未知基因驗(yàn)證

現(xiàn)在，研究人員開發(fā)出一種在酵母中分析這種基因功能的新方法。研究人員用一種可熱誘導(dǎo)的“Degron來標(biāo)記一個目標(biāo)蛋白，標(biāo)記物使得該蛋白在37攝氏度易發(fā)生蛋白水解，而且，當(dāng)一個重要蛋白在活體中被破壞時，可對由該蛋白功能損失所產(chǎn)生的結(jié)果進(jìn)行判別。研究人員采用這種方法來篩選細(xì)胞周期演進(jìn)中的缺陷，在酵母中識別出三種DNA復(fù)制因子。雙鏈RNA對基因表達(dá)的抑制及其應(yīng)用細(xì)胞中存在的絕大多數(shù)RNA分子都是單鏈的，在遺傳信息傳遞及蛋白質(zhì)合成過程中發(fā)揮作用。DsRNA通常是感染細(xì)胞的病毒在復(fù)制過程中RNA合成的中間產(chǎn)物或一些DNA序列兩條互補(bǔ)鏈轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物相互結(jié)合的副產(chǎn)物。早期的研究揭示dsRNA會通過干擾素途徑誘導(dǎo)產(chǎn)生一種蛋白激酶從而抑制被感染細(xì)胞中的蛋白質(zhì)合成，但并不清楚dsRNA如何影響受感染細(xì)胞的正?；虮磉_(dá)及其功能。RNAi（RNAinterference）是指外源性雙鏈RNA（dsRNA）能抑制細(xì)胞內(nèi)與其序列同源的基因的表達(dá)，在進(jìn)化上，這可能是生物調(diào)控基因表達(dá)及抵御病毒侵染或轉(zhuǎn)座子誘導(dǎo)DNA突變的一種共有的生理機(jī)制。自1998年Fire證明RNAi可被應(yīng)用于研究線蟲基因的功能以來，已取得了巨大的進(jìn)展。尤其是在人類及小鼠基因組計(jì)劃相繼完成，研究的重心已從大規(guī)模測序階段轉(zhuǎn)移到功能基因組的背景下，我們面臨的是如何詮釋這些遺傳信息、如何將這些序列信息與生物學(xué)功能關(guān)聯(lián)起來。而RNAi為我們研究未知功能的基因提供了新的反向遺傳學(xué)手段，同時在人類基因治療方面具有潛在的應(yīng)用價值。在未知功能基因的研究中，常用的反向遺傳學(xué)手段包括基于同源重組的基因敲除及利用負(fù)鏈RNA與同源mRNA通過堿基互補(bǔ)結(jié)合，從而阻止其翻譯或觸發(fā)降解機(jī)制的反義RNA抑制兩種手段，并都已成功地應(yīng)用于一些功能基因的研究。但這兩種方法都不能完全滿足日益增長的研究需求。如，基因敲除能從根本上消除目標(biāo)基因的活性，是經(jīng)典的反向遺傳學(xué)手段，但由于常規(guī)的基因敲除試驗(yàn)需要：（1）構(gòu)建含突變位點(diǎn)的目標(biāo)基因載體；（2）導(dǎo)入胚胎干細(xì)胞（ES）細(xì)胞；（3）篩選含重組構(gòu)件的ES細(xì)胞；（4）將上述ES細(xì)胞注入囊胚腔；（5）通過嵌合體F1代自交以產(chǎn)生帶突變純合體的F2代，這往往需要幾個月的時間，不利于在短期內(nèi)研究數(shù)量較多的未知功能基因。同時，若希望一次性敲除兩個或多個基因，對于基因敲除也是一大難題。此外，若希望研究某一突變致死基因在特定胚胎發(fā)育階段的功能，基因敲除可能也無法滿足研究的需求，因?yàn)榕咛タ赡茉谠缙诰鸵驗(yàn)槿笔Т嘶蚨劳觥Ｔ谀承┲圃旎蚯贸齽游锬Ｐ褪掷щy或因倫理學(xué)原因根本就不可能進(jìn)行的物種中（如大型動物及人），基因敲除也無法應(yīng)用。對于反義RNA抑制手段，雖然應(yīng)用于果蠅中已取得了較好的效果，但在爪蟾Xenopus）、斑馬魚（Zebrafish）及小鼠胚胎中反義RNA不能穩(wěn)定可靠地降低目標(biāo)基因（例如Mos，Plat）的表達(dá)。同時，由于反義RNA技術(shù)對內(nèi)源性基因表達(dá)的抑制較弱，往往產(chǎn)生過渡性的表型，這也妨礙了我們對目標(biāo)基因功能的準(zhǔn)確判斷。RNAi可以有效地彌補(bǔ)基因敲除與反義RNA抑制的不足。由于RNAi作用比反義RNA技術(shù)更有效，更持久；比基因敲除更省時，可在短期內(nèi)對多個基因進(jìn)行研究（如探討與果蠅已知序列染色體上所有開放閱讀框相關(guān)聯(lián)的表型）；通過導(dǎo)入多種dsRNA，可以研究一系列基因的功能及他們之間的相互關(guān)系，特別是研究母源性mRNA對卵母細(xì)胞及胚胎后繼發(fā)育的影響具有其他方法無法比擬的優(yōu)勢，因此具有廣闊的應(yīng)用前景。最近，Elbashir使用21bpdsRNA避免了干擾素引起的細(xì)胞非特異性應(yīng)激反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)了在一系列哺乳類細(xì)胞系中，包括人類Hela及胚胎性腎細(xì)胞系293中dsRNA對特定基因表達(dá)的抑制作用，進(jìn)一步擴(kuò)大了RNAi的應(yīng)用范圍，并為利用dsRNA進(jìn)行基因治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。