微生物驗(yàn)證專題知識(shí)培訓(xùn)

微生物驗(yàn)證專題知識(shí)培訓(xùn)微生物驗(yàn)證專題知識(shí)培訓(xùn)第1頁2菌種、培養(yǎng)基、試驗(yàn)室環(huán)境管理無菌檢驗(yàn)及方法驗(yàn)證微生物程度檢驗(yàn)及方法驗(yàn)證年版藥典增修訂情況

微生物驗(yàn)證專題知識(shí)培訓(xùn)第2頁3菌（毒種）管理方法

1.菌種保管應(yīng)有專員負(fù)責(zé)，保留于冰箱中，房門專員加鎖，確保菌種安全（烈性菌種雙人雙鎖）。保管人員變動(dòng)時(shí)，必須嚴(yán)格交接手續(xù)。2.試驗(yàn)用菌種均從CMCC購置。菌種申購，由保管人依據(jù)菌種保留情況，提出申購，經(jīng)上級(jí)責(zé)任人簽字同意。申購單應(yīng)注明菌種名稱、菌號(hào)、數(shù)量及請(qǐng)購人。從指定單位購到菌種后，應(yīng)逐一查對(duì)菌種名稱、菌號(hào)、數(shù)量，無誤后方可接種，應(yīng)做好統(tǒng)計(jì)。3.菌種應(yīng)有嚴(yán)格登記，包含形態(tài)，分離日期，判定日期，簽發(fā)者，主要判定性能，并注明使用、轉(zhuǎn)移、銷毀情況及原因。4.菌種轉(zhuǎn)種等均應(yīng)在超凈工作臺(tái)進(jìn)行，以防污染。

5.各種菌種應(yīng)按要求時(shí)間接種，普通在接種三次后作一次全方面判定，注意菌種有沒有污染及變異，如發(fā)覺變異時(shí)，應(yīng)及時(shí)更換。微生物驗(yàn)證專題知識(shí)培訓(xùn)第3頁4全部存在菌種應(yīng)具備清單。

保留菌、毒種傳代或凍干均應(yīng)填寫專用統(tǒng)計(jì)，菌種管上應(yīng)有牢靠標(biāo)簽，標(biāo)明菌種編號(hào)、代次、批號(hào)、日期培養(yǎng)、在藥品微生物檢驗(yàn)時(shí)，可進(jìn)行簡(jiǎn)單染色鏡檢，以確保在試驗(yàn)中所用菌種正確。致病菌與普通菌種要分開管理。保留菌種傳代、移種后，銷毀原菌種之前，應(yīng)仔細(xì)檢驗(yàn)新舊菌種標(biāo)簽是否正確。微生物驗(yàn)證專題知識(shí)培訓(xùn)第4頁5菌種分類三類：僅具普通性危險(xiǎn)，能引發(fā)試驗(yàn)室感染機(jī)會(huì)較少，普通微生物學(xué)試驗(yàn)室采取普通試驗(yàn)技術(shù)能控制感染或有對(duì)其有效免疫預(yù)防方法菌種。四類：生物制品、菌苗、疫苗生產(chǎn)用各種減毒、弱毒菌種及不屬于上述一、二、三類各種低致病性微生物菌種。微生物驗(yàn)證專題知識(shí)培訓(xùn)第5頁6微生物與生物安全試驗(yàn)室適用等級(jí)二級(jí)生物安全試驗(yàn)室（BSL-2）：登革熱病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、流感病毒等。腦膜炎奈瑟氏菌、肺炎鏈球菌、軍團(tuán)菌、白喉棒桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌、致病性大腸埃希氏菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、空腸彎曲菌、霍亂弧菌、副溶血性弧菌、非經(jīng)典結(jié)核分枝桿菌等。鉤端螺旋體、致病性支原體、鸚鵡熱衣原體、放線菌、青霉菌等。

