蛋白質(zhì)的分離純化

蛋白質(zhì)的分離純化

第五節(jié)SeparationandPurificationofProtein二、蛋白質(zhì)的分離和純化（一）透析及超濾法*透析(dialysis)：利用透析袋把大分子蛋白質(zhì)與小分子化合物分開的方法。*超濾法：應(yīng)用正壓或離心力使蛋白質(zhì)溶液透過有一定截留分子量的超濾膜，達(dá)到濃縮蛋白質(zhì)溶液的目的。（二）蛋白質(zhì)的沉淀作用

破壞使蛋白質(zhì)膠體溶液穩(wěn)定的條件，蛋白質(zhì)將會(huì)沉淀。中和蛋白質(zhì)表面電荷以及破壞水化膜。有可逆沉淀和不可逆沉淀之分。1.可逆沉淀溫和條件下，通過改變?nèi)芤旱膒H或電荷狀況，可使蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀，但此時(shí)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)都沒有發(fā)生變化，適當(dāng)?shù)臈l件下可重新溶解形成溶液。可逆沉淀是分離和純化蛋白質(zhì)的基本方法，如等電點(diǎn)沉淀法、鹽析法和有機(jī)溶劑沉淀法等。2.不可逆沉淀在強(qiáng)烈沉淀?xiàng)l件下，不僅破壞了蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性，而且也破壞了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)沉淀不可能再重新溶解于水。加熱沉淀、強(qiáng)酸堿沉淀、重金屬鹽沉淀和生物堿沉淀等都屬于不可逆沉淀。（三）電泳蛋白質(zhì)在高于或低于其pI的溶液中為帶電的顆粒，在電場(chǎng)中能向正極或負(fù)極移動(dòng)。這種通過蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中泳動(dòng)而達(dá)到分離各種蛋白質(zhì)的技術(shù),稱為電泳(elctrophoresis)。pH=pI:凈電荷為零，在電場(chǎng)中不移動(dòng)；pH<pI:帶凈正電荷，在電場(chǎng)中向陰極移動(dòng)；pH>pI:帶凈負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向陽極移動(dòng)。根據(jù)支撐物的不同，可分為薄膜電泳、凝膠電泳等。

利用蛋白質(zhì)的電泳現(xiàn)象，可以將蛋白質(zhì)進(jìn)行分離純化。（四）層析層析(chromatography)分離蛋白質(zhì)的原理待分離蛋白質(zhì)溶液（流動(dòng)相）經(jīng)過一個(gè)固態(tài)物質(zhì)（固定相）時(shí)，根據(jù)溶液中待分離的蛋白質(zhì)顆粒大小、電荷多少及親和力等，使待分離的蛋白質(zhì)組分在兩相中反復(fù)分配，并以不同速度流經(jīng)固定相而達(dá)到分離蛋白質(zhì)的目的。蛋白質(zhì)分離常用的層析方法*離子交換層析：利用各蛋白質(zhì)的電荷量及性質(zhì)不同進(jìn)行分離。*凝膠過濾(gelfiltration)又稱分子篩層析：利用各蛋白質(zhì)分子大小不同分離。（五）超速離心*超速離心法(ultracentrifugation)既可以用來分離純化蛋白質(zhì)也可以用作測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量。*蛋白質(zhì)在離心場(chǎng)中的行為用沉降系