盡管許多基因RNAi的表型與其基因敲除后的表型吻合得很好，但RNAi并不適用于所有的基因，如dsRNA對一些在神經(jīng)細(xì)胞中發(fā)揮功能的基因抑制作用不明顯。同時，dsRNA會抑制細(xì)胞內(nèi)所有具序列同源性的基因表達(dá)，因此與RNAi相關(guān)聯(lián)的表型可能反映了一個基因家族中幾個高度相關(guān)的基因缺失所導(dǎo)致的共同表型，而不僅僅是某一個特定的基因。此外，一些不相關(guān)基因也有可能因?yàn)榫植啃蛄械南嗨菩远蔀閐sRNA的抑制作用對象。但上述問題都可以通過合理的dsRNA設(shè)計(jì)加以克服。此外，雖然dsRNA能有效抑制目標(biāo)基因的表達(dá)，但必須意識到dsRNA的抑制作用是在轉(zhuǎn)錄后水平上實(shí)現(xiàn)的，并不是完全的。因此，RNAi作用后，一些基因依然可能保持低水平的基因表達(dá)。在研究未知基因的功能時必須考慮到RNAi的這些特點(diǎn)。問題與展望dsRNA能特異性抑制同源基因表達(dá)的發(fā)現(xiàn)引起了越來越多研究者的興趣。目前對于RNAi的作用機(jī)制已有了較深入的認(rèn)識，但依然有許多方面尚不明了，如介導(dǎo)降解mRNA的核糖核蛋白復(fù)合物(RNP)的構(gòu)成及其行使功能的機(jī)制，rde-1和rde-4在dsRNA降解及小片段dsRNA傳遞到RNP過程中如何行使其功能，及推測中的螺旋酶尚未得到鑒定等等。然而，這并不妨礙RNAi成為研究線蟲功能基因組的有力手段之一，并已被越來越多的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用于未知基因功能的研究。當(dāng)前，人類的基因組計(jì)劃已完成，而另一個重要的模式動物-小鼠基因組計(jì)劃也即將完成，RNAi無疑可以在這些物種的大規(guī)模功能基因組的研究中發(fā)揮重要的作用。目前越來越多的基因測序工作已完成，接下來的問題是這些基因的功能是什么、不同的基因參與了哪些細(xì)胞內(nèi)不同的生命過程、基因表達(dá)的調(diào)控、基因與基因產(chǎn)物之間的相互作用、以及相同的基因在不同的細(xì)胞內(nèi)或者疾病和治療狀態(tài)下表達(dá)水平等等。因此，在人類基因組項(xiàng)目后，轉(zhuǎn)錄組的研究迅速受到科學(xué)家的青睞。轉(zhuǎn)錄組學(xué)(transcriptomics)就是在基因組學(xué)后新興的一門學(xué)科，即研究細(xì)胞在某一功能狀態(tài)下所含mRNA的類型與拷貝數(shù)。以DNA為模板合成RNA的轉(zhuǎn)錄過程是基因表達(dá)的第一步，也是基因表達(dá)調(diào)控的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。所謂基因表達(dá)，是指基因攜帶的遺傳信息轉(zhuǎn)變?yōu)榭杀鎰e的表型的整個過程。轉(zhuǎn)錄組就是轉(zhuǎn)錄后的所有mRNA的總稱。與基因組不同的是，轉(zhuǎn)錄組的定義中包含了時間和空間的限定。同一細(xì)胞在不同的生長時期及生長環(huán)境下，其基因表達(dá)情況是不完全相同的。人類基因組包含有30億個堿基對，其中大約只有5萬個基因轉(zhuǎn)錄成mRNA分子，轉(zhuǎn)錄后的mRNA能被翻譯生成蛋白質(zhì)的也只占整個轉(zhuǎn)錄組的40%左右。通常，同一種組織表達(dá)幾乎相同的一套基因以區(qū)別于其他組織，如：腦組織或心肌組織等分別只表達(dá)全部基因中不同的30%而顯示出組織的特異性。轉(zhuǎn)錄組譜可以提供什么條件下什么基因表達(dá)的信息，并據(jù)此推斷相應(yīng)未知基因的功能，揭示特定調(diào)節(jié)基因的作用機(jī)制。通過這種基于基因表達(dá)譜的分子標(biāo)簽，不僅可以辨別細(xì)胞的表型歸屬，還可以用于疾病的診斷。例如：阿爾茨海默病(Alzheimer'diseases,AD)中，出現(xiàn)神經(jīng)原纖維纏結(jié)的大腦神經(jīng)細(xì)胞基因表達(dá)譜就有別于正常神經(jīng)元，當(dāng)病理形態(tài)學(xué)尚未出現(xiàn)纖維纏結(jié)時，這種表達(dá)譜的差異即可以作為分子標(biāo)志直接對該病進(jìn)行診斷。同樣對那些臨床表現(xiàn)不明顯或者缺乏診斷金標(biāo)準(zhǔn)的疾病也具有診斷意義，如自閉癥。目前對自閉癥的診斷要靠長達(dá)十多個小時的臨床評估才能做出判斷?