生物傳感器及其應(yīng)用

生物傳感器

及其在食品中的應(yīng)用

2021/5/91一、什么是生物傳感器二、生物傳感器的構(gòu)成三、生物傳感器的分類四、各類生物傳感器的原理五、生物傳感器的應(yīng)用2021/5/92一、什么是生物傳感器傳感器（電極或探頭）：能感受規(guī)定的被測(cè)量并按照一定的規(guī)律將其轉(zhuǎn)換成可用信號(hào)的器件或裝置，它通常由敏感元件、轉(zhuǎn)化元件（換能器）及相應(yīng)的機(jī)械結(jié)構(gòu)和線路組成。2021/5/93生物傳感器：是利用生物物質(zhì)作為敏感材料，將所感受的生物信息轉(zhuǎn)換成電信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)的傳感器。某生物參數(shù)

感受器

電、熱、光

換能器

電信號(hào)處理器數(shù)字量2021/5/94生物傳感器的特點(diǎn)：不要求樣品的清晰度，檢測(cè)樣品一般不需要預(yù)處理,也不需另加其他試劑。樣品中被測(cè)組分的分離和檢測(cè)可以同時(shí)完成；選擇性高、分析速度快、操作簡(jiǎn)易；響應(yīng)快,樣品用量少,并且可反復(fù)多次使用；靈敏度高：可檢測(cè)0.1~1.0ppm濃度的物質(zhì)，最小極限為10-10g/mL。穩(wěn)定性相對(duì)較差：檢測(cè)結(jié)果易受物理和化學(xué)環(huán)境因素的影響?？蛇M(jìn)行活體分析；可以實(shí)現(xiàn)連續(xù)在線監(jiān)測(cè),容易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化測(cè)量。2021/5/95二、生物傳感器的構(gòu)成由固定化的生物敏感材料作識(shí)別元件（包括酶、抗體、抗原、微生物、細(xì)胞、組織、核酸等生物活性物質(zhì)）與適當(dāng)?shù)奈锢怼⒒瘜W(xué)換能結(jié)構(gòu)器（如氧電極、光敏管、場(chǎng)效應(yīng)管、壓電晶體等等）及信號(hào)放大裝置構(gòu)成。2021/5/96工作原理：待測(cè)物質(zhì)經(jīng)擴(kuò)散作用進(jìn)入固定生物膜敏感層，經(jīng)分子識(shí)別而發(fā)生生物學(xué)作用，產(chǎn)生的信息如分子濃度、光、電、熱、音等被相應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)換器變?yōu)榭啥亢吞幚淼碾娦盘?hào)，再經(jīng)二次儀表放大并輸出，以電極測(cè)定其電流值或電壓值，從而換算出被測(cè)物質(zhì)的量或濃度。2021/5/97生物膜的成膜固定技術(shù)與傳感器器件技術(shù)是生物傳感器的兩大關(guān)鍵支撐，決定生物傳感器的檢測(cè)質(zhì)量。2021/5/98生物膜的成膜技術(shù)分為物理或化學(xué)方法：物理方法有物理吸附與物理包埋?；瘜W(xué)方法有離子交換劑法、共價(jià)結(jié)合法、膠聯(lián)共聚法等，通過(guò)化學(xué)作用結(jié)合固定生物分子。2021/5/99傳感器器件技術(shù)：是將生物的特異關(guān)聯(lián)反應(yīng)中所伴隨的物理或化學(xué)變化通過(guò)熱、電、光、聲等信息載體轉(zhuǎn)換成電信號(hào)，通過(guò)放大或其他方式，傳遞到處理系統(tǒng)從而顯示被檢測(cè)物質(zhì)的量或質(zhì)。2021/5/910（一）根據(jù)換能器分類

換能器：主要是電化學(xué)或光學(xué)檢測(cè)元件(如：電流、電位測(cè)量電極、熱敏電阻、場(chǎng)效應(yīng)晶體管、壓電晶體及光纖等)。三、生物傳感器的類型及原理2021/5/911信號(hào)轉(zhuǎn)換器生物反應(yīng)產(chǎn)生的信號(hào)電極式各種電極活性物質(zhì)，如O2、CO2、H+、NH4+等熱敏電阻式熱光電纖維式光半導(dǎo)體式電場(chǎng)壓電晶體式氣體等離子體共振式磁場(chǎng)2021/5/912（1）將化學(xué)變化轉(zhuǎn)變成電信號(hào)

以酶?jìng)鞲衅鳛槔?酶催化特定底物發(fā)生反應(yīng),從而使特定生成物的量有所增減，用能把這類物質(zhì)的量的改變轉(zhuǎn)換為電信號(hào)的裝置和固定化酶耦合,即構(gòu)成酶?jìng)鞲衅?。常用轉(zhuǎn)換裝置有氧電極、過(guò)氧化氫。2021/5/913（2）將熱變化轉(zhuǎn)換成電信號(hào)

