病毒的形態(tài)學診斷

PAGEPAGE13實驗十病毒的形態(tài)學診斷、培養(yǎng)方法和血清學試驗 目的（一）觀察病毒包涵體，并掌握其診斷意義。（二）掌握病毒的形態(tài)并了解病毒包膜的獲得。（三）了解病毒培養(yǎng)的三種方法。（四）掌握病毒學中主要血清學反應(yīng)的原理（五）熟悉病毒血凝抑制試驗的測定過程內(nèi)容（一）病毒的形態(tài)學診斷1.病毒的電鏡照片（示教）狂犬病毒包涵體（示教）麻疹病毒包涵體（示教）（二）病毒的培養(yǎng)法（錄像）1.病毒的動物接種法病毒雞胚培養(yǎng)法病毒的組織培養(yǎng)法（三）血凝抑制試驗（操作）一、 病毒的形態(tài)學診斷 病的診斷一定。方法】（一）病毒的電鏡照片（示教）。（二）狂犬病病毒內(nèi)基（Negri）包涵體（示教）HE（-）意包涵體細胞內(nèi)的形態(tài)、及染色。（三）麻疹病毒包涵體（示教）HE注意包涵體細胞內(nèi)的、形態(tài)、染色以及細胞。二、 病毒動物接種法 ①離鑒如乙②連續(xù)傳代減弱株致力如③備抗④致病機理的研究。常用的實驗動物有小白鼠、地鼠、豚鼠、家兔、綿羊、雞、猴等。在病毒學研究中，動物接種時為避免動物本身可能帶有病毒，多采用實驗室自己繁殖的動物。首先根據(jù)研究目的選擇動物種類，對病毒致病機制的研究，則選擇愈接近人類的高等動物（例如靈長類）研究結(jié)果愈有價值；其次要注意動物的年齡、性別和接種的途徑等各種因素，一般年幼的動物比成年動物對病毒的敏感性高。至于接種的途徑應(yīng)根據(jù)病毒的嗜性決定，例如腦炎病毒以腦內(nèi)注射最敏感。（一）小白鼠尾靜脈接種（錄像）【材料】動物：小白鼠0.25ml4【】尾（要時用二甲）。尾和根為靜脈，可選一根的靜脈接種用。左尾的，45°，持注射，于處進靜脈，推液 毫升。推遇阻力且隆起發(fā)表示不拔重新進；推不阻力且看到由入體而退。逐日觀察發(fā)情況。（）鼻（）【材料】流肺適株試毛細麻醉乙醚、小玻瓶?！尽空匆颐逊湃肭鍧嵅Ｆ孔ト肫靠谶M行全麻醉麻醉深度不宜太淺或太深太深易遭麻醉死亡或非特異吸入肺太淺易滴打噴嚏。毛細吸吸取少許同毛細吸插試備用小白鼠握在掌中，大食抓小白鼠耳其朝前并呈仰臥位置，另一取事先吸有病毒懸液的吸，慢慢滴一點于滴口而不其自掉落，懸。懸滴靠近動物鼻尖，動物在呼吸時自吸入，一般為 0.05毫升，不宜過多。慢慢蘇醒飼養(yǎng)盒逐日開始發(fā)發(fā)癥狀毛聳咳嗽、不食、甚至死亡。解剖尸體可觀察到肺炎或性病灶。（）小白鼠腦內(nèi)接種（錄像）【材料】（）再加101013000分鐘，吸取上清液供接種用。小白鼠：3周齡，體重6～8克。無菌 0.25毫升注射器及針頭（4號）、煮針鍋、碘酊、棉簽?！痉椒ā恳詿o菌 0.25毫升注射器抽取腦炎病毒懸液 0.1毫升，去除注射器內(nèi)的氣泡。取出小白鼠，左手將小白鼠固定，固定時用大拇指和食指捏住小白鼠的頭部，左手手掌輕輕按住小白鼠的體部。右手以棉簽蘸以碘酒，消毒小白鼠顳部皮毛（不碰到眼）。（），，針 2～3毫，不，注射0.02～0.03毫升。注射，將用注射器煮針鍋內(nèi)煮消毒。在 3～4后病，食，，毛，，，。法用腦炎病毒的分離。