微生物驗(yàn)證專題知識(shí)培訓(xùn)第6頁7驗(yàn)證試驗(yàn)常見菌種枯草芽孢桿菌

[CMCC（B）63501]金黃色葡萄球菌

[CMCC（B）26003]生孢梭菌

[CMCC（B）64941]銅綠假單胞菌[CMCC（B）10104]大腸埃希菌[CMCC（B）44102]乙型副傷寒沙門菌[CMCC（B）50094]白色念珠菌[CMCC（F）98001]黑曲霉[CMCC（F）9003]微生物驗(yàn)證專題知識(shí)培訓(xùn)第7頁8細(xì)菌室消毒隔離辦法1.天天工作前用消毒液消毒工作臺(tái)，上班前、下班后開紫外燈（最少半小時(shí)）進(jìn)行空氣消毒。2.非必要品禁止帶入試驗(yàn)室，必要資料和書籍帶入后，應(yīng)遠(yuǎn)離操作臺(tái)。3.使用后載玻片、蓋片、平皿、試管等用消毒液浸泡，經(jīng)煮沸后清洗或丟棄。4.試驗(yàn)后血液標(biāo)本用消毒液浸泡后煮沸消毒，全部用于試驗(yàn)反應(yīng)板、吸頭等用消毒液浸泡（最少24小時(shí)以上）后清洗或丟棄。5.全部微生物培養(yǎng)物（細(xì)菌、支原體、真菌等培養(yǎng)物），不論標(biāo)本陽性或陰性均用消毒液浸泡后，經(jīng)煮沸消毒，才能清洗或丟棄。微生物驗(yàn)證專題知識(shí)培訓(xùn)第8頁9染菌物出試驗(yàn)時(shí)及試驗(yàn)后將染菌/帶菌物品放于盛有0.1％苯扎溴銨溶液滅菌專用桶中浸泡。滅菌專用桶加蓋，送集中洗滌室熱壓滅菌。將滅菌桶在121℃30min條件下進(jìn)行高壓濕熱滅菌，滅菌后再取出清洗。高壓蒸汽滅菌效果驗(yàn)證微生物驗(yàn)證專題知識(shí)培訓(xùn)第9頁10菌種保藏步驟①干燥菌種復(fù)蘇，劃平板②挑選特征經(jīng)典純菌菌落；（制菌懸液使用）③確定保藏適當(dāng)菌體形態(tài)；④選擇最適宜保藏方法，定時(shí)對(duì)保藏菌種進(jìn)行檢驗(yàn)，觀察是否發(fā)生改變，若有改變，須改變保藏方法。保藏期滿應(yīng)及時(shí)進(jìn)行移種。微生物驗(yàn)證專題知識(shí)培訓(xùn)第10頁11瓊脂斜面低溫保留法（廠家常見）方法：將經(jīng)典菌落接種在斜面（特殊菌種可用液體培養(yǎng)基）上，按要求培養(yǎng)，待充分生長(zhǎng)后，把培養(yǎng)好新鮮菌種用牛皮紙保好，可將菌種保藏管棉花塞換成橡膠塞。放在4℃左右冰箱中保藏。每隔2~3個(gè)月移種一次。若用半固體高層培養(yǎng)基穿刺培養(yǎng)，普通可保藏六個(gè)月~一年。適用范圍：細(xì)菌、酵母菌、霉菌保藏。優(yōu)點(diǎn):簡(jiǎn)便，對(duì)大多數(shù)微生物都適用。缺點(diǎn):保藏期太短；傳代次數(shù)多，易發(fā)生變異及污染。微生物驗(yàn)證專題知識(shí)培訓(xùn)第11頁12冷凍真空干燥保藏法

主要是將待保藏菌種混于有保護(hù)作用介質(zhì)內(nèi)制成菌液，分裝在安瓿中于冷凍條件下使其快速凍結(jié)，因凍結(jié)可使晶形細(xì)致，不致?lián)p傷活菌細(xì)胞。然后用真空抽氣減壓，是安瓿內(nèi)冰晶液體升華，水氣快速被真空抽走，冰晶型菌液很快變成疏松干燥固體物，最終在真空狀態(tài)下熔封管口，使干燥物在局部真空條件下封存，并置冷暗處，在很長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)菌種仍可維持活力不變。微生物驗(yàn)證專題知識(shí)培訓(xùn)第12頁13試驗(yàn)用菌種培養(yǎng)傳代方法

（一）菌種復(fù)蘇（二）菌種傳代與保留（三）對(duì)照用菌液制備檢定用標(biāo)準(zhǔn)菌種，由中國藥品生物檢定所提供，為冷凍干燥菌種。菌種復(fù)蘇在專用無菌室或超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行。傳代與保留:方法1：菌斜面,方法2：凍存管微生物驗(yàn)證專題知識(shí)培訓(xùn)第13頁14傳代：取菌液0.1ml接種至10ml液體培養(yǎng)基，按要求培養(yǎng)、稀釋傳代限制（5代）對(duì)照用菌種在使用過程中，亦應(yīng)檢驗(yàn)其生物學(xué)特征。如菌落形態(tài)、革蘭染色、鏡檢菌體形態(tài)、主要生化特征。如發(fā)覺染菌或變異，衰退等現(xiàn)象時(shí)，應(yīng)及時(shí)處理。菌種分離微生物驗(yàn)證專題知識(shí)培訓(xùn)第14頁15培養(yǎng)基管理

普通采取購自中國藥品生物制品檢定所合格商品脫水培養(yǎng)基。同時(shí)按照使用說明書進(jìn)行配制，需注意培養(yǎng)基pH值應(yīng)符合要求，不然必須校正后，按說明書要求滅菌使用。商品脫水培養(yǎng)基應(yīng)在效期內(nèi)使用，使用前應(yīng)注意查對(duì)名稱，檢驗(yàn)外觀，遇有接塊、吸潮現(xiàn)象，應(yīng)廢棄。新鮮培養(yǎng)基配制，應(yīng)按質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求配方進(jìn)行。對(duì)培養(yǎng)基原材料要進(jìn)行挑選，試劑應(yīng)為化學(xué)純?cè)噭┮?guī)格。制成培養(yǎng)基要求無沉淀，必要時(shí)以適當(dāng)方法過濾，調(diào)整pH值，分裝滅菌備用。

