氨基酸鑒定實驗報告

氨基酸鑒定（紙層析法）醋酸纖維薄膜電泳分離血清蛋白實驗目的掌握醋酸纖維素薄膜電泳法分離血清蛋白的原理和方法。學習氨基酸紙層析法的基本原理掌握氨基酸紙層析的操作技術二.實驗原理實驗原理1） 氨基酸的分離鑒定一一氏層析法紙層析法（paperchromatography）是生物化學上分離、鑒定氨基酸混合物的常用技術，可用于蛋白質的氨基酸成分的定性鑒定和定量測定；也是定性或定量測定多肽、核酸堿基、糖、有機酸、維生素、抗菌素等物質的一種分離分析工具。紙層析法是用濾紙作為惰性支持物的分配層析法，其中濾紙纖維素上吸附的水是固定相，展層用的有機溶溶劑是流動相。在層析時，將樣品點在距濾紙一端約2?3cm的某一處，該點稱為原點；然后在密閉容器中層析溶劑沿濾紙的一個方向進行展層，這樣混合氨基酸在兩相中不斷分配，由于分配系數(shù)（Kd）不同，結果它們分布在濾紙的不同位置上。物質被分離后在紙層析圖譜上的位置可用比移值（rateofflow,Rf）來表示。所謂Rf，是指在紙層析中，從原點至氨基酸停留點（又稱為層析點）中心的距離（X）與原點至溶劑前沿的距離（Y）的比值：原點至層析點中心的距離 X原點至溶劑前沿的距離一=亍-在一定條件下某種物質的Rf值是常數(shù)。Rf值的大小與物質的結構、性質、溶劑系統(tǒng)、溫度、濕度、層析濾紙的型號和質量等因素有關。2） 血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳電泳的概念：帶電物質在電場中向相反電極移動的現(xiàn)象稱為電泳.醋酸纖維是纖維素的醋酸酯，由纖維素的羥基經乙?；?。涂抹成均勻的薄膜則成為醋酸纖維素薄膜。該膜具有均一的泡沫狀的結構，有強滲透性，厚度約為120微米。醋酸纖維素薄膜電泳有以下優(yōu)點：微量、快速、簡便、分辨力高、對樣品無拖尾和吸附現(xiàn)象蛋白質是兩性電解質。在pH值小于其等電點的溶液中，蛋白質為正離子，在電場中向陰極移動；在pH值大于其等電點的溶液中，蛋白質為負離子，在電場中向陽極移動。血清中含有數(shù)種蛋白質，它們所具有的可解離基團不同，在同一pH的溶液中，所帶凈電荷不同，故可利用電泳法將它們分離。血清中含有白蛋白、a-球蛋白、p-球蛋白、Y-球蛋白等，各種蛋白質由于氨基酸祖墳、立體構象、相對分子質量、等電點及形狀不同，在電場中遷移速度不同。由表可知，血清中5種蛋白質的等電點大部分低于pH值7.0，所以在pH8.6的緩沖液中，它們都電離成負離子，在電場中向陽極移動。蛋白質名稱等電點相對分子質量白蛋白4.8869000a1-球蛋白5.06200000a2-球蛋白5.06300000

&-球蛋白y-球蛋白5.126.85~7.5090000~150000156000~300000在一定范圍內，蛋白質的含量與結合的燃染料量成正比，故可將蛋白質區(qū)帶剪下，分別用0.4mol/LNaOH溶液浸洗下來，進行比色，測定其相對含量。也可以將染色后的薄膜直接用光密度計掃描，測定其相對含量。腎病、彌漫性肝損害、肝硬化、原發(fā)性肝癌、多發(fā)性骨髓瘤、慢性炎癥、妊娠等都可以使白蛋白下降。腎病時a1、a2、&球蛋白升高，y-球蛋白降低。肝硬化時a2、&-球蛋白降低，而a1、y-球蛋白升高。實驗試劑酸相容劑：V（正丁醇）：V（88%甲酸）：V（水）=15:3:2顯色儲備液巴比妥-巴比妥鈉緩沖液：取兩個大燒杯，分別稱取巴比妥鈉和巴比妥溶解于500ml蒸餾水中；透明液（20ml每組）：無水乙醇：冰醋酸=7：3染色液（可重復使用，使用后回收）漂洗液（100ml每組）：95%乙醇45ml，冰醋酸5ml，水50ml實驗操作1）氨基酸的分離鑒定一一氏層析法準備濾紙取層析濾紙（長18cm、寬14cm）一張，在紙的一端距邊緣2?3cm處用鉛筆劃一條直線，在此直線上每間隔2.5cm作一記號。點樣用毛細管將各氨基酸樣品及待測樣品分別點在這5個位置上，干后重復點樣2?3次。每點在紙上擴散的直徑最大不超過3mm。3.擴展將濾紙粘成筒狀，紙的兩邊不能接觸。將盛有約20ml擴展劑的培養(yǎng)皿迅速置于密閉的層析缸中，并將濾紙直立于培養(yǎng)皿中（點樣的一端在下，擴展劑的液面需低于點樣線1cm）。