；A(chǔ)研究證實(shí)自閉癥不是由單一基因引起，而很可能是由一組不穩(wěn)定的基因造成的一種多基因病變，通過比對正常人群和患者的轉(zhuǎn)錄組差異，篩選出與疾病相關(guān)的具有診斷意義的特異性表達(dá)差異，一旦這種特異的差異表達(dá)譜被建立，就可以用于自閉癥的診斷，以便能更早地，甚至可以在出現(xiàn)自閉癥臨床表現(xiàn)之前就對疾病進(jìn)行診斷，并及早開始干預(yù)治療。轉(zhuǎn)錄組的研究應(yīng)用于臨床的的另一個例子是可以將表面上看似相同的病癥分為多個亞型，尤其是對原發(fā)性惡性腫瘤，通過轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)譜的建立，可以詳細(xì)描繪出患者的生存期以及對藥物的反應(yīng)等等。目前用于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)獲得和分析的方法主要有基于雜交技術(shù)的芯片技術(shù)包括cDNA芯片和寡聚核苷酸芯片，基于序列分析的基因表達(dá)系列分析SAGE(serialanalysisofgeneexpression，SAGE)和大規(guī)模平行信號測序系統(tǒng)MPSS(massivelyparallelsignaturesequencing,MPSS)。1991年Affymetrix公司在Southernblot基礎(chǔ)上，開發(fā)出世界上第一塊寡核苷酸基因芯片，自此微陣列技術(shù)(基因芯片)得到迅速發(fā)展和廣泛應(yīng)用，已成為功能基因組研究中最主要的技術(shù)手段。但是芯片無法同時大量地分析組織或細(xì)胞內(nèi)基因組表達(dá)的狀況，而且由于芯片技術(shù)需要準(zhǔn)備基因探針，所以可能漏掉那些未知的、表達(dá)豐度不高的、可能是很重要的調(diào)節(jié)基因°SAGE是近年來發(fā)展的以測序?yàn)榛A(chǔ)的分析特定組織或細(xì)胞類型中基因群體表達(dá)狀態(tài)的一項(xiàng)技術(shù)。其顯著特點(diǎn)是快速高效地、接近完整地獲得基因組的表達(dá)信息。SAGE可以定量分析已知基因及未知基因表達(dá)情況，在疾病組織、癌細(xì)胞等差異表達(dá)譜的研究中，SAGE可以幫助獲得完整轉(zhuǎn)錄組學(xué)圖譜、發(fā)現(xiàn)新的基因及其功能、作用機(jī)制和通路等信息。MPSS是對SAGE的改進(jìn)，它能在短時間內(nèi)檢測細(xì)胞或組織內(nèi)全部基因的表達(dá)情況，是功能基因組研究的有效工具。因其需要配套的軟硬件較為昂貴，目前國內(nèi)外的相關(guān)應(yīng)用報(bào)道不多。MPSS技術(shù)對于致病基因的識別、揭示基因在疾病中的作用、分析藥物的藥效等都非常有價值，該技術(shù)的發(fā)展將在基因組功能方面及其相關(guān)領(lǐng)域研究中發(fā)揮巨大的作用。功能基因篩選的基本策略功能基因篩選研究的基本策略包括:(1)通過表達(dá)譜差異分析、生物信息學(xué)分析和基因克隆等途徑獲得候選基因；(2)對候選基因進(jìn)行功能評價(identificationoffunction，可在基因組、轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)組和代謝產(chǎn)物等水平進(jìn)行)；(3)基因功能確證(validationoffunction);(4)決定開發(fā)戰(zhàn)略。獲得候選基因的研究路線之一是通過正常和疾病組織的表達(dá)譜差異分析(expressionprofilingofnormalanddiseasedtissues)獲得疾病的相關(guān)基因，進(jìn)一步進(jìn)行基因功能的篩選研究。該篩選策略與疾病過程密切相關(guān)，較多地應(yīng)用于新藥及治療靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)。確定候選功能基因獲得候選基因的另一研究路線是通過生物信息學(xué)分析(bioinformaticanalysis)預(yù)測、選定基因序列、克隆獲得候選基因，進(jìn)一步進(jìn)行基因功能的篩選研究。該研究策略篩選范圍廣，多用于新基因的功能探索研究。用于生物信息學(xué)分析的數(shù)據(jù)資料，主要來源于DNA芯片技術(shù)和其他相關(guān)技術(shù)測定的基因表達(dá)信息。通過與已知基因或蛋白質(zhì)序列的分析、比較可以確定候選研究基因序列長度,提供該未知基因產(chǎn)物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白類型和細(xì)胞定位等預(yù)測信息。然而由于人類基因組中約1/3的基因序列與其他基因無同源性，因此這些基因的功能不易進(jìn)行直接預(yù)測。