微生物驗(yàn)證專題知識(shí)培訓(xùn)第15頁16培養(yǎng)基性能質(zhì)量控制

無菌檢驗(yàn)用需氣厭氣培養(yǎng)基指示劑氧化層不得超出培養(yǎng)基深度1/5，不然需經(jīng)水浴煮沸10分鐘，但只限加熱一次。無菌檢驗(yàn)結(jié)束時(shí)，指示劑氧化層應(yīng)不超出培養(yǎng)基深度1/2。大腸埃希菌檢驗(yàn)用MUG培養(yǎng)基配制前應(yīng)挑選無熒光試管進(jìn)行配制，觀察結(jié)果時(shí)應(yīng)用同批培養(yǎng)基配制空白管和陽性菌管同時(shí)觀察。對(duì)無菌培養(yǎng)基無菌性、靈敏度檢驗(yàn)微生物驗(yàn)證專題知識(shí)培訓(xùn)第16頁17培養(yǎng)基靈敏度檢驗(yàn):

（已知菌生長(zhǎng)試驗(yàn)）①細(xì)菌組：取每管裝量為12ml硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基9支，分別接種小于100cfu金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌試驗(yàn)菌各2支;

空白對(duì)照：另一支不接種，溫度培養(yǎng)24~72小時(shí)逐日觀察結(jié)果②霉菌組：取每管裝量為9ml改良馬丁液體培養(yǎng)基5支，分別接種小于100cfu白色念珠菌、黑曲霉各2支；空白對(duì)照：另一支不接種，培養(yǎng)5天。逐日觀察結(jié)果。結(jié)果判定空白管培養(yǎng)基無菌生長(zhǎng)，加菌培養(yǎng)基管均生長(zhǎng)良好，判靈敏度檢驗(yàn)合格。微生物驗(yàn)證專題知識(shí)培訓(xùn)第17頁18培養(yǎng)基管理配制好培養(yǎng)基，按無菌要求進(jìn)行滅菌。培養(yǎng)基配制須有統(tǒng)計(jì)，統(tǒng)計(jì)內(nèi)容含有：a）配制日期和配制人員標(biāo)識(shí)；b）培養(yǎng)基/溶液類型、體積；c）成份、每個(gè)成份物質(zhì)含量、制造商、批號(hào)；d）pH（最初和最終）值；e）無菌辦法，包含實(shí)施方式、時(shí)間和溫度。按日期編制滅菌后培養(yǎng)基批號(hào)。將制備完成培養(yǎng)基按品種放置在陰涼指定位置，備用。注意保留期。微生物驗(yàn)證專題知識(shí)培訓(xùn)第18頁19a.濕熱高壓蒸汽滅菌法：依115℃121℃或132℃，應(yīng)用于培養(yǎng)基滅菌、試驗(yàn)器械、工作服、橡膠物品滅菌和試驗(yàn)室廢棄物，也可用于玻璃器皿滅菌。普通121℃30min

因?yàn)闈駸嶂芯w吸水，蛋白質(zhì)輕易凝固，因蛋白質(zhì)含水量增加，所需凝固溫度降低；濕熱蒸氣有潛熱存在。所以效果比同溫度下干熱好。b.干熱法：利用物理學(xué)，171℃-1小時(shí)、160℃-2小時(shí)、121-3小時(shí):玻璃器皿微生物驗(yàn)證專題知識(shí)培訓(xùn)第19頁20潔凈工作室1無菌檢驗(yàn)試驗(yàn)室分無菌操作間和緩沖間

2進(jìn)入無菌操作間應(yīng)有些人凈和物凈設(shè)施3無菌操作間內(nèi)禁放雜物，每次試驗(yàn)后清潔消毒,并定時(shí)清潔、滅菌,每七天徹底消毒一次,臭氧,消毒液0.1%新潔爾滅/75%酒精/其它交替使用4無菌操作間定時(shí)進(jìn)行環(huán)境監(jiān)測(cè)，可訂為2周~3月，平時(shí)試驗(yàn)中實(shí)時(shí)做5無菌間使用拖鞋要定時(shí)消毒處理6無菌間內(nèi)紫外線燈要定時(shí)進(jìn)行更換7試驗(yàn)前開啟凈化系統(tǒng)1小時(shí),紫外燈1小時(shí)以上微生物驗(yàn)證專題知識(shí)培訓(xùn)第20頁21無菌檢驗(yàn)：注射劑、植入劑、個(gè)別外用藥