待溶劑上升15?20cm時即取出濾紙，用鉛筆描出溶劑前沿界線，自然干燥或用吹風機熱風吹干。判斷樣品氨基酸種類根據樣品及標準氨基酸的層析點判斷待測樣品所含氨基酸種類2）血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳1.薄膜浸泡:提前將醋酸纖維薄膜浸泡30min以上；電泳儀檢查：水平檢查，電源檢查；電泳槽的準備：在兩個電極槽中，各倒入等體積的電極緩沖液。將濾紙條對折，翻過來，用電極緩沖液完全浸濕，架在電泳槽的四個膜支架上，使濾紙一端的長邊與支架前沿對齊，另一端浸入電極緩沖液內。用玻璃棒輕輕擠壓在膜支架上的濾紙以驅逐氣泡，使濾紙的一端能緊貼在膜支架上。濾紙條是兩個電極槽聯(lián)系醋酸纖維素薄膜的橋梁，故稱為濾紙橋。點樣：取新鮮血清于載玻片上，將蓋玻片掰呈適宜大小，使一邊小于薄膜寬度。把浸泡好的可用的醋酸纖維素薄膜取出，用濾紙吸去表面多余的液體，然后平鋪在濾紙上，將蓋玻片在血清中輕輕劃一下，再在膜條一端1.5?2cm處輕輕地水平落下并迅速提起，即在膜條上點上了細條狀的血清樣品，呈淡黃色。5.電泳:用鑷子將點樣端的薄膜平貼在陰極電泳槽支架的濾紙橋上（點樣面朝下）、另一端平貼在陽極端支架上，用鑷子將其中氣泡趕出。要求薄膜緊貼濾紙橋并繃直，中間不能下垂。蓋上電泳槽蓋。接好電路，調節(jié)電壓到90V，預電泳10min，再調電壓至110V，電泳時間50min?1h。染色：將染液倒入大培養(yǎng)皿中，電泳完畢立即用鑷子取出薄膜，直接浸入染色液中，染色9min，然后取出。漂洗：配制好漂洗液，將染色完畢的薄膜自染液中取出，直接放入漂洗液中，連續(xù)更換幾次漂洗液，直到薄膜背景幾乎無色為止。定量定量有以下兩種方法：(1)將上述漂凈的薄膜用濾紙吸干，剪下薄膜上各條蛋白質色帶，另取一條與各區(qū)帶近似寬度的無蛋白附著的空白薄膜，分別浸于4.0ml0.4mol/LNaOH溶液中，37°C水浴5-10分鐘，色澤浸出后，用722分光光度計在590nm處比色，以空白膜條洗出液為空白調零，測定各管的吸光度。設各部分吸光度分別為：A、A、A、A、A。則吸光度總和(A)為：白 al a2 py 總偵A+Aai+Aa2+A+Ay白蛋白=A白/A總*100%a1球蛋白二A1/A總*100%a2球蛋白二A2/A總*100%P球蛋白二Ap/A總*100%Y球蛋白二Ay/A總*100%(2)待其完全干燥后，浸入透明液中約10-20分鐘，取出，平貼于干凈玻片上，干燥，即得背景透明的電泳圖譜，可用光密度計測定各蛋白斑點。此圖譜可長期保存。本法測得的血清蛋白各組正常值為：白蛋白(%)=67.42%(61.2%-74.5%)。a1球蛋白+a2球蛋白邙球蛋白(%)=16.92%(11.2%-22%)。Y球蛋白(%)=15.84%(10.4%-20.6%)四.實驗結果及分析氨基酸的分離鑒定一一氏層析法樣品編號：Y38氨基酸種類：GlyAlaPhe血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳白蛋白a.球蛋白a球蛋白。球蛋白＞球蛋白總吸光度A0.570.030.0570.070.1340.861白蛋白=A白/A總*100%=66.20%a1球蛋白二A1/A總*100%=3.48%a2球蛋白二A2/A總*100%=6.62%P球蛋白二%/A總*100%=8.13%Y球蛋白二人丫/A總*100%=15.56%討論氨基酸紙層析第一次時五個氨基酸點均在劃線處沒有跑上去將濾紙放入層析缸的時候反復打開，取出，導致層析液大量揮發(fā)，層析液各組分比例變化，無法起到層析作用。因此加入濾紙時要迅速。第一次跑電泳時條帶不分明，黏在一起，沒跑開醋酸纖維薄膜侵泡后取出時間過長，導致電泳時纖維干燥，電泳速度慢，且不分離。應當浸泡足夠的時間，取出后稍微吸干多余水分立即點樣第一次跑電泳時條帶不成帶狀可能原因如下，1）侵泡時沒有一下放進去，薄膜浸泡不均勻，導致電泳速度不一致2）電泳槽紗布不平整，與薄膜接觸不均勻，導致電泳速率不一致蛋白百分含量變化的臨床意義腎病、彌漫性肝損害、肝硬化、原發(fā)性肝癌、多發(fā)性骨髓瘤、慢性炎癥、妊娠等都可以使白蛋白