醬油中黃曲霉毒素B1的測(cè)定

生物技術(shù)及應(yīng)用專業(yè)教學(xué)資源庫《生物產(chǎn)品的分析與檢驗(yàn)》醬油的分析與檢驗(yàn)

-----醬油中黃曲霉毒素B1的測(cè)定主講教師：畢靜瑩目錄1．簡(jiǎn)介2.醬油中黃曲霉毒素B1的測(cè)定檢測(cè)原理試劑和材料儀器和設(shè)備分析步驟結(jié)果計(jì)算簡(jiǎn)介▲黃曲霉毒素B1(AflatoxinB1，簡(jiǎn)寫為AFB1)是二氫呋喃氧雜萘鄰?fù)难苌??！鳤FB1是已知化學(xué)物質(zhì)中致癌性最強(qiáng)的一種，對(duì)包括人和若干動(dòng)物具有強(qiáng)烈的毒性，其毒性作用主要是對(duì)肝臟的損害?！烊皇澄镏幸訟FB1最為多見，危害性也最強(qiáng)，國(guó)家質(zhì)檢總局規(guī)定AFB1是大部分食品的必檢項(xiàng)目之一?！锇凑誈B5009.22—2016食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中黃曲霉毒素B族和G族的測(cè)定進(jìn)行。醬油中黃曲霉毒素B1的測(cè)定（薄層色譜法）02薄層色譜法檢測(cè)原理▲樣品經(jīng)提取、濃縮、薄層分離后，黃曲霉毒素B1在紫外光(波長(zhǎng)365nm)下產(chǎn)生藍(lán)紫色熒光，根據(jù)其在薄層上顯示熒光的最低檢出量來測(cè)定含量?！橇碛姓f明，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水。試劑▲甲醇(CH3OH)▲正己烷(C6H14)▲石油醚(沸程30~60℃或60~90℃)▲三氯甲烷(CHCl3)▲苯(C6H6)試劑和材料▲乙腈(CH3CN)▲無水乙醚(C2H6O)▲丙酮(C3H6O)注：以上試劑在試驗(yàn)時(shí)先進(jìn)行一次試劑空白試驗(yàn)，如不干擾測(cè)定即可使用，否則需逐一進(jìn)行重蒸。▲硅膠G：薄層層析用▲三氟乙酸(CF3COOH)▲無水硫酸鈉(Na2SO4)▲氯化鈉(NaCl)試劑和材料▲苯-乙腈溶液(98+2)：取2mL乙腈加入98mL苯中混勻；▲甲醇-水溶液(55+45)：取550mL甲醇加入450mL水中混勻；▲甲醇-三氯甲烷(4+96)：取4mL甲醇加入96mL三氯甲烷中混勻；▲丙酮-三氯甲烷(8+92)：取8mL丙酮加入92mL三氯甲烷中混勻；試劑配制▲次氯酸鈉溶液(消毒用)：*取100g漂白粉，加入500mL水，攪拌均勻；*另將80g工業(yè)用碳酸鈉(Na2CO3·10H2O)溶于500mL溫水中；*將兩液混合、攪拌、澄清后過濾。此濾液含次氯酸濃度約為25g/L?！鳤FTB1標(biāo)準(zhǔn)品(C17H12O6，CAS號(hào):1162-65-8)：純度≥98%，或經(jīng)國(guó)家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。標(biāo)準(zhǔn)品▲AFTB1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(10μg/mL)：準(zhǔn)確稱取1~1.2mgAFTB1標(biāo)準(zhǔn)品，先加入2mL乙腈溶解后，再用苯稀釋至100mL，避光，置于4℃冰箱保存，此溶液濃度約10μg/mL。