchenne型肌營養(yǎng)不良癥進(jìn)行產(chǎn)前基因診斷,且是目前最有效的實(shí)驗(yàn)室方法。P

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.性別鑒定結(jié)果v

家系1

、2

和3

的胎兒Y染色體性別決定基因（SRY

）均為陽性,

為男性胎兒;

家系4

的胎兒S

RY為陰性,提示為女性胎兒,見圖1。P

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.缺失分析結(jié)果v

應(yīng)用16

對(duì)引物對(duì)患者進(jìn)行缺失分析,結(jié)果表明家系1

和家系2

的患者第45

和第47

外顯子缺失;

對(duì)家系1

和家系2的男性胎兒進(jìn)行45和47

外顯子缺失分析,結(jié)果表明2

個(gè)男性胎兒均未缺失。P

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.連鎖分析結(jié)果v

采用5個(gè)短片段串聯(lián)重復(fù)序列（S

TR）位點(diǎn)進(jìn)行單體連鎖分析,

家系3男性胎兒的

dys

t

r

ophi

n

基因S

TR位點(diǎn)基因型與先證者一致(

49CA

和3pCA

位點(diǎn))

,

獲得風(fēng)險(xiǎn)染色體。家系3的S

TR多態(tài)連鎖分析（箭頭所指為含有致病基因染色體的基因型）P

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.分子生物學(xué)在腫瘤中的應(yīng)用v腫瘤的發(fā)生細(xì)胞水平——細(xì)胞增殖、分化、凋亡發(fā)生異常，細(xì)胞總數(shù)失控，惡性生長造成?；蛩健?xì)胞周期（增殖、分化、凋亡）由兩大類基因調(diào)控，原癌基因和抑癌基因。原癌基因

抑癌基因P

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.v腫瘤分為:癌,肉瘤,白血病/淋巴瘤v癌:90%的人類腫瘤,起源內(nèi)胚層及外胚層上皮細(xì)胞v肉瘤,白血病/淋巴瘤v起源中胚層細(xì)胞,包括肌肉,骨骼,血管,成纖維細(xì)胞以及血液和淋巴系統(tǒng)中的循環(huán)細(xì)胞P

DF

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.癌基因和抑癌基因（一）癌基因可在體外引起細(xì)胞轉(zhuǎn)化、在體內(nèi)引起癌瘤的一類基因稱為癌基因。病毒中存在癌基因，統(tǒng)稱病毒癌基因；各種動(dòng)物細(xì)胞基因組中，普遍存在與病毒癌基因相似的序列統(tǒng)稱為細(xì)胞癌基因；由于細(xì)胞癌基因在正常細(xì)胞中以非激活形式存在故又稱為原癌基因。P

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.原癌基因的特點(diǎn)⑴廣泛存在于生物界中,從酵母到人細(xì)胞普遍存在;⑵在進(jìn)化過程中,基因系列呈高度保守性;⑶其作用通過其表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)來體現(xiàn)。它們的存在對(duì)正常細(xì)胞不僅無害,而且對(duì)維持正常生理功能/調(diào)控細(xì)胞生長和分化起重要作用，是細(xì)胞發(fā)育、組織再生、創(chuàng)傷愈合等所必需；⑷在某些因素作用（如射線、化學(xué)物質(zhì)等)下,原癌基

因的結(jié)構(gòu)和數(shù)量發(fā)生改變而被激活

→癌C轉(zhuǎn)化基因P

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.癌基因激活與腫瘤的發(fā)生下面以幾個(gè)常見的癌基因?yàn)槔?，闡述癌基因在細(xì)胞癌變和腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用。1、ras基因變異與腫瘤發(fā)生