鼻用制劑：用于手術(shù)或創(chuàng)傷鼻用制劑。凝膠劑：用于嚴(yán)重創(chuàng)傷凝膠劑。乳膏劑：用于燒傷或嚴(yán)重創(chuàng)傷乳膏劑。新增無菌檢驗(yàn)中藥制劑散劑：用于燒傷或嚴(yán)重創(chuàng)傷外用散劑。鼻用制劑：用于嚴(yán)重創(chuàng)傷鼻用制劑。眼用制劑：用于傷口眼用制劑。軟膏劑：用于燒傷或嚴(yán)重創(chuàng)傷乳膏劑。氣霧劑、噴霧劑：用于燒傷或嚴(yán)重創(chuàng)傷氣霧劑、噴霧劑。微生物驗(yàn)證專題知識(shí)培訓(xùn)第21頁22無菌檢驗(yàn)基礎(chǔ)定義：檢驗(yàn)要求無菌藥品.醫(yī)療器具.原料.輔料.以及要求無菌其它物品是否染有活菌一個(gè)方法。符合無菌檢驗(yàn)法要求僅表明了供試品在該檢驗(yàn)條件下未發(fā)覺細(xì)菌和真菌污染。說明無菌檢驗(yàn)法建立在批產(chǎn)品受微生物污染是均勻假設(shè)上。即使該批產(chǎn)品污染非常均勻，檢出低污染概率也是極低。所以，無菌檢驗(yàn)存在風(fēng)險(xiǎn)和不足。應(yīng)盡可能抽取批產(chǎn)品生產(chǎn)開始和結(jié)束或生產(chǎn)過程出現(xiàn)異常情況下產(chǎn)品進(jìn)行檢驗(yàn)。微生物驗(yàn)證專題知識(shí)培訓(xùn)第22頁23藥品生產(chǎn)中污染起源人員在100級(jí)潔凈區(qū)或萬級(jí)背景下局部100級(jí)潔凈區(qū)。人是無菌藥品生產(chǎn)中主要污染源，在管理比較到位，生產(chǎn)設(shè)備自動(dòng)化程度很好，操作人員素質(zhì)較高企業(yè)，人員操作所致污染率超出70%。水源性微生物絕大多數(shù)為革蘭氏陰性菌，不會(huì)形成芽孢，不耐熱。其代謝產(chǎn)物及細(xì)胞尸體及碎片均屬細(xì)胞內(nèi)毒素污染源空氣中微生物基礎(chǔ)為革蘭氏陽性菌，有可能會(huì)形成芽孢使其耐熱性增大微生物驗(yàn)證專題知識(shí)培訓(xùn)第23頁24無菌檢驗(yàn)不足無菌定義理論上：無菌＝?jīng)]有任何活微生物實(shí)際上：咱們無法證實(shí)產(chǎn)品中沒有活微生物存在無法對(duì)整批產(chǎn)品進(jìn)行100%檢驗(yàn)無菌檢驗(yàn)結(jié)果只是一個(gè)基于“可能性”判斷無菌檢驗(yàn)用培養(yǎng)基有其不足只進(jìn)行細(xì)菌和真菌檢驗(yàn)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果判定是基于“是否在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)”培養(yǎng)條件（如溫度和時(shí)間）是有限咱們工作環(huán)境及操作是在相對(duì)無菌狀態(tài)微生物驗(yàn)證專題知識(shí)培訓(xùn)第24頁25美國非腸道藥品學(xué)會(huì)注射劑無菌測(cè)試結(jié)果試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)：不合格可能性(%)試驗(yàn)批量：60,000支試驗(yàn)方法：按美國藥典無菌測(cè)試方法真實(shí)不合格率測(cè)試20支樣品不合格可能性測(cè)試40支樣品不合格可能性合格結(jié)果可能性1％18.2%33.1%?5％64.2%87.2%?15％96.1%99.8%?30％99.9%100.0%?微生物驗(yàn)證專題知識(shí)培訓(xùn)第25頁26上述無菌測(cè)試結(jié)果啟示含有少許微生物污染產(chǎn)品批次也有可能“經(jīng)過”無菌檢驗(yàn)一批產(chǎn)品染菌率越低，依據(jù)無菌檢驗(yàn)結(jié)果來判定整批產(chǎn)品無菌，其風(fēng)險(xiǎn)就越大微生物驗(yàn)證專題知識(shí)培訓(xùn)第26頁27怎樣用無菌檢驗(yàn)來證實(shí)整批產(chǎn)品無菌要求有一個(gè)取樣計(jì)劃來涵蓋整個(gè)批號(hào)有足夠取樣量和檢驗(yàn)量選擇適用培養(yǎng)基采取經(jīng)驗(yàn)證無菌檢驗(yàn)方法良好環(huán)境監(jiān)控質(zhì)量問題為何經(jīng)常未檢出來？微生物驗(yàn)證專題知識(shí)培訓(xùn)第27頁28批產(chǎn)品出廠最少檢驗(yàn)數(shù)量供試品批產(chǎn)量N（個(gè)）每種培養(yǎng)基最少檢驗(yàn)數(shù)量注射劑