標(biāo)準(zhǔn)溶液配制▲純度的測(cè)定：取5μL10μg/mLAFTB1標(biāo)準(zhǔn)溶液，滴加于涂層厚度0.25mm的硅膠G薄層板上，用甲醇-三氯甲烷與丙酮-三氯甲烷展開劑展開，在紫外光燈下觀察熒光的產(chǎn)生，應(yīng)符合以下條件：a)在展開后，只有單一的熒光點(diǎn)，無其他雜質(zhì)熒光點(diǎn);b)原點(diǎn)上沒有任何殘留的熒光物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制▲AFTB1標(biāo)準(zhǔn)工作液：*準(zhǔn)確吸取1mL標(biāo)準(zhǔn)溶液儲(chǔ)備液于10mL容量瓶中，加苯-乙腈混合液至刻度，混勻。此溶液每毫升相當(dāng)于1.0μgAFTB1。*吸取1.0mL此稀釋液，置于5mL容量瓶中，加苯-乙腈混合液稀釋至刻度，此溶液每毫升相當(dāng)于0.2μgAFTB1。*再吸取AFTB1標(biāo)準(zhǔn)榕液(0.2μg/mL)1.0mL置于5mL容量瓶中，加苯-乙腈混合液稀釋至刻度。此溶液每毫升相當(dāng)于0.04μgAFTB1?！鴪A孔篩：2.0mm篩孔孔徑；▲小型粉碎機(jī)；▲電動(dòng)振蕩器；▲全玻璃濃縮器；儀器和設(shè)備▲玻璃板：5cm×20cm；▲薄層板涂布器；注：可選購(gòu)適用黃曲霉毒素檢測(cè)的商品化薄層板

▲展開槽：長(zhǎng)25cm，寬6cm，高4cm；▲紫外光燈：100~125W，帶365nm濾光片；▲微量注射器或血色素吸管。儀器和設(shè)備▲警示：整個(gè)操作需在暗室條件下進(jìn)行。

▲稱取10.00g試樣于小燒杯中，為防止提取時(shí)乳化，加0.4g氯化鈉，移入分液漏斗中，用15mL三氯甲烷分次洗滌燒杯，洗液一并移入分液漏斗中?！駬u2min，靜置分層，如出現(xiàn)乳化現(xiàn)象可滴加甲醇促使分層。分析步驟樣品提取▲放出三氯甲烷層，經(jīng)盛有約10g預(yù)先用三氯甲烷濕潤(rùn)的無水硫酸鈉的定量慢速濾紙過濾于50mL蒸發(fā)皿中，再加5mL三氯甲烷于分液漏斗中，重復(fù)振搖提取，三氯甲烷層一并濾于蒸發(fā)皿中，最后用少量三氯甲烷洗過濾器，洗液并于蒸發(fā)皿中?！鴮⒄舭l(fā)血放在通風(fēng)柜于65℃水浴上通風(fēng)揮干，然后放在冰盒上冷卻2~3min后，準(zhǔn)確加入1mL苯-乙腈混合液。▲用帶橡皮頭的滴管的管尖將殘?jiān)浞只旌?，若有苯的結(jié)晶析出，將蒸發(fā)皿從冰盒上取出，繼續(xù)溶解、混合，晶體即消失，再用此滴管吸取上清液轉(zhuǎn)移于2mL具塞試管中。▲最后加入2.5mL苯-乙腈混合液，此溶液每毫升相當(dāng)于4g試樣?！鴨蜗蛘归_法薄層板的制備▲稱取約3g硅膠G，加相當(dāng)于硅膠量2~3倍的水，用力研磨1~2min至成糊狀后立即倒于涂布器內(nèi)，推成5cm×20cm，厚度約0.25mm的薄層板三塊。在空氣中干燥約15min后，在100℃活化2h，取出，放干燥器中保存。一般可保存2~3d，若放置時(shí)間較長(zhǎng)，可再活化后使用。測(cè)定▲將薄層板邊緣附著的吸附劑刮凈，在距薄層板下端3cm的基線上用微量注射器或血色素吸管滴加樣液。一塊板可滴加4個(gè)點(diǎn)，點(diǎn)距邊緣和點(diǎn)間距約為1cm，點(diǎn)直徑約3mm。在同一塊板上滴加點(diǎn)的大小應(yīng)一致，滴加時(shí)可用吹風(fēng)機(jī)用冷風(fēng)邊吹邊加。點(diǎn)樣▲滴加樣式如下：第一點(diǎn)：0μLAFTB1標(biāo)準(zhǔn)工作液(0.04μg/mL)。第二點(diǎn)：20μL樣液。第三點(diǎn)：20μL樣液+10μL0.04μg/mLAFTB1標(biāo)準(zhǔn)工作液。第四點(diǎn)：20μL樣液+10μL0.2μg/mLAFTB1標(biāo)準(zhǔn)工作液?！