早期人們用多種人類腫瘤中提取的DNA進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)化，結(jié)果表明約10％～15％的腫瘤中至少有三種ras基因中的一種發(fā)生了點(diǎn)突變，其中K-ras基因更易成為突變的靶基因。目前對(duì)結(jié)腸和直腸腫瘤的發(fā)生發(fā)展與ras基因點(diǎn)突變間的關(guān)系已進(jìn)行了較深入的研究。約50％的結(jié)、直腸癌有K-ras基因點(diǎn)突變。其中約80％的點(diǎn)突變位于K-ras第12個(gè)密碼子，另有約15％發(fā)生在K-ras第13個(gè)密碼子。通過對(duì)腺癌和腺瘤中ras基因的分析，有5％～10％直徑小于lcm的腺瘤中有ras基因點(diǎn)突變。因此，ras基因點(diǎn)突變可能與腺瘤向癌的演變有關(guān)，并可能具有一定的臨床意義。P

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.2．myc基因變異與腫瘤發(fā)生

myc基因是一種細(xì)胞癌基因，與之同源的病毒癌基因存在于一些具有高度致瘤性的猿逆轉(zhuǎn)錄病毒中。myc基因高水平表達(dá)時(shí)可轉(zhuǎn)化嚙齒類成纖維細(xì)胞。它在人類腫瘤中的活化方式首次在Burkitt淋巴瘤中發(fā)現(xiàn)，可通過染色體易位而活化，最常見的是通過8號(hào)染色體與14號(hào)染色體易位，使得8號(hào)染色體上的myc基因或其相鄰區(qū)域與14號(hào)染色體的免疫球蛋白重鏈基因融合而被活化。盡管不同腫瘤中影響myc基因的易位斷裂點(diǎn)的具體位置可能有所不同，但染色體易位的共同之處是改變了myc基因正常的表達(dá)調(diào)控機(jī)制。P

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.3．bc

l

-

2基因與腫瘤發(fā)生

bc

l

-

2基因是從B細(xì)胞淋巴瘤中鑒定出來的癌基因，通過染色體易位而激活，易位涉及14q的免疫球蛋白重鏈基因及染色體18q的部分序列。這一易位使得bcl

-

2基因序列與I

g位點(diǎn)的強(qiáng)調(diào)控元件相結(jié)合，導(dǎo)致易位細(xì)胞中bcl

-

2基因表達(dá)失控。bc

l

-

2基因編碼蛋白分子量約25kD，位于核膜、部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體外膜上，與抑制細(xì)胞程序化死亡相關(guān)。絕大多數(shù)結(jié)節(jié)非霍奇金淋巴瘤中均能見到易位活化的bcl

-

2基因表達(dá)。P

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.4．mdm2基因

mdm2基因是一種進(jìn)化保守基因，基因表達(dá)產(chǎn)物是一個(gè)長度為491氨基酸的具有鋅指結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)?；蚨ㄎ辉谌旧w12q13-

14區(qū)域。蛋白定位在細(xì)胞核，半衰期很短。mdm2基因高表達(dá)時(shí)呈現(xiàn)癌基因的功能，尤其值得注意的是Mdm2蛋白可與p53和RB蛋白相結(jié)合而使其功能失活，這是Mdm2蛋白促進(jìn)癌細(xì)胞生長的重要機(jī)制之一。多種因素可影響md

m2基因，如紫外線照射可誘導(dǎo)Mdm2蛋白的表達(dá)。P

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.v

有致癌能力的DNA病毒

:

(

6個(gè)病毒家族)v

乙肝病毒,猴病毒40,多瘤病毒,乳頭瘤病毒,皰疹病毒,痘病毒v

只有一類RNA病毒致癌—反轉(zhuǎn)錄病毒v腫瘤抑癌基因的發(fā)現(xiàn):

Hani

sv

1960年,正常細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞融合—雜合體細(xì)胞不致瘤—正常細(xì)胞中具有腫瘤抑制基因—產(chǎn)生腫瘤表型的負(fù)調(diào)節(jié)物—當(dāng)雜合體細(xì)胞某段染色體丟失后—細(xì)胞變?yōu)槟[瘤表型---這段染色體上有重要的腫瘤抑制基因P

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.（二）抑癌基因抑癌基因是一類抑制C過度生長、增殖,從而遏制腫瘤形成的基因。對(duì)于正常C,

原癌基因和抑癌基因的協(xié)調(diào)表達(dá)

是調(diào)控C生長的重要分子機(jī)制之一。兩者相互制約維持相對(duì)穩(wěn)定。原癌基因激活或過量表達(dá)