、 病毒法法用病毒、病毒和病毒的分離、定、、生以及研病毒。和，體，血的分及器的的組織分，病毒病毒的和液體中，病毒；，、無菌的，接種的病毒不生體點，除生的病毒及的病毒，不生的指，必用定病毒的。接（）接種法（）【】病毒 10－3液，10～12齡、無菌 1毫升注射器及 7號針頭、磨器、、頭小、、碘酒棉、、大頭針、無菌、無?！痉椒ā坑?10～12齡，在上，根：小血清，小的眼點白和胎盤邊界限分明，白邊較亮，胎盤邊暗紅色，果胎盤邊黑或蒼白都表示已。鉛筆標明室位置育區(qū)避地記口區(qū)豐富呈現(xiàn)紅色，卵白尿囊液卵白尿囊液羊水氣室卵黃囊（）種（101腔種法錄像【材料】10～0～2圖。煮沸法放35～37。次日逐日觀察生活情況移4。意必須直立前并去4～5。種法適某些呼道如感、副感、新城等培養(yǎng)惟離培養(yǎng)不如羊腔種法陽性率高。10310～13、橡皮乳、眼科剪刀、無培養(yǎng)皿、生理鹽水其余同《腔種法。【方法】10～13觀察活發(fā)育界限。座使其部位部位中部待干即輕輕中三角形窗每許而不使裂同意必須1～2易與粘著。離或鋸；或往下壓迫個不致?lián)p立即橡皮乳2～3目空氣斑。絨毛尿囊膜卵白羊水卵黃囊尿囊液斑。絨毛尿囊膜卵白羊水卵黃囊尿囊液10-2 絨毛尿囊羊腔法錄像）031273一3不45。感自中出殼擴大便剪絨毛此明亮處清楚地到牛斑呈白色點狀有融合堆或片。左手起絨毛尿囊右手剪順殼四周剪絨毛尿囊入理鹽水洗滌 2張斑就得更為清楚。絨毛尿囊法除花外單純皰疹【材料】副流感0390齡體石蠟其同《尿囊腔接法》?！痉椒ā渴怪北P使其胎向便操作。鉛筆畫出和胎位置磨沿邊緣和胎位置近處鋸方邊約 1厘米許3。3挑方殼和管石蠟油少許2石蠟油很快散使透明這樣明或清楚地到整。41抽少許流感體直明或羊水氣室尿囊液羊水氣室尿囊液圖 10-3 接種病培養(yǎng)?。?。57262而致死；2死亡者視為特異性死亡流感或副流感病10－3稀釋一84減收獲。鑷以水一般水可一左。滴定水病。一病流感病副流感病流性腮腺炎病等。胞法是目應(yīng)廣種方法其優(yōu)點是濟適結(jié)果正確且敏較實驗物易于控制胞法應(yīng)于分離，進行清試驗制造疫苗抗原等方面。多胞或流死6內(nèi)生降等均可作胞培養(yǎng)來源。病感性引起病病特引起病病或感不流性乙型腦炎病敏感。一原代胞培養(yǎng)法【材料】90齡s氏溶％胰酶溶無菌剪無菌皿沉淀無菌胞抗素瓶100無菌玻璃153s1225700501壁溫箱孵育般4時附著壁8時長此時即調(diào)換接種病二傳代胞動經(jīng)過可胞細胞胞胞胞對病敏感范圍較廣曾被利病和鑒定如 a－2KB胞HeLa胞對脊髓灰質(zhì)炎型病腺病大多實驗應(yīng)病都敏感Hep－2胞也曾來離脊髓灰質(zhì)炎病柯薩奇 A病腺病RS病a來自宮頸癌p－2來自喉癌而B來自腭癌于胞作離用疫苗生產(chǎn)。材料】5片胞生長倒掉Hanks5孵育 1倒下繼續(xù)孵育 7℃0倒掉原量生長10吹打散胞。生長按原量34倍稀釋即能傳 4胞接種病病變觀察示教）材料】胞Hanks滴和腺病已長二只滴Hanks10.10.11附到上。取出每0.91～2。取出在低倍顯微鏡下觀察注意與形態(tài)排列等。