≤10010%或4個(gè)（取較多者）

100＜N≤50010個(gè)

＞5002%或20個(gè)（取較少者）大致積注射劑（＞100ml）

2%或10個(gè)（取較少者）眼用及其它非注射產(chǎn)品

≤2005%或2個(gè)（取較多者）

＞20010個(gè)桶裝固體原料

≤4每個(gè)容器

4＜N≤5020%或4個(gè)容器（取較大者）

＞502%或10個(gè)容器（取較大者）微生物驗(yàn)證專題知識(shí)培訓(xùn)第28頁29上市抽驗(yàn)樣品（液體制劑）最少檢驗(yàn)量供試品裝量V(ml)每支樣品接入每管培養(yǎng)基最少許（ml）最少檢驗(yàn)數(shù)量（瓶或支）≤1全量2011＜V＜5半量105≤V＜2021020≤V＜5051050≤V＜100101050≤V＜100(靜脈給藥)半量10100≤V≤500半量6V＞5005006微生物驗(yàn)證專題知識(shí)培訓(xùn)第29頁30上市抽驗(yàn)樣品（固體制劑）最少檢驗(yàn)量供試品裝量M（mg/支或瓶）每支樣品接入每管培養(yǎng)基最小量（mg）最少檢驗(yàn)數(shù)量（瓶或支）M<50全量20（1）50≤M<300半量10300≤M<5g15010M≥5g50010外科用敷料棉花及紗布取100mg或1cm×3cm10縫合線、一次性醫(yī)用材料整個(gè)材料310帶導(dǎo)管一次性醫(yī)療器具（如輸液袋）

10其它醫(yī)療器具整個(gè)器具3（切碎或拆散開）20微生物驗(yàn)證專題知識(shí)培訓(xùn)第30頁31供試品抽驗(yàn)量和檢驗(yàn)量

檢驗(yàn)數(shù)量(對(duì)于檢驗(yàn))指一次試驗(yàn)所用供試品最小包裝容器數(shù)量。

檢驗(yàn)量(對(duì)于檢驗(yàn)與驗(yàn)證)

指一次試驗(yàn)所用供試品總量（g或ml）。每份培養(yǎng)基接種供試品量。比如:1g規(guī)格注射用粉針劑

10支150mg*10表中最少檢驗(yàn)量不包含陽性對(duì)照試驗(yàn)用量。微生物驗(yàn)證專題知識(shí)培訓(xùn)第31頁32供試品處理

目標(biāo)使供試品分散均勻水溶性供試品固體制劑β-內(nèi)酰胺類抗生素供試品非水溶性供試品膏劑和黏性油劑供試品無菌氣（噴）霧劑供試品裝有藥品注射器接種含培養(yǎng)基容器按要求溫度培養(yǎng)14天，培養(yǎng)期間應(yīng)逐日觀察并統(tǒng)計(jì)是否有菌生長(zhǎng)。微生物驗(yàn)證專題知識(shí)培訓(xùn)第32頁33無菌檢測(cè)14天賠償次佳生長(zhǎng)條件考慮到潛在低生長(zhǎng)者修復(fù)受損細(xì)胞全球一體化微生物驗(yàn)證專題知識(shí)培訓(xùn)第33頁34陽性對(duì)照菌液制備

加菌量為10~100cfu

陽性對(duì)照管培養(yǎng)48~72小時(shí)應(yīng)生長(zhǎng)良好。微生物驗(yàn)證專題知識(shí)培訓(xùn)第34頁35結(jié)果判斷若供試品管均澄清，或雖顯渾濁但經(jīng)確證無菌生長(zhǎng)，判供試品符合要求；如在加入供試品后、或在培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁，培養(yǎng)14天后，不能從外觀上判斷有沒有微生物生長(zhǎng)，可取該培養(yǎng)液適量轉(zhuǎn)種至同種新鮮培養(yǎng)基中或劃線接種于斜面培養(yǎng)基上，細(xì)菌培養(yǎng)2日、真菌培養(yǎng)3日，觀察是否再出現(xiàn)渾濁或斜面有沒有菌生長(zhǎng)；或取培養(yǎng)液涂片，染色，鏡檢，判斷是否有菌。若供試品管中任何1管顯渾濁并確證有菌生長(zhǎng)，判供試品不符合要求，除非能充分證實(shí)試驗(yàn)結(jié)果無效即生長(zhǎng)微生物非供試品所含。微生物驗(yàn)證專題知識(shí)培訓(xùn)第35頁36當(dāng)符合以下最少一個(gè)條件時(shí)，方可判試驗(yàn)結(jié)果無效：⑴無菌檢驗(yàn)試驗(yàn)所用設(shè)備及環(huán)境微生物監(jiān)控結(jié)果不符合無菌檢驗(yàn)法要求。⑵回顧無菌試驗(yàn)過程，發(fā)覺有可能引發(fā)微生物污染原因。⑶陰性對(duì)照管有菌生長(zhǎng)。⑷供試品管中生長(zhǎng)微生物經(jīng)判定后，確證是因無菌試驗(yàn)中所使用物品和（或）無菌操作技術(shù)不妥引發(fā)。重試微生物驗(yàn)證專題知識(shí)培訓(xùn)第36頁37方法學(xué)研究：