另一方面，蛋白質(zhì)的功能表現(xiàn)還與其所處的分子環(huán)境有關(guān)，一種蛋白質(zhì)實(shí)際上與相鄰蛋白質(zhì)形成了功能網(wǎng)絡(luò)(functionalnetworks)。因此，生物信息學(xué)中的功能網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫分析，對于了解復(fù)雜信號通路及與其他基因產(chǎn)物的關(guān)系，可能會提供有價值的參考信息。除上述研究策略外,其他途徑的功能基因研究也在進(jìn)行，如直接從正?；蚣膊〗M織中克隆單一未知基因，進(jìn)行功能研究。EST技術(shù)及其在基因全長cDNA克隆上的應(yīng)用策略摘要：隨著人類基因組計(jì)劃的順利進(jìn)行，EST技術(shù)被廣泛應(yīng)用于基因識別、繪制基因表達(dá)圖譜、尋找新基因等研究領(lǐng)域。利用人類基因組研究不斷產(chǎn)生的數(shù)據(jù)，從ESTs即cDNA的部分序列入手，通過同源篩選，獲得基因部分乃至全長cDNA序列，避免或減輕了構(gòu)建與篩選cDNA文庫等繁鎖實(shí)驗(yàn)室工作。本文從原理、應(yīng)用及其在科學(xué)研究上產(chǎn)生的影響等方面對EST技術(shù)進(jìn)行了概述。表達(dá)序列標(biāo)簽（expressedsequencetags,ESTs）是指從不同組織來源的cDNA序列。這一概念首次由Adams等于1991年提出。近年來由此形成的技術(shù)路線被廣泛應(yīng)用于基因識別、繪制基因表達(dá)圖譜、尋找新基因等研究領(lǐng)域，并且取得了顯著成效。在通過mRNA差異顯示、代表性差異分析等方法獲得未知基因的cDNA部分序列后，研究者都迫切希望克隆到其全長cDNA序列，以便對該基因的功能進(jìn)行研究?？寺∪LcDNA序列的傳統(tǒng)途徑是采用噬斑原位雜交的方法篩選cDNA文庫，或采用PCR的方法，這些方法由于工作量大、耗時、耗材等缺點(diǎn)已滿足不了人類基因組時代迅猛發(fā)展的要求。而隨著人類基因組計(jì)劃的開展，在基因結(jié)構(gòu)、定位、表達(dá)和功能研究等方面都積累了大量的數(shù)據(jù)，如何充分利用這些已有的數(shù)據(jù)資源，加速人類基因克隆研究，同時避免重復(fù)工作，節(jié)省開支，已成為一個急迫而富有挑戰(zhàn)性的課題擺在我們面前，采用生物信息學(xué)方法延伸表達(dá)序列標(biāo)簽（ESTs）序列，獲得基因部分乃至全長cDNAycg，將為基因克隆和表達(dá)分析提供空前的動力，并為生物信息學(xué)功能的充分發(fā)揮提供廣闊的空間。文本將就EST技術(shù)的應(yīng)用并就其在基因全長cDNA克隆上的應(yīng)用作一較為詳細(xì)的介紹。1、 ESTs與基因識別EST技術(shù)最常見的用途是基因識別，傳統(tǒng)的全基因組測序并不是發(fā)現(xiàn)基因最有效率的方法，這一方法顯得即昂貴又費(fèi)時。因?yàn)榛蚪M中只有2%的序列編碼蛋白質(zhì)，因此一部分科學(xué)家支持首先對基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行大規(guī)模測序，即從真正編碼蛋白質(zhì)的mRNA出發(fā)，構(gòu)建各種cDNA文庫，并對庫中的克隆進(jìn)行大規(guī)模測序。Adams等提出的表達(dá)序列標(biāo)簽的概念標(biāo)志著大規(guī)模cDNA測序時代的到來。雖然ESTs序列數(shù)據(jù)對不精確，精確度最高為97%，但實(shí)踐證明EST技術(shù)可大大加速新基因的發(fā)現(xiàn)與研究。Medzhitov等通過果蠅黑胃TOLL蛋白進(jìn)行dbEST數(shù)據(jù)庫檢索，該蛋白已證實(shí)在成熟果蠅抗真菌反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，通過同源分析的方法，找到相應(yīng)的人類同源EST（登錄號為H48602），這為接下來研究人類TOLL同源蛋白的功能提供了很好的條件。hMSH5基因是從釀酒酵母菌MSH5存在30%的一致性，它與hMSH4特異性相互作用，在減數(shù)分裂和精子發(fā)生過程中發(fā)揮一定的作用。由此可見，應(yīng)用EST技術(shù)，可以跳過生物分類學(xué)的界限，從生物模型的已識別基因迅速克隆出人和小鼠基因組相應(yīng)的更復(fù)雜的未知基因。生物間在核苷酸水平上的進(jìn)貨差異阻礙了傳統(tǒng)意義上的雜交或以PCR為基礎(chǔ)的基因克隆策略，即使是親緣關(guān)系很接近的生物也不例外，如C.elegans和C.briggsae，它們僅在2?5千萬年前分化形成。