酵母表面展示技術(shù)

酵母表面展示技術(shù)

2021/5/91細(xì)胞表面是細(xì)胞內(nèi)外的功能界面。一些表面蛋白橫穿過質(zhì)膜，另一些以共價(jià)或非共價(jià)結(jié)構(gòu)與細(xì)胞表面復(fù)合物結(jié)合一起。細(xì)胞能夠錨定特定的表面蛋白，并且能將其限制在細(xì)胞表面的特定區(qū)域。在生物技術(shù)中，細(xì)胞表面通常用于研究蛋白跨膜的機(jī)理。酵母細(xì)胞表面展示技術(shù)是近年來發(fā)展較快的一種真核蛋白表達(dá)系統(tǒng)，其基本原理是將外源靶蛋白基因(外源蛋白)與特定的載體基因序列融合后導(dǎo)入酵母細(xì)胞，利用酵母細(xì)胞內(nèi)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到膜表面的機(jī)制使靶蛋白固定化表達(dá)在酵母細(xì)胞表面，在醫(yī)藥、食品、生物燃料等多個(gè)工業(yè)領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用前景。2021/5/92原理酵母是單細(xì)胞真核生物,根據(jù)交配型的差異分為兩種單倍體:MATα和MATa,其細(xì)胞表面分別表達(dá)α-凝集素和a-凝集素,它們可以介導(dǎo)細(xì)胞之間的交配融合。酵母表面展示系統(tǒng)應(yīng)用的是釀酒酵母的a-凝集素,外源蛋白借助它在細(xì)胞表面得到展示。a-凝集素由核心亞單位(Aga1)和結(jié)合亞單位(Aga2)兩部分組成,Aga1共有725個(gè)氨基酸,它與酵母細(xì)胞壁的β-葡聚糖共價(jià)連接。Aga2共有69個(gè)氨基酸,它通過兩個(gè)二硫鍵與Aga1結(jié)合,表達(dá)于酵母細(xì)胞表面。Aga2的N端部分參與二硫鍵的形成,外源蛋白通過與Aga2的C端融合可展示于酵母細(xì)胞表面。2021/5/93