驗(yàn)證試驗(yàn)必要性方法驗(yàn)證：是為檢測(cè)方法可靠性提供主要科學(xué)依據(jù)。微生物檢測(cè)幾個(gè)方面：1、無菌環(huán)境驗(yàn)證（塵埃離子、浮游菌、沉降菌檢測(cè)）；2、全部滅菌器具驗(yàn)證；3、培養(yǎng)基靈敏度檢測(cè)；4、陽性代表菌株選擇等；5、方法選擇等。版藥典與USP、EP、BP國家接軌，將藥品微生物檢驗(yàn)方法驗(yàn)證試驗(yàn)進(jìn)行了，系統(tǒng)化要求和要求。并強(qiáng)調(diào)了驗(yàn)證供試品本身對(duì)微生物生長(zhǎng)影響。微生物驗(yàn)證專題知識(shí)培訓(xùn)第37頁38環(huán)境確保培養(yǎng)基確保無菌性檢驗(yàn)靈敏度檢驗(yàn)有效方法方法驗(yàn)證SOP操作有效結(jié)果可靠結(jié)論結(jié)果判斷微生物驗(yàn)證專題知識(shí)培訓(xùn)第38頁39

驗(yàn)證目標(biāo)試驗(yàn)操作標(biāo)準(zhǔn)化驗(yàn)證試驗(yàn)系統(tǒng)化制訂標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)謹(jǐn)化最終目標(biāo)：一次檢驗(yàn)即可得到準(zhǔn)確結(jié)果。微生物驗(yàn)證專題知識(shí)培訓(xùn)第39頁40方法驗(yàn)證普通程序與步驟

需前處理不需前處理有抑菌作用無抑菌作用樣品檢驗(yàn)去除抑菌作用①驗(yàn)證前處理方法對(duì)污染菌生長(zhǎng)、檢出影響。③驗(yàn)證抑菌活性去除有效性，以及去除方法對(duì)污染菌生長(zhǎng)、檢出影響。②能夠經(jīng)過驗(yàn)證試驗(yàn)判斷

微生物驗(yàn)證專題知識(shí)培訓(xùn)第40頁41驗(yàn)證什么？前處理去除抑菌作用用到一切微生物驗(yàn)證專題知識(shí)培訓(xùn)第41頁42方法驗(yàn)證樣品前處理直接接種法薄膜過濾法沖洗量驗(yàn)證中和劑驗(yàn)證微生物驗(yàn)證專題知識(shí)培訓(xùn)第42頁43無菌檢驗(yàn)驗(yàn)證試驗(yàn)：

供試品↓┌───────────────┐

直接接種法薄膜過濾法

100ml/筒↓┌───────────────────────────────────┐①試驗(yàn)組（供試品+菌）②培養(yǎng)基對(duì)照組③陽性菌對(duì)照組④稀釋劑對(duì)照組金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、（加菌同試驗(yàn)組）大腸、枯草桿菌、生孢梭菌、白色念株菌、黑曲霉↓要求T培養(yǎng)3~5天↓觀察結(jié)果↓書寫驗(yàn)證匯報(bào)微生物驗(yàn)證專題知識(shí)培訓(xùn)第43頁44薄膜過濾法將要求量供試品按薄膜過濾法過濾，沖洗，在最終一次沖洗液中加入小于100cfu試驗(yàn)菌。取出濾膜接種至對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基中，或?qū)⑴囵B(yǎng)基加至濾筒內(nèi)。取一支裝有同體積培養(yǎng)基容器，加入等量試驗(yàn)菌，作為陽性對(duì)照，按要求溫度培養(yǎng)3～5天。各試驗(yàn)菌同法操作。