而通過計(jì)算機(jī)進(jìn)行dbEST進(jìn)行數(shù)據(jù)庫篩選，其配制是電子雜交實(shí)驗(yàn)，提供了一條更為廣泛的基因識別路線，這一路線允許基因組間存在差異，這使得基因識別與新基因克隆策略發(fā)生革命性變化，同時它也提供了一個足夠大小和復(fù)雜的基因數(shù)據(jù)庫，目前，ESTs數(shù)量正以平均每月10萬條的速度遞增。2、 ESTs和物理圖譜構(gòu)建ESTs在多種以基因?yàn)榛A(chǔ)的人和植物基因組物理圖譜構(gòu)建中扮演著重要角色。在這一應(yīng)用中，從ESTs發(fā)展起來的PCR或雜交分析可用來識別YACs、BACs或其他含有大片段插入克隆類型的載體，它們是構(gòu)建基因組物理圖譜的基礎(chǔ)，將EST與基因組物理圖譜相比較即可辨認(rèn)出含有剩余基因序列的基因組區(qū)間，包括調(diào)控基因表達(dá)的DNA控制元件，對這些元件進(jìn)行分析就有可能獲得對基因功能的詳細(xì)了解。物理圖譜與遺傳圖譜間的相互參考，形成一個用途更廣泛的綜合資源，獲得這張綜合圖譜后，研究人員就可以孟德爾遺傳特征為基礎(chǔ)，將相關(guān)基因定位在基因組區(qū)間上，并且通過查詢以ESTs為基礎(chǔ)的藶圖譜，即可獲得這一區(qū)間上所有基因的名單。該綜合資源用途的大小取決于EST數(shù)據(jù)庫中擁有的基因數(shù)目。目前人和小鼠EST的不斷擴(kuò)充使其應(yīng)用更加廣泛和便捷。3、 ESTs和基因組序列注釋EST數(shù)據(jù)庫并非完美無瑕，因?yàn)镋STs不能被剪切為單列序列位點(diǎn)識讀，故精確度只能達(dá)到97%，另外，ESTS受制于表達(dá)傾向(expressionbias)，因?yàn)楫a(chǎn)生ESTs的cDNA是組織中豐富的mRNA以一定比例反轉(zhuǎn)錄而成，因此，表達(dá)水平很低的EST數(shù)據(jù)庫中找到，而表達(dá)量高的基因在EST數(shù)據(jù)庫中卻過量存在。雖然可在起始mRNA或由它合成雙鏈cDNA時進(jìn)行富集，減小cDNA文庫，但cDNA文庫中仍存在大量高豐度的cDNA克隆。因此，一個理想的cDNA文庫必須去除或盡量消除多科信息克隆的影響，這就涉及到cDNA文庫的前加工技術(shù)；均等化(normalization)，減少與豐富編碼基因相關(guān)的cDNA數(shù)目；消減雜交(subtractivehybridization)，應(yīng)用序列標(biāo)記cDNA識別并去除文庫中多余的克降，這些技術(shù)的發(fā)展，使基因識別更依賴于EST技術(shù)，甚至可通過該技術(shù)獲得精確的基因組DNA序列，在華盛頓大學(xué)基因組測序中心和Sanger中心的聯(lián)合攻關(guān)下，C.elegans基因組10億個堿基對的測序工作基本完成。因此ESTs是一系列基因?qū)ふ夜ぞ咧胁豢扇鄙俸蟛糠郑@些工具都是基因組序列為基礎(chǔ)的。EST技術(shù)關(guān)于基因組DNA序列的其他應(yīng)用還包括對基因內(nèi)含子、外是子排列的精確預(yù)測，選擇性接合事件的識別，反?；蚪M排列結(jié)構(gòu)的識別等。4、ESTs與“電子”基因克隆利用計(jì)算機(jī)來協(xié)助克隆基因，稱為“電子"基因克隆(sillconcloning)，是與定位克隆、定位候選克隆策略并列的方法之一，即采用生物信息學(xué)的方法延伸EST序列，以獲得基因部分乃至全長的cDNA序列。EST數(shù)據(jù)庫的迅速擴(kuò)張，已經(jīng)并將繼續(xù)導(dǎo)致識別與克隆新基因策略發(fā)生革命性變化。4.1EST序列的獲取利用計(jì)算機(jī)來協(xié)助克隆的第一步是必須獲得感興趣的EST，在dbEST數(shù)據(jù)庫中找出EST的最有途徑是尋找同源序列，標(biāo)準(zhǔn)：長度＞100bp，同源性50%以上、85%以下?？赏ㄟ^數(shù)個萬維網(wǎng)界而使用BLAST檢索程度實(shí)現(xiàn)，其中最常用的如NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation)的eneBank、意大利Tigem的ESTmachine(包括EST提取者和EST組裝機(jī)器)、THC(TentativeHumanConsensusSequences)數(shù)據(jù)庫、ESTBlast檢索程序 通過英國人類基因組作圖項(xiàng)目資源中心(HumanGenomeMappingProjectResourceCenter，HGMP—RC)服務(wù)器上訪問。然后將檢出序列組裝為重疊群contig)，以此重疊群為被檢序列，重復(fù)進(jìn)行BLAST檢索與序列組裝，延伸重疊樣系列，重復(fù)以上過程，直到?jīng)]有更多的重疊EST檢出或者說重疊群序列不能繼續(xù)延伸，有時可獲得全長的基因編碼序列。