(

或抑癌基因的丟失或失活)

，均可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。P

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.抑癌基因失活與腫瘤發(fā)生在此僅以研究得較為清楚的幾個(gè)抑癌基因?yàn)槔?，說明抑癌基

因

失

活

與

腫

瘤

發(fā)

生

的

關(guān)

系

。p16基因又稱為多腫瘤抑制基因（multiple

tumorsuppressor

l，MTSl）。p16基因全長8.5kb，由二個(gè)內(nèi)含子和三個(gè)外顯子組成，編碼細(xì)胞周期依賴性激酶CDK4的抑制蛋白，該蛋白的分子量為15.8kD，故稱為p16。p16蛋白既是細(xì)胞周期的有效調(diào)控者，又是抑制腫瘤細(xì)胞生長的關(guān)鍵因子，p16蛋白與細(xì)胞周期素D（cyclinD）競爭與CDK4結(jié)合，當(dāng)p16與CDK4結(jié)合后，能特異地抑制CDK4的活性。視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤RB蛋白在控制真核細(xì)胞周期中起重要作用，低磷酸化或非磷酸化的RB可阻止細(xì)胞由G1進(jìn)入S期，而CDK4可使RB磷酸化，CDK4受抑制，則不能解除RB蛋白對(duì)轉(zhuǎn)錄因子的抑制，從而抑制細(xì)胞增殖，阻止細(xì)胞生長。當(dāng)cyclinD與CDK4結(jié)合時(shí)，刺激細(xì)胞生長分裂。正常情況下，cyclinD和p16對(duì)CDK4的作用處于平衡狀態(tài)。當(dāng)p16基因異常而不能正常表達(dá)，cyclinD則與CDK4以優(yōu)勢結(jié)合，使細(xì)胞生長失去控制，細(xì)胞表型產(chǎn)生變化。P

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.p16基因異常主要以基因缺失為主，且多為純合性缺失，在腫瘤細(xì)胞系中可達(dá)80％以上，在實(shí)體瘤中可達(dá)70％左右。點(diǎn)突變發(fā)生頻率較低，不同腫瘤的突變頻率不同。同一腫瘤的不同分化程度的細(xì)胞中，p16基因缺失和突變率也不同。細(xì)胞株的基因異常高于實(shí)體瘤，基因異常總發(fā)生率高于其它已知的抑癌基因。p16基因異常的腫瘤包括了人類腫瘤的大部分類型，也包括散發(fā)性和具遺傳傾向性的腫瘤。P

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.v抑癌基因:vP53—多種腫瘤.早期發(fā)現(xiàn)腫瘤中P53表達(dá)增加,認(rèn)為是癌基因.正常P53基因抑制腫瘤形成,腫瘤中過量表達(dá)的是P53基因突變體—作為顯性抑制物影響P53功能—致癌v

P16,PTP多種抑癌基因vWT1—腎母細(xì)胞癌vDCC—結(jié)腸癌vAPC—家族性腺瘤息肉癌變v

廣義的講,許多在細(xì)胞繁殖中起正常作用的基因,如DNA修復(fù)基因，其突變也會(huì)導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生,它們的存在間接地起到抑制腫瘤的作用P

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.腫瘤發(fā)生中的多基因協(xié)同作用從以上所述癌基因與抑癌基因的作用來看，似乎體內(nèi)任一癌基因激活或抑癌基因失活，都會(huì)導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。其實(shí)問題遠(yuǎn)非如此簡單。在單一的腫瘤組織中，往往同時(shí)存在多種遺傳缺陷，包括原癌基因的易位、擴(kuò)增、點(diǎn)突變和抑癌基因的缺失等。另一方面，原代培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞需要有兩個(gè)以上癌基因同時(shí)活化才能轉(zhuǎn)化成癌細(xì)胞。許多實(shí)驗(yàn)證明，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的基因如細(xì)胞周期調(diào)控基因、凋亡相關(guān)基因、血管生長因子和受體的基因、端粒酶等，確實(shí)存在著協(xié)同作用。P