可少許屢次：50-100ml/次；共次，充分振搖，在最終一次無抗菌活性時(shí)加陽性菌<100cfu/ml。微生物驗(yàn)證專題知識(shí)培訓(xùn)第44頁45直接接種法取符合直接接種法培養(yǎng)基用量要求硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基8支，分別接入金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌菌懸液1ml(含菌小于100cfu)各兩管；取符合直接接種法培養(yǎng)基用量要求改良馬丁培養(yǎng)基4管，分別接入白色念珠菌、黑曲霉菌菌懸液1ml(含菌小于100cfu)各兩管。其中1管接入要求量供試品，另1管作為陽性對(duì)照，按要求溫度培養(yǎng)3～5天。微生物驗(yàn)證專題知識(shí)培訓(xùn)第45頁46菌落計(jì)數(shù):同時(shí)平皿法液體培養(yǎng)基計(jì)數(shù)微生物驗(yàn)證專題知識(shí)培訓(xùn)第46頁47與陽性對(duì)照比較，如含供試品各容器中試驗(yàn)菌均生長(zhǎng)良好，則供試品該檢驗(yàn)量在該檢驗(yàn)條件下無抑菌作用，可按此法進(jìn)行供試品無菌檢驗(yàn)。如含供試品任一容器中微生物生長(zhǎng)微弱、遲緩或不生長(zhǎng)，則供試品該檢驗(yàn)量在該檢驗(yàn)條件下有抑菌作用，可采取增加沖洗量；增加培養(yǎng)基用量；使用中和劑如?-內(nèi)酰胺酶、對(duì)氨基苯甲酸、聚山梨脂80等；更換濾膜品種等方法，消除供試品抑菌作用，并重新進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。驗(yàn)證試驗(yàn)可與供試品無菌檢驗(yàn)同時(shí)進(jìn)行。微生物驗(yàn)證專題知識(shí)培訓(xùn)第47頁48陽性菌株選擇枯草芽孢桿菌

Bacillussubtilis[CMCC（B）63501]金黃色葡萄球菌

Staphylococcusaureus[CMCC（B）26003]生孢梭菌

Clostridiumsporogenes[CMCC（B）64941]銅綠假單胞菌

Pseudomonasaeruginosa[CMCC（B）10104]大腸埃希菌

Escherichiacoli[CMCC（B）44102]白色念珠菌

Candidaalbicans[CMCC（F）98001]黑曲霉菌

Aspergillusniger[CMCC（F）98003]菌液制備,計(jì)數(shù)普通當(dāng)日使用微生物驗(yàn)證專題知識(shí)培訓(xùn)第48頁49陽性菌株選擇應(yīng)依據(jù)供試品特征選擇對(duì)應(yīng)陽性對(duì)照菌：無抑菌作用及抗革蘭陽性菌為主供試品，以金黃色葡萄球菌為對(duì)照菌；抗革蘭陰性菌為主供試品以大腸埃希菌為對(duì)照菌；抗厭氧菌供試品，以生孢梭菌為對(duì)照菌；抗真菌供試品，以白色念珠菌為對(duì)照菌。不然會(huì)造成誤判!微生物驗(yàn)證專題知識(shí)培訓(xùn)第49頁5048小時(shí)細(xì)菌試驗(yàn)結(jié)果

金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌銅綠假單胞菌大腸埃希菌生孢梭菌沖洗量300ml/桶+酶300萬單位--+-+沖洗量400ml/桶+酶300萬單位+++-+沖洗量500ml/桶+酶300萬單位+++++陽性對(duì)照+++++陰性對(duì)照-----72小時(shí)觀察真菌結(jié)果

黑曲霉菌白色念珠菌沖洗量100ml/桶++陽性對(duì)照++陰性對(duì)照--無抑菌作用、弱抑菌作用能夠從直接過濾不沖洗開始做，但一定要做！微生物驗(yàn)證專題知識(shí)培訓(xùn)第50頁51葡萄糖注射液注射用頭孢地嗪注射用克林霉素磷酸酯替硝唑注射液紅霉素軟膏實(shí)例5個(gè)微生物驗(yàn)證專題知識(shí)培訓(xùn)第51頁52無菌檢驗(yàn)原始統(tǒng)計(jì)檢品編號(hào)：第頁共頁微生物驗(yàn)證專題知識(shí)培訓(xùn)第52頁53微生物程度檢驗(yàn)：口服、外用控制項(xiàng)目

雜菌數(shù)：細(xì)菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)。

控制菌（致病菌）：大腸埃希菌、大腸菌群、沙門菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單孢菌、梭菌。制訂標(biāo)準(zhǔn)：非無菌藥品微生物程度標(biāo)準(zhǔn)是基于藥品給藥路徑及對(duì)患者潛在危害而制訂。微生物驗(yàn)證專題知識(shí)培訓(xùn)第53頁54不含藥材原粉制劑含藥材原粉制劑：丸劑含動(dòng)物藥制劑：外用制劑：滴眼劑普通局部用藥直腸給藥制劑尿道、陰道給藥制劑滴鼻劑不一樣制劑程度微生物驗(yàn)證專題知識(shí)培訓(xùn)第54頁55供試品制備液體供試品:10ml固體、半固體或黏稠性供試品10g,勻漿或其它適宜方法非水溶性供試品具抑菌活性供試品:①培養(yǎng)基稀釋法②離心集菌法:500,3000rpm③薄膜過濾法④中和法;如磺胺類100ml中1~5ml1%對(duì)氨基苯甲酸微生物驗(yàn)證專題知識(shí)培訓(xùn)第55頁56供試液制備供試液從制備至加入檢驗(yàn)用培養(yǎng)基，不得超出1小時(shí)。供試液制備若需用水浴加溫時(shí)，溫度不應(yīng)超出45℃微生物驗(yàn)證專題知識(shí)培訓(xùn)第56頁57采取稀釋法、離心沉淀集菌法、薄膜過濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品抑菌活性微生物驗(yàn)證專題知識(shí)培訓(xùn)第57頁58結(jié)果判斷供試品細(xì)菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)其中任何一項(xiàng)不符合該品種要求，應(yīng)從同一批樣品中隨機(jī)抽樣，獨(dú)立復(fù)試兩次，以3次結(jié)果平均值匯報(bào)菌數(shù)。供試品檢出控制菌或其它致病菌時(shí)，按一次檢出結(jié)果為準(zhǔn)，不再復(fù)試。眼用制劑檢出霉菌和酵母菌數(shù)時(shí)，須以兩次復(fù)試結(jié)果均不得長(zhǎng)菌，方可判供試品霉菌和酵母菌數(shù)符合該品種要求。