獲得這些EST序列數(shù)據(jù)后，再與GeneBank核酸數(shù)據(jù)庫進(jìn)行相似性檢測，假如鳳有精確匹配基因，將EST序列數(shù)據(jù)據(jù)EST六種閱讀框翻譯成蛋白質(zhì)，接著與蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較分析?；蚍治龅慕Y(jié)果大致有三種：第一是已知基因，是研究對象為人類已鑒定和了解的基因；第二是以前未經(jīng)鑒定的新基因；第三是未知基因，這部分基因之間無同種或異種基因的匹配。新基因和未知基因?qū)⑦M(jìn)一步用于生物學(xué)研究。4.2基因的電子定位基因的電子定位采用NCBI的電子PCR程序進(jìn)行檢索，尋找EST序列上是否存在序列標(biāo)簽位點(diǎn)(sequencetaggedsites,STS)，STS作為基因組中的單拷貝序列，是新一代的遺傳標(biāo)記系統(tǒng)，其數(shù)目多，覆蓋密度較大，達(dá)到平均每1kb一個STS或更密集。將尋找到的STS與相應(yīng)的染色體相比較，即可將此序列定位在該染色體上。4.3IMAGE克隆的索取許多ESTs所對應(yīng)的cDNA克隆可通過基因組及其表達(dá)的整合分子分析(intergratedmolecularanalysisofgenomesandtheirexpression,IMAGE)協(xié)定免疫索取，這與電子基因克隆相輔相成，IMAGE協(xié)定由美國LLNL國家實(shí)驗(yàn)室主持，宗旨是共享排列好的cDNA文庫中的克隆重，大規(guī)模的EST測序項(xiàng)目如Merk&Cow公司投資的人類ESTs項(xiàng)目等都加入了IMAGE協(xié)定。當(dāng)研究者通過另外的途徑得到基因的部分序列，并通過同源性檢索后發(fā)現(xiàn)該片段與加入IMAGE協(xié)定的EST序列高度同源時，便可免費(fèi)索取其原始克隆，可通過美國的ATCC組織(AmericanTypeCultureCollection)索取，從而避免或減輕篩選全長基因的麻煩，以集中精力進(jìn)行基因的功能研究。5、結(jié)論人類基因組計(jì)劃已進(jìn)入后基因組時代，基因組學(xué)的研究從結(jié)構(gòu)基因組學(xué)過渡到功能基因組學(xué)，利用結(jié)構(gòu)基因組學(xué)的同存數(shù)據(jù)，充分發(fā)揮EST技術(shù)的優(yōu)勢，將為大規(guī)模進(jìn)行基因識別、克隆和表達(dá)分析提供空前的動力，為生物論處學(xué)功能的發(fā)揮提供廣闊的空間。傳統(tǒng)mRNA差異顯示技術(shù)(DDRT-PCR)和第二代差異顯示系統(tǒng)2006-12-1621:20真核生物中，從個體的生長、發(fā)育、衰老、死亡，到組織的分化、凋亡以及細(xì)胞對各種生物、理化因子的應(yīng)答，本質(zhì)上都涉及基因的選擇性表達(dá)。高等生物大約有30000個不同的基因，但在生物體內(nèi)任意細(xì)胞中只有10%的基因得以表達(dá)，而這些基因的表達(dá)是按事件和空間順序有序地進(jìn)行著，這種表達(dá)的方式即為基因的差異表達(dá)。其包括新出現(xiàn)的基因表達(dá)與表達(dá)量有差異的基因表達(dá)。生物體表現(xiàn)出的各種特性，主要是由于基因的差異表達(dá)引起的。由于基因差異表達(dá)的變化是調(diào)控細(xì)胞生命活動過程的核心機(jī)制，通過比較同一類細(xì)胞在不同生理?xiàng)l件下或在不同生長發(fā)育階段的基因表達(dá)差異，可為分析生命活動過程提供重要信息。研究基因差異表達(dá)的主要技術(shù)有差別雜交(篩選)(differentialhybridization)、扣除(消減)雜交(subtractivehybridizationofcDNA，SHD)、mRNA差異顯示(mRNAdifferentialdisplay，DD)、抑制消減雜交法(suppressionsubtractivehybridization，SSH)、代表性差異分析(representialdisplayanalysis，RDA)、交互扣除RNA差別顯示技術(shù)(reciprocalsubtractiondifferentialRNAdisplay)以及基因表達(dá)系列(serialanalysisofgeneexpression，SAGE)分析和電子消減(electronicsubtraction)和DNA微列陣分析(DNAmicroarray)等。本文來自這里我們重點(diǎn)介紹傳統(tǒng)mRNA差異顯示技術(shù)(DDRT-PCR)和第二代差異顯示系統(tǒng)：限制性酶切片段差異顯示(RFDD-PCR)本文來自傳統(tǒng)mRNA差異顯示技術(shù)(DDRT-PCR)是根據(jù)絕大多數(shù)真核細(xì)胞mRNA3'端具有的多聚腺苷酸尾(polyA)結(jié)構(gòu)，因此可用含oligo(dT)的寡聚核苷酸為引物將不同的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。