固定化的生物材料與相應(yīng)的被測(cè)物作用時(shí)常伴有熱的變化，例如大多數(shù)酶反應(yīng)的熱焓變化量在25-100kJ/mol的范圍。這類生物傳感器的工作原理是把反應(yīng)的熱效應(yīng)借熱敏電阻轉(zhuǎn)換為阻值的變化,后者通過(guò)有放大器的電橋輸入到記錄儀中。2021/5/914（3）將光信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)

例如，過(guò)氧化氫酶,能催化過(guò)氧化氫/魯米諾體系發(fā)光,因此如設(shè)法將過(guò)氧化氫酶膜附著在光纖或光敏二極管的前端,再和光電流測(cè)定裝置相連,即可測(cè)定過(guò)氧化氫含量。還有很多細(xì)菌能與特定底物發(fā)生反應(yīng),產(chǎn)生熒光，也可以用這種方法測(cè)定底物濃度。2021/5/915上述三類生物傳感器共同點(diǎn)：都是將分子識(shí)別元件中的生物敏感物質(zhì)與待測(cè)物發(fā)生化學(xué)反應(yīng),將反應(yīng)后所產(chǎn)生的化學(xué)或物理變化再通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)進(jìn)行測(cè)量,這種方式統(tǒng)稱為間接測(cè)量方式。2021/5/916（4）直接產(chǎn)生電信號(hào)方式這種方式可以使酶反應(yīng)伴隨的電子轉(zhuǎn)移、微生物細(xì)胞的氧化直接(或通過(guò)電子遞體的作用)在電極表面上發(fā)生，根據(jù)所得的電流量即可得底物濃度。這種方法受環(huán)境因素影響小，更穩(wěn)定。2021/5/917（一）根據(jù)感受器的生物敏感物質(zhì)分類感受器（分子識(shí)別元件）：由具有分子識(shí)別能力的生物功能物質(zhì)(如：酶、動(dòng)植物組織切片、微生物、抗原、抗體和核酸等)構(gòu)成。2021/5/918酶?jìng)鞲衅鞲鞣N酶微生物傳感器微生物細(xì)胞細(xì)胞器傳感器細(xì)胞膜、線粒體、電子傳遞體、微粒體等細(xì)胞器組織傳感器細(xì)胞組織免疫傳感器抗原、抗體基因（DNA）傳感器核酸（DNA、RNA）2021/5/9191.酶電極傳感器電極式生物傳感器

電極式生物傳感器的組成：2021/5/920電極活性物質(zhì)

電極被測(cè)物質(zhì)膜生物催化劑酶、微生物抗體、抗原細(xì)胞器、細(xì)胞組織輸出電信號(hào)電化學(xué)反應(yīng)電極式生物傳感器原理示意圖

2021/5/921電極式生物傳感器原理模式：被測(cè)物質(zhì)

固定化生物催化劑膜

電極活性物質(zhì)

電極

電信號(hào)

生物化學(xué)反應(yīng)電化學(xué)反應(yīng)2021/5/922以葡萄糖氧化酶(GOD)電極為例簡(jiǎn)述其工作原理：在GOD的催化下,葡萄糖被氧化生成葡萄糖酸和過(guò)氧化氫。C6H12O6+O2C6H12O7+H2O2根據(jù)上述反應(yīng),可通過(guò)氧電極(測(cè)氧的消耗)、過(guò)氧化氫電極(測(cè)H2O2的產(chǎn)生)和pH電極(測(cè)酸度變化)來(lái)間接測(cè)定葡萄糖的含量。2021/5/923

葡萄糖傳感器組成：葡萄糖氧化酶聚丙烯酰胺凝膠

包埋法葡萄糖氧化酶膜氧電極葡萄糖傳感器2021/5/924葡萄糖傳感器示意圖

PbPt記錄儀空氣被測(cè)溶液電解質(zhì)溶液聚四氟乙稀膜固定化葡萄糖氧化酶膜氧電極葡萄糖

酶催化反應(yīng)