注：方便保存此處觀察已經(jīng)過固定和染色。五、血凝抑制試驗血凝抑制試驗系利血凝素特異性抗體與表面相應(yīng)血凝素相互血凝現(xiàn)象抑制試驗。血凝抑制試驗適于具有血凝素試驗必須預(yù)定血凝，后定4血凝在與血凝定試驗相同應(yīng)下定。血凝定2玻璃板ml移器移頭管支、0.5雞紅、生理鹽水方法】按下表操程序：將有玻璃板從 號編號從第起直至第 0理鹽水 m。將∶5即取ml生理鹽水ml取∶5ml第 1混勻吹3從出ml移第 2如直至第 9第 9出m棄消缸內(nèi)第 10自第 0起向補充生理鹽水 m。自第 10起方向每0.5％雞紅球 m搖勻室溫靜止孔號2））孔號2））病毒稀釋度對照123456789222222222+++++++++*222222221603206401280）））各2各4*為1∶5稀釋尿囊液111∶0則410。（二）抑制試驗【材料】4∶52ml，【方法】按下表進行其操作程序1～109m第0加m。第18∶5m1出ml27第7ml缸內(nèi)8對照。第17m4第9ml液作對照。5m5孔號12345672222222）＋＋＋＋＋＋＋）*222222血清稀釋度1∶101∶201∶401∶801∶1601∶3202紅細胞對照2＋*244））各22各4表明功能正常對照底中心，呈鈕扣狀，表明血清中無凝集因子；測定孔中，如血球沉于孔底中心，呈鈕扣狀，表明血清中有相應(yīng)的血凝抑制抗體，為陽性孔；反之凝集者為陰性孔。血凝抑制效價：呈完全血凝抑制時的最高血清稀釋度。附錄：附錄：1病毒的雞胚培養(yǎng)，多采用來亨雞卵，其優(yōu)點為卵殼色白而薄，易于照視，如不能得到，一般家雞卵也可應(yīng)用。孵育溫度通常在 ～9℃之間，相對濕度 ～0％。孵育 4～5天后即可在檢蛋燈上檢查雞胚受精與否及發(fā)育情況。未受精之雞蛋于 4日后僅見模糊卵黃黑，無雞胚。的雞胚于 4日后即可見清之血，中有發(fā)育之胚，4～5天后日檢查胚情況，日之雞胚可見到清之上的血及之胚。點，在溫度即能發(fā)育，中胚，發(fā)育。與孵殼，殼的能體子和體子在，因不的，而有的能。的能和，殼之為血的，為，胚，為，胚，之間為中胚，因在發(fā)育的能，的在的3的，胚的，，為明體，，后中，胚發(fā)育到12～13天，得抗時，通常用稀釋后4℃?zhèn)溆?，可的沉，尿在雞胚發(fā)育的1113天最高，為 6～6.5。為胚最，胚，有，體于其中，在的，后來蛋白，為 1。卵黃附于胚，卵黃胚的，對培養(yǎng)病毒有用，。2．Hanks。：NaCl 160克KCl 8800OHO 2克·HO 22 21002將上述二溶液混合后加雙蒸水至1000毫升，加2毫升氯仿作為防腐劑，保存于4℃冰箱。原液乙：NaHPO·12HO 2 4 2KHPO 克 入800毫升雙蒸水2 4葡萄糖 20克0．4％液 10010002用前按以下比例配成。原液甲 1份原液乙 1份雙蒸水 18份910413．營養(yǎng)液的配制Hanks液 1000毫升水解乳白蛋白 5克0.59105～10NaHCO。34．0.25％胰蛋白酶溶液配制酶 2.5克使用液 1000毫升青霉素 10毫升（最終濃度100位/毫升）鏈霉素 10毫升（