該方法的創(chuàng)始人LiangP和PardeeA根據(jù)PolyA序列起點(diǎn)前2個堿基除AA外只有12種可能性的特征，設(shè)計(jì)合成了12種下游引物，稱3'-錨定引物，其通式為5'-T11MN；同時為擴(kuò)增出polyA上游500bp以內(nèi)所有可能性的mRNA序列，在5'端又設(shè)計(jì)了20種10bp長的隨機(jī)引物。這樣構(gòu)成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增能產(chǎn)生出20000條左右的DNA條帶，其中每一條都代表一種特定mRNA種，這一數(shù)字大體涵蓋了在一定發(fā)育階段某種細(xì)胞類型中所表達(dá)的全部mRNA。將差別表達(dá)條帶中的DNA回收，擴(kuò)增至所需含量，進(jìn)行Southernblot或Northernblot或直接測序，從而對差異條帶鑒定分析，以便最終獲得差異表達(dá)的目的基因。原理見下圖：本文來自雖然mRNA差別顯示技術(shù)（DDRT-PCR）具有很多優(yōu)點(diǎn):1）速度快，較易操作;2）由于PCR擴(kuò)增技術(shù)的應(yīng)用，使得低豐度mRNA的鑒定成為可能，且靈敏度高;3）可同時比較兩種以上不同來源的mRNA樣品間基因表達(dá)的差異。但在實(shí)際操作中仍存在一些問題，主要表現(xiàn)在：1） 出現(xiàn)差別條帶太多,假陽性率高達(dá)70%左右，重復(fù)性差，且對高拷貝數(shù)的mRNA具很強(qiáng)的傾向性；2） 在有差異的顯示片段中難以知道哪個基因是已經(jīng)研究過的，哪些是未知基因3） 得到的有差異的擴(kuò)增條帶短，一般在110?450bp之間；4） 以poly（A）為引物的PCR擴(kuò)增只適合真核生物。所以差別顯示技術(shù)自1992年建立后，一直在不斷進(jìn)行著改進(jìn)。第二代差異顯示系統(tǒng):限制性酶切片段差異顯示（RFDD-PCR）就是一個很有效的改進(jìn)。RFDD-PCR不是直接擴(kuò)增cDNA,而是首先限制性酶切cDNA，再在酶切后的cDNA片段兩邊加上特殊接頭進(jìn)行擴(kuò)增。正是RFDD-PCR系統(tǒng)使用了一系列特殊接頭和引物，特異性PCR引物的使用和下游的PCR反應(yīng)使RFDD-PCR分析具有高度的重復(fù)性，解決了第一代差別顯示系統(tǒng)的重復(fù)性問題；因?yàn)镽FDD-PCR技術(shù)不使用以poly（A）為引物的PCR擴(kuò)增，因而該系統(tǒng)對原核和真核系統(tǒng)皆適用；在第一代的差異顯示系統(tǒng)中，下游引物特異性結(jié)合poly（A）尾，因此與3'端未翻譯區(qū)域相對應(yīng)的差異表達(dá)序列大部分被鑒別出，而RFDD-PCR采用優(yōu)先切割翻譯序列的限制性內(nèi)切酶（如TaqI），因此可以優(yōu)先展示編碼區(qū)，更加適合于下游功能分析；使用RFDD-PCR或得差異顯示基因后，與disployFit網(wǎng)絡(luò)相連后，可以確定哪個基因是已經(jīng)研究過的，哪些是未知基因，對下一步研究有很好的知道意義?？傊?，RFDD-PCR中高度嚴(yán)謹(jǐn)?shù)腜CR可以產(chǎn)生結(jié)果一致的基因表達(dá)圖譜，重點(diǎn)放大和展示編碼區(qū)，對原核及真核RNA都有用，大大消除假陽性。原理見下圖生物學(xué)習(xí)之家基因打靶目的基因定位缺失點(diǎn)突變有好多?。∪绻蛄兄笇?dǎo)的話，設(shè)計(jì)針對未知基因的SiRNA，進(jìn)行轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)，觀察表型，也是好辦法。要鑒定未知功能的基因可以用1突變法：將該基因敲除，看缺失什么功能，可以認(rèn)為與這個功能相關(guān)，然后進(jìn)行測序，與基因庫NCBI進(jìn)行比對，很可能與某些已經(jīng)鑒定出功能的基因相似度高，進(jìn)一步確定其功能?；蚍蛛x克隆的方法1基因芯片技術(shù)分離目的基因生物芯片是高密度固定在固相支持介質(zhì)上的生物信息分子的微列陣。列陣中每個分子的序列及位置都是已知的，并按預(yù)先設(shè)定好的順序點(diǎn)陣。基因芯片是生物芯片的一種，其上固定的是核算類物質(zhì)，主要用于DNA、RNA分析。分為DNA芯片和微點(diǎn)陣兩種。分離目的基因是是指從基因組中發(fā)現(xiàn)或找出某個目的（標(biāo)）基因。目前是通過①比較不同物種之間，或同一物種不同個體之間；或同一個體在不同生長發(fā)育是期或不同環(huán)境條件下基因差異表達(dá)（基因表達(dá)平行分析）來實(shí)現(xiàn)的。