酵母表面展示系統(tǒng)基本組成宿主細(xì)胞釀酒酵母一直被認(rèn)為是安全的模式生物（GRAS）而廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)和醫(yī)藥工業(yè)，也是目前常見的用于酵母表面展示的宿主細(xì)胞。除釀酒酵母外，近年來酵母展示平臺(tái)已被拓展至某些能利用甲醇作為單一碳源和能量來源的細(xì)胞株，如巴斯德畢赤酵母、漢遜酵母。與釀酒酵母相比，嗜甲醇酵母細(xì)胞株具有更優(yōu)越的發(fā)酵特性，如能夠在廉價(jià)的碳源中生長(zhǎng)和更高的細(xì)胞培養(yǎng)密度，這些特性使其在需要大規(guī)模發(fā)酵的應(yīng)用中更具優(yōu)勢(shì)，例如展示異源酶作為全細(xì)胞催化劑。另外，畢赤酵母對(duì)外源蛋白的O-糖基化程度更高，因而對(duì)展示的外源酶具有更好的穩(wěn)定效果。2021/5/94載體蛋白酵母細(xì)胞表面包被著一層堅(jiān)硬的細(xì)胞壁，由內(nèi)層的葡聚糖骨架和外層的甘露糖蛋白構(gòu)成。甘露糖蛋白主要包括兩類蛋白質(zhì)：一種以非共價(jià)方式松散地結(jié)合于細(xì)胞壁，可以用SDS抽提；另一類蛋白必需以β-1,3或β-1,6葡聚糖酶消化細(xì)胞壁后才能抽提，這類蛋白常含有GPI錨定區(qū)域。α-凝集素和絮凝素以及細(xì)胞壁蛋白如Cwp1p，Cwp2p，Tip1p等都屬于GPI家族蛋白，外源蛋白與它們?nèi)诤虾罂杀还矁r(jià)錨定于細(xì)胞表面，這些蛋白是常用的酵母表面展示載體蛋白。2021/5/95外源蛋白酵母表面展示系統(tǒng)適合展示各種真核蛋白，包括酶、細(xì)胞識(shí)別因子、受體、抗體、抗原等，被廣泛地應(yīng)用于蛋白質(zhì)工程、全細(xì)胞催化、生物轉(zhuǎn)化、細(xì)胞吸附、分子識(shí)別、生物治療、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、生物傳感器和疫苗等領(lǐng)域。外源蛋白與載體蛋白的融合方式有C末端融合、N末端融合、插入融合。對(duì)某些外源蛋白，選擇恰當(dāng)?shù)娜诤戏绞娇梢悦黠@改善展示效果或蛋白的功能特性，如Aga2p蛋白有良好的柔性，外源蛋白可以以N末端或C末端兩種方式與其融合。研究表明抗CD3ε單鏈抗體融合于Aga2p蛋白C末端時(shí)，其親和力較天然蛋白降低30～100倍[5]，而融合于N末端時(shí)活性得以恢復(fù)。2021/5/96酵母表面展示系統(tǒng)的類型最常見的酵母表面展示表達(dá)系統(tǒng)包括:凝集素展示表達(dá)和絮凝素展示表達(dá)凝集素展示表達(dá)系統(tǒng)是將外源基因與酵母編碼凝集素C端編碼序列(含GPI錨定信號(hào)序列)連接后插入質(zhì)粒載體的信號(hào)肽下游，融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)后，信號(hào)肽引導(dǎo)嵌合蛋白向細(xì)胞外分泌，由于融合蛋白C末端存在含GPI錨定信號(hào)的凝集素多肽序列，可將蛋白錨定在酵母細(xì)胞壁中，從而將蛋白分子展示表達(dá)在酵母細(xì)胞表面。2021/5/97絮凝素展示表達(dá)系統(tǒng)利用絮凝素基因與外源蛋白融合，并將融合蛋白展露表達(dá)在細(xì)胞表面，此系統(tǒng)又包括兩個(gè)子系統(tǒng):GPI錨定系統(tǒng)和絮凝結(jié)構(gòu)域錨定系統(tǒng)。GPI錨定系統(tǒng)是利用絮凝素Flo1p的C末端含有的GPI信號(hào)錨定外源蛋白，此系統(tǒng)與凝集素展示相似;絮凝結(jié)構(gòu)域錨定系統(tǒng)是利用Flo1p的中間絮凝功能結(jié)構(gòu)域與外源蛋白融合，通過絮凝功能結(jié)構(gòu)域識(shí)別酵母細(xì)胞壁中的甘露聚糖鏈并以非共價(jià)作用誘導(dǎo)細(xì)胞粘附、聚集成可逆性絮狀物2021/5/98酵母表面展示系統(tǒng)的應(yīng)用酵母表面展示與酒精發(fā)酵傳統(tǒng)的酒精發(fā)酵是以淀粉質(zhì)谷物或糖蜜為原料。隨著燃料酒精需求的日益增長(zhǎng)，以天然纖維素類資源生產(chǎn)酒精的研究也日益受到人們重視。由于纖維素類物質(zhì)是自然界中一種潛在的可再生資源，對(duì)解決未來能源問題有著巨大的潛力，因此，天然纖維素酒精發(fā)酵具有重要意義。Fujita等成功地將三種纖維素水解酶同時(shí)展示在釀酒酵母表面，從而構(gòu)建了能夠增效和按順序降解纖維素的全細(xì)胞生物催化劑。2021/5/99酵母表面展示系統(tǒng)與新藥篩選將未知功能的目的基因產(chǎn)物或特定病理過程相關(guān)蛋白產(chǎn)物展示在酵母表面，對(duì)cDNA表達(dá)文庫(kù)或突變體庫(kù)進(jìn)行篩選，能發(fā)現(xiàn)與這些未知功能的基因產(chǎn)物或病理過程相關(guān)產(chǎn)物發(fā)生相互作用的物質(zhì)，有助于對(duì)未知基因功能的研究，并能發(fā)現(xiàn)一些藥物作用的新靶點(diǎn)，或篩選到治療疾病的新藥先導(dǎo)化合物。Visintin等將酵母表面展示技術(shù)與酵母雙雜交技術(shù)相結(jié)合，將抗體的單鏈（scFv）片斷連接到轉(zhuǎn)錄因子VP16的激活結(jié)構(gòu)域(AD)上，將抗原連接到酵母LexA的結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DB)上，以His3和LacZ為報(bào)告基因，建立抗原抗體相互作用的展示方法。當(dāng)抗原-抗體發(fā)生相互作用時(shí)，AD和DB的結(jié)合將啟動(dòng)報(bào)告基因的表達(dá)，可通過營(yíng)養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基進(jìn)行檢測(cè)。這種方法從scFv突變體展示庫(kù)中將有可能篩選到抗原特異的抗體，為疫苗及抗體類藥物的研制提供良好的平臺(tái)。2021/5/910酵母細(xì)胞表面展示與生物吸附環(huán)境污染物的生物修復(fù)是以酶促降解或生物吸附為基礎(chǔ)的，例如微生物對(duì)重金屬的吸附就包括兩種途徑:(1)與細(xì)胞表面復(fù)合物結(jié)合，(2)逐漸吸收在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行消化。然而通過胞內(nèi)消化降解有毒物質(zhì)必須使細(xì)胞內(nèi)酶，蛋白質(zhì)或污染物跨越細(xì)胞膜這一屏障，比較緩慢及效率低而且不可重復(fù)利用。利用表面展示技術(shù)能較好地解決這一問題，吸附蛋白直接展示在細(xì)胞表面，不僅使吸附過程快捷高效還可以利用回復(fù)劑如EDTA對(duì)其進(jìn)行處理使之不斷重復(fù)利用。2021/5/911酵母表面展示與酶技術(shù)酶的固定化是指借助物理或者化學(xué)方法將酶固定于特殊的相，使得酶與整體流體分開，但是仍然能夠進(jìn)行底物和效應(yīng)物分子交換并發(fā)揮其催化效能的一種技術(shù)。與游離酶相比，固定化酶提高了酶的穩(wěn)定性，并使酶能夠反復(fù)回收利用。但是，傳統(tǒng)的固定化方法也會(huì)產(chǎn)生一些不利因素，例如由于增加固定化操作，導(dǎo)致酶固定化過程中的活性收率損失；另外由于固定化操作需用載體，因而增加了載體成本費(fèi)和固定化操作費(fèi)用。利用表面展示技術(shù)將具有催化活性的酶展示于酵母等微生物細(xì)胞表面就形成了