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.因此，目前普遍接受的是細(xì)胞癌變的多基因協(xié)同假說。該假說認(rèn)為細(xì)胞癌變是多步驟、多重打擊的復(fù)雜過程，在腫瘤發(fā)生發(fā)展的各階段，至少需要兩個(gè)或更多個(gè)不同的癌相關(guān)基因的異常激活或失活，才有可能引起細(xì)胞的癌變。這可能因?yàn)榧?xì)胞的增殖受多種因素的控制，需要有多種癌相關(guān)基因的協(xié)同作用才能脫離這些控制。P

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.v凋亡抑制基因Ｓｕｒｖｉｖｉｎ

在甲狀腺癌組織中的表達(dá)及意義v

劉鋼

史火喜

袁又能

黃文廣v【摘要】

目的

探討凋亡抑制基因Ｓｕｒｖｉｖｉｎ

在甲狀腺癌中的表達(dá)及其與病理預(yù)后之間的關(guān)系。方法

應(yīng)用免疫組化法檢測６８

例甲狀腺癌、５４

例甲狀腺腺瘤、３２

例癌旁組織和２３

例正常甲狀腺組織中Ｓｕｒｖｉｖｉｎ

的表達(dá)情況，評(píng)價(jià)Ｓｕｒｖｉｖｉｎ

的陽性表達(dá)率與甲狀腺癌的病理預(yù)后之間的關(guān)系。結(jié)果

Ｓｕｒｖｉｖｉｎ

在甲狀腺腺癌組織、甲狀腺腺瘤組織、癌旁甲狀腺組織及正常甲狀腺組織中的陽性表達(dá)率分別為４４％、２５％、１８％和０。甲狀腺未分化癌和髓樣癌組織中Ｓｕｒｖｉｖｉｎ

的陽性率明顯增高，存在轉(zhuǎn)移和臨床Ⅲ、Ⅳ期病例中，Ｓｕｒｖｉｖｉｎ

的陽性率明顯增高。結(jié)論

Ｓｕｒｖｉｖｉｎ

過量表達(dá)可能與甲狀腺腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，癌組織中Ｓｕｒｖｉｖｉｎ

的表達(dá)可作為判斷甲狀腺癌病理類型和預(yù)后的參考指標(biāo)。P

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.肝癌的分子生物學(xué)診斷與基因治療v

正常肝細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肝癌細(xì)胞是一個(gè)復(fù)雜的過程,大部分要經(jīng)歷病毒感染(HBV等)

、肝炎、肝硬化、肝癌.在臨床上表現(xiàn)為良性肝病變、早期癌、進(jìn)展期癌幾個(gè)階段。同時(shí)也與其他腫瘤一樣是一個(gè)多基因參與的多步驟的復(fù)雜過程。以往的只能通過一個(gè)或幾個(gè)基因的變化尋找肝癌特異基因,因此很難準(zhǔn)確發(fā)現(xiàn)并揭示基因改變?cè)诟伟┌l(fā)生、發(fā)展過程中的作用機(jī)制.v

既往的研究表明大量的癌基因、抑癌基因、DNA修復(fù)基因和細(xì)胞周期調(diào)控基因參與肝癌的形成。v

目前發(fā)現(xiàn)的癌基因已達(dá)200余個(gè),包括myc

,src,neu,fos,jun,abl

,sis和ras

等家族。v

病毒感染量對(duì)于HBV相關(guān)的HCC是一個(gè)重要的預(yù)后指標(biāo)。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、基質(zhì)金屬蛋白酶9

(MMP-9)能夠降解基底膜糖蛋白及細(xì)胞外基質(zhì)成分P

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.肝癌的分子生物學(xué)診斷與基因治療v

利用基因芯片(cDNA

clone

23

075)

對(duì)1021

例HCC及10

株HCC細(xì)胞系進(jìn)行研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)大量與HCC

增殖分化,浸潤轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因簇。同時(shí)發(fā)現(xiàn)HBV、HCV陽性和陰性的HCC基因表達(dá)類型不同。v