采用基因芯片技術(shù)進(jìn)行基因差異表達(dá)研究可以通過雜交直接檢測到細(xì)胞中mRNA的種類及豐度，與傳統(tǒng)的差異顯示相比具有樣品用量小，自動化程度高，被檢測目標(biāo)DNA密度大及并行種類多等優(yōu)點(diǎn)。②利用同源探針從cDNA或EST微列陣中篩選分離目的基因。目前有DNA芯片、cDNA芯片兩種。其基本步驟包括：基因芯片的制備、靶樣品制備、雜交與檢測、目的基因得分離并獲得全長。2基因文庫技術(shù)分離目的基因基因文庫指某一生物類型全部基因的集合。這種集合是以重組體的形式出現(xiàn)。某生物DNA片段群體與載體分子重組，重組后轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，轉(zhuǎn)化細(xì)胞在選擇培養(yǎng)基上生長出的單個菌落（或噬菌斑，或成活細(xì)胞）即為一個DNA片段的克隆。全部DNA片段克隆的集合體即為該生物的基因文庫。其類型很多，如可分為基因組文庫與cDNA文庫、克隆文庫與表達(dá)文庫，按載體分有智力文庫、噬菌體文庫、黏粒載體文庫、人工染色體文庫等?；蛭膸鞓?gòu)建后，從文庫中篩選基因的方法主要有以下幾種：核算雜交法、免疫學(xué)檢測法、DNA同胞選擇法、PCR篩選法等。基因文庫的構(gòu)建是目前基因工程的核心工作，也是分離目的進(jìn)的常用方法之一。3功能蛋白組分離目的基因蛋白組是指細(xì)胞內(nèi)全部蛋白的存在及活動方式，即基因組表達(dá)產(chǎn)生的總蛋白質(zhì)的統(tǒng)稱。功能蛋白質(zhì)組指那些可能涉及到特定功能機(jī)理的蛋白質(zhì)群體。主要研究方法為蛋白質(zhì)雙向電泳。通過高效液相色譜、質(zhì)普對蛋白質(zhì)序列進(jìn)行分析，在借用分子生物學(xué)的手段則可以進(jìn)行目的基因的分離。如：應(yīng)用PCR進(jìn)行分離目的基因：通過對蛋白質(zhì)的序列分析，可以通過密碼子的簡并性設(shè)計(jì)簡并引物，可利用RT-PCR得到目的基因的全長；應(yīng)用核算雜交篩選法分離目的基因：即利用簡并寡核苷酸探針篩選cDNA或基因組文庫；免疫雪篩選法分離目的基因：是通過蛋白的特異抗體與目的蛋白的專一結(jié)合，從表達(dá)文庫中分離目的基因的蛋白基因。PCR技術(shù)在基因克隆中的應(yīng)用PCR技術(shù)已經(jīng)滲透到生物學(xué)的各個領(lǐng)域，在分子克隆和獲得cDNA全長方面起著重要的作用。利用PCR技術(shù)對特定條件下基因的表達(dá)進(jìn)行檢測即通過mRNA差別顯示（DDRT-PCR）可鑒定和分離出所需的目的基因；通過RT-PCR克隆到目的基因的cDNA區(qū)域進(jìn)行cDNA文庫的構(gòu)建，通過錨定PCR或反向PCR可快速克隆到cDNA末端未知序列、功能基因調(diào)控區(qū)等?，F(xiàn)在可用于基因分離和克隆的PCR方法主要有:RT-PCR，DDRT-PCR，用于cDNA末端快速克隆的RACE（第3小節(jié)），用于DNA序列克隆的Panhankle-PCR、Cassette-PCR以及減法cDNA文庫的PCR法構(gòu)建等°Panhankle-PCR、Cassette-PCR為基因組已知DNA相臨未知序列的克隆奠定了良好的基礎(chǔ)。mRNA差別顯示技術(shù)分離差別表達(dá)基因mRNA差異顯示技術(shù)是對組織特異性表達(dá)基因進(jìn)行分離的一種快速行之有效的方法之一。它是將mRNA反轉(zhuǎn)錄與PCR技術(shù)結(jié)合發(fā)展起來的一種RNA指紋圖譜技術(shù)。它利用5’錨定引物oligo（dT）12MN和3’端隨機(jī)引物對總mRNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以期得到差異表達(dá)的條帶。并對其差異顯示的條帶進(jìn)行回收、克隆。6插入突變分離克隆目的基因獲得突變體進(jìn)行未知基因的克隆是常用的方法之一。這里舉「DNA標(biāo)簽法和轉(zhuǎn)座子誘變分離克隆目的基因的例子J-DNA標(biāo)簽法是將「DNA在任何感興趣的基因處產(chǎn)生插入性突變，獲得分析該基因功能的對照突變體。它將「DNA左右邊界之間攜帶的外源報(bào)告基因片段作為一個選擇性的遺傳標(biāo)記，因?yàn)椴迦氲男蛄惺且阎?，因而對獲得的轉(zhuǎn)基因重組突變體就可以通過各種克隆和PCR策略加以研究。倘若將35S強(qiáng)啟動子在T-DNA整合到宿主基因組后，整合到內(nèi)原基因的上游，則可以產(chǎn)生異常增加或表達(dá)的時空特異性改變而破壞基因的表達(dá)的效果。有獲得性突變和功能喪失性突變等。轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法是將一株攜帶有功能性轉(zhuǎn)座系