若供試品細(xì)菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)及控制菌三項(xiàng)檢驗(yàn)結(jié)果均符合該品種項(xiàng)下要求，判供試品符合要求；若其中任何一項(xiàng)不符合該品種要求，判供試品不符合要求。微生物驗(yàn)證專題知識(shí)培訓(xùn)第58頁59微生物程度檢驗(yàn)法驗(yàn)證細(xì)菌、霉菌及酵母菌數(shù)計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證

定量——回收率測(cè)定試驗(yàn)控制菌檢驗(yàn)方法驗(yàn)證定性——能否生長(zhǎng)、專屬性試驗(yàn)微生物驗(yàn)證專題知識(shí)培訓(xùn)第59頁60回收率計(jì)算

試驗(yàn)組菌回收率=[（試驗(yàn)組平均菌落數(shù)–供試品組平均菌落數(shù)）/菌液組平均菌落數(shù)]×100%稀釋劑對(duì)照組菌回收率=[（稀釋劑對(duì)照組平均菌落數(shù)/菌液組平均菌落數(shù)）]×100%

在3次獨(dú)立平行試驗(yàn)中，稀釋劑對(duì)照組、試驗(yàn)組回收率均不低于70%，若任一次試驗(yàn)中回收率低于70%，應(yīng)重新選擇方法再驗(yàn)證。微生物驗(yàn)證專題知識(shí)培訓(xùn)第60頁61方法驗(yàn)證：控制菌控制菌：大腸埃希菌，銅綠假單胞菌，沙門菌，大腸菌群，生孢梭菌計(jì)數(shù)方法：平皿法、薄膜過濾法。特殊：生孢梭菌（加菌量：10~100cfu,只要求生長(zhǎng)，不要求回收率）微生物驗(yàn)證專題知識(shí)培訓(xùn)第61頁62版藥典無菌檢驗(yàn)法主要增修訂情況微生物驗(yàn)證專題知識(shí)培訓(xùn)第62頁63增、修訂包括范圍

序言個(gè)別培養(yǎng)基個(gè)別靈敏度檢驗(yàn)稀釋液、沖洗液方法驗(yàn)證薄膜過濾法培養(yǎng)及觀察結(jié)果判斷表1、表2和表3微生物驗(yàn)證專題知識(shí)培訓(xùn)第63頁64

序言個(gè)別1、新增要求：“預(yù)防污染辦法不得影響供試品中微生物檢出?！?、新增要求：“日常檢驗(yàn)還需要對(duì)環(huán)境進(jìn)行監(jiān)控?！?、新增要求：“無菌檢驗(yàn)人員必須具備微生物專業(yè)知識(shí)，并經(jīng)過無菌技術(shù)培訓(xùn)。微生物驗(yàn)證專題知識(shí)培訓(xùn)第64頁65干擾物可選取中和劑或滅活方法戊二醛酚類、乙醇、吸附物醛類季銨類化合物（QACs）、對(duì)羥基苯甲酸酯汞類制劑雙胍類化合物碘酒、洗必泰類鹵化物乙二胺四乙酸（EDTA）磺胺類?-內(nèi)酰胺類抗生素亞硫酸氫納稀釋法稀釋法、甘氨酸、硫代硫酸鹽卵磷脂、聚山梨酯亞硫酸氫納、巰基乙酸鹽、硫代硫酸鹽卵磷脂聚山梨酯硫代硫酸鹽鎂或鈣離子對(duì)氨基苯甲酸?-內(nèi)酰胺酶表1常見干擾物中和劑或滅活方法微生物驗(yàn)證專題知識(shí)培訓(xùn)第65頁66

培養(yǎng)基靈敏度檢驗(yàn)個(gè)別新增加稀釋后工作用菌液保留條件和保留期限：“菌液制備后若在室溫下放置，應(yīng)在2小時(shí)內(nèi)使用，若保留在2～8℃，可在24小時(shí)內(nèi)使用。黑曲霉孢子懸液可保留在2℃～8℃，在驗(yàn)證過貯存期內(nèi)使用?！蔽⑸?/p>