利用基因芯片研究了HCC基因表達(dá)譜,發(fā)現(xiàn)骨橋蛋白基因,在HCC轉(zhuǎn)移灶中表達(dá)與原發(fā)瘤中的表達(dá)一致,相反,轉(zhuǎn)移性HCC與沒有轉(zhuǎn)移的HCC之間基因表達(dá)差異顯著。骨橋蛋白可能成為轉(zhuǎn)移性肝細(xì)胞癌的一個(gè)潛在治療靶點(diǎn)。v

問題:

(1)

選擇真正能反映肝癌生物學(xué)行為的目的基因;

(2)基因診斷的結(jié)果如何與傳統(tǒng)診治方法相結(jié)合;

(3)

基因治療中引入人體內(nèi)的外源基因如何達(dá)到長期穩(wěn)定及有效的調(diào)控,如何來確定;

(4)

理想、高效、安全、和特異性好的基因治療載體的開發(fā);

(5)

基因診斷和治療的倫理學(xué)問題P

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.v

在心血管疾病中，已發(fā)現(xiàn)高脂蛋白血癥、原發(fā)性高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、心肌肥厚、肥厚性心肌病等疾病的發(fā)生與基因的變異相關(guān)。以下以原發(fā)性高血壓為例來說明基因變異和心血管疾病的關(guān)系。v

血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotensin-converting

enzyme，ACE）基因

;人的腎素基因定;血管緊張素原的基因

;心鈉素基因家族主要有心鈉素基因（ANP）、腦鈉素基因（BNP）和C型利鈉激素基因（CNP）三個(gè)主要成員

;內(nèi)皮素家族主要有內(nèi)皮素（ET-1、ET-2、ET-3）三個(gè)主要成員

;一氧化氮合成酶和激肽釋放酶的基因;信息傳遞體β2-腎上腺素能受體基因

,

G蛋白鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白（GNBP

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.v多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生與基因的變異有關(guān)，如精神分裂癥、帕金森氏綜合征、老年性癡呆等。以下以老年性癡呆為例來說明。v淀粉樣前體蛋白（APP）基因;早老素基因（presenilingene，PS基因）

APP基因的突變所致AD僅占FAD的2％~3％。而PS基因的突變則為大多數(shù)FAD的病因;載脂蛋白E（ApoE）基因,1993年Strittmatter等發(fā)現(xiàn)ApoE的等位基因ε4與晚發(fā)AD相關(guān)聯(lián);P

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.分子生物學(xué)技術(shù)在感染性疾病中的應(yīng)用舉例引起人類感染性疾病的病毒很多，均可造成相應(yīng)的病毒血癥，并侵入特定的臟器，用分子生物學(xué)技術(shù)診斷血中和受累臟器中感染的病毒具有十分重要的意義。P

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.乙型肝炎病毒感染v乙型肝炎病毒（HB

V）：屬嗜肝DNA病毒科(

he

pa

dna

vi

r

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dae)

，基因組長約3.2kb

，為部分雙鏈環(huán)狀DNA。P

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.HB

V感染的診斷主要采用免疫學(xué)檢測法，但測定的是病毒的蛋白和機(jī)體產(chǎn)生的相應(yīng)抗體，分子生物學(xué)技術(shù)可直接檢測病毒的核酸，敏感性更高（P

CR可檢出HB

V

DNA2

0

-

60拷貝/

ml

），不僅可檢出感染的窗口期和病毒濃度極低的臨床標(biāo)本，還能根據(jù)定量P

CR的結(jié)果對(duì)治療、預(yù)后和傳染性進(jìn)行評(píng)估，監(jiān)測和考核抗病毒療法，通過對(duì)P

CR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測和測序，可進(jìn)行基因分型和檢測有關(guān)基因區(qū)的突變和耐藥突變；而原位雜交和原位PCR可研究HB

V的復(fù)制狀態(tài)和與原發(fā)性肝癌的關(guān)系等。P

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.HBV治療前：a:

治療前HBV低水平復(fù)制者對(duì)干擾素的反應(yīng)性明顯優(yōu)于高水平復(fù)制者。b:

治療前HBV

DNA含量特別高者大多沒有療效。c:

HBsAg轉(zhuǎn)陰的幾