谡归_槽內(nèi)加10mL無水乙醚，預(yù)展12cm，取出揮干。再于另一展開槽內(nèi)加10mL丙酮-三氯甲烷(8+92)，展開10~12cm，取出。展開與觀察在紫外光下觀察結(jié)果，方法如下：▲樣液點(diǎn)上加滴AFTB1標(biāo)準(zhǔn)工作液，可使AFTB1標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)與樣液中的AFTB1熒光點(diǎn)重疊。如樣液為陰性，薄層板上的第三點(diǎn)中AFTB1為0.0004μg，可用作檢查在樣液內(nèi)AFTB1最低檢出量是否正常出現(xiàn)；如為陽性，則起定性作用。薄層板上的第四點(diǎn)中AFTB1為0.002μg，主要起定位作用?！舻诙c(diǎn)在與AFTB1標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的相應(yīng)位置上無藍(lán)紫色熒光點(diǎn)，表示試樣中AFTB1含量在5μg/kg以下，如在相應(yīng)位置上有藍(lán)紫色熒光點(diǎn)，則需進(jìn)行確證試驗(yàn)?！鵀榱俗C實(shí)薄層板上樣液熒光系由AFTB1產(chǎn)生的，加滴三氟乙酸，產(chǎn)生AFTB1的衍生物，展開后此衍生物的比移值在0.1左右。確證試驗(yàn)▲第一點(diǎn)：0.04μg/mLAFTB1標(biāo)準(zhǔn)工作液10μL?！诙c(diǎn)：20μL樣液。于以上兩點(diǎn)各加一小滴三氟乙酸蓋于其上，反應(yīng)5min后，用吹風(fēng)機(jī)吹熱風(fēng)2min后，使熱風(fēng)吹到薄層板上的溫度不高于40℃，再于薄層板上滴加以下兩個(gè)點(diǎn)。于薄層板左邊依次滴加兩個(gè)點(diǎn)▲第三點(diǎn)：0.04μg/mLAFTB1標(biāo)準(zhǔn)工作液10μL?！谒狞c(diǎn)：20μL樣液。▲再展開，在紫外光燈下觀察樣液是否產(chǎn)生與AFTB1標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)相同的衍生物。未加三氟乙酸的三、四兩點(diǎn)，可依次作為樣液與標(biāo)準(zhǔn)的衍生物空白對(duì)照?！鴺右褐械腁FTB1熒光點(diǎn)的熒光強(qiáng)度如與AFTB1標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的最低檢出量(0.0004μg)的熒光強(qiáng)度一致，則試樣中AFTB1含量即為5μg/kg?！鐦右褐袩晒鈴?qiáng)度比最低檢出量強(qiáng)，則根據(jù)其強(qiáng)度估計(jì)減少滴加微升數(shù)或?qū)右合♂尯笤俚渭硬煌⑸龜?shù)，直至樣液點(diǎn)的熒光強(qiáng)度與最低檢出量的熒光強(qiáng)度一致為止。稀釋定量▲滴加式樣如下：第一點(diǎn)：10μLAFTB1標(biāo)準(zhǔn)工作液(0.04μg/mL)。第二點(diǎn)：根據(jù)情況滴加10μL樣液。第三點(diǎn)：根據(jù)情況滴加15μL樣液。第四點(diǎn)：根據(jù)情況滴加20μL樣液。試樣中AFTB1的含量按式(5)計(jì)算:式中:X———試樣中AFTB1的含量，單位為微克每千克(μg/kg);0.0004———AFTB1的最低檢出量，單位為微克(μg);V1———加入苯-乙腈混合液的體積，單位為毫升(mL);f———樣液的總稀釋倍數(shù);V2———出現(xiàn)最低熒光時(shí)滴加樣液的體積，單位為毫升(mL);