電極旁O(shè)2濃度↓電化學(xué)反應(yīng)電流值↓→葡萄糖濃度

酶膜上氧電極上

主要性能：測(cè)量范圍：1~500mg/L

響應(yīng)時(shí)間：10~30s

使用壽命：60~100day2021/5/925最重要的酶有二類：即氧化還原酶和水解酶。前者可以催化用氧氣或NAD進(jìn)行氧化的物質(zhì)，后者可以催化物質(zhì)的水解反應(yīng)，酶催化反應(yīng)過(guò)程中通常伴隨有質(zhì)子、離子、熱量、光信號(hào)、電信號(hào)或質(zhì)量的變化。大部分生物傳感器都將酶作為識(shí)別響應(yīng)的復(fù)合系統(tǒng)。2021/5/926某些酶?jìng)鞲衅饕挥[表待測(cè)物質(zhì)固定化酶轉(zhuǎn)換器測(cè)量范圍(mg/L)響應(yīng)時(shí)間（min）穩(wěn)定性(day)葡萄糖葡萄氧化酶鉑電(H2O2)氧電極(O2)1~5×1031~5×10215(S)10(S)60~100100各種糖蔗糖酶、變旋酶葡萄糖氧化酶氧電極(O2)100~5000514乳酸乳酸脫氫酶燃料電極(NADH)~100030(S)14乙醇乙醇脫氫酶乙醇氧化酶原電池鉑電極(H2O2)<46000~30%(V)4020(S)>1430尿素尿酶銨電極(NH4+)氨電極(NH3)10~100010~10000.5~12~42130青霉素青霉素酶玻璃電極(H+)10~10000.5~27~14L-酪氨酸酪氨酸脫羧酶CO2電極(CO2)10~1041~2202021/5/9272.微生物傳感器在酶?jìng)鞲衅髦圃熘?，首先遇到的困難就是酶的提取與精制。微生物膜作為分子識(shí)別元件利用：①利用微生物細(xì)胞內(nèi)單一或多個(gè)酶的機(jī)能——類似于酶?jìng)鞲衅鳎虎诶梦⑸锏纳頇C(jī)能——呼吸活性、代謝產(chǎn)物等。2021/5/928（1）微生物傳感器的原理與分類酶活性測(cè)定型——以微生物酶催化反應(yīng)的活性為指標(biāo)；（類似于酶?jìng)鞲衅鳎┖粑钚詼y(cè)定型——以微生物呼吸活性為指標(biāo)；電極活性物質(zhì)測(cè)定型——以微生物代謝產(chǎn)物為指標(biāo)。2021/5/929①呼吸活性測(cè)定型——必須是好氣性微生物氧濃度↓氧電極電流值↓

CO2生成CO2電極電位值↑

氧

微生物利用的被測(cè)物質(zhì)好氣微生物膜2021/5/930②電極活性物質(zhì)測(cè)定型——包括厭氧和好氧微生物待測(cè)物質(zhì)固定化微生物膜

CO2CO2電極電位式

H2

鉑陽(yáng)極，Ag2O2陰極電流式

NH3

氨電極電位式

H+

玻璃電極電位式還原型輔酶燃料電極電流式2021/5/931（2）微生物傳感器特點(diǎn)微生物較酶易獲得，價(jià)格相對(duì)較低；穩(wěn)定性好，連續(xù)使用時(shí)間可達(dá)一個(gè)月左右；響應(yīng)時(shí)間比酶?jìng)鞲衅鏖L(zhǎng)，多數(shù)在10分鐘左右；特異性較酶?jìng)鞲衅鞑睢?/p>

2021/5/932（3）微生物傳感器實(shí)例例1：谷氨酸傳感器谷氨酸脫羧酶催化谷氨酸的反應(yīng)為：

HOOC-(CH2)2-CHNH2-COOH谷氨酸脫羧酶

HOOC-(CH2)2-CH2NH2+CO22021/5/933①傳感器制備大腸桿菌細(xì)胞↓冷凍干燥↓用水調(diào)勻↓涂布于尼龍網(wǎng)（60目，ф7mm）兩面↓置于CO2電極上↓外用賽璐酚膜蓋住↓谷氨酸傳感器電極膜（硅橡膠膜）細(xì)胞尼龍網(wǎng)(大腸桿菌)賽璐酚膜

CO2

電極2021/5/934②測(cè)定原理③主要性能

A．響應(yīng)時(shí)間：5min左右；

B．測(cè)量范圍：10~800mg/L；

C．使用壽命：20day。在無(wú)氧條件下

2021/5/935④專一性：

A．對(duì)谷氨酰胺有響應(yīng)，對(duì)其它氨基酸的作用可忽略。

B．葡萄糖<7.9g/L、醋酸<0.2g/L時(shí)，無(wú)影響。

C．無(wú)機(jī)離子影響可忽略。2021/5/936例2：氨傳感器①測(cè)定原理硝化菌氧化銨的反應(yīng)要消耗氧：NH4++O2

硝酸菌

NO2―NO2―+O2

硝化細(xì)菌

NO3―

NH4+

微生物反應(yīng)電極旁O(shè)2濃度↓電化學(xué)反應(yīng)電流值↓→推算NH4+濃度

硝化菌膜上

氧電極上2021/5/937②傳感器制備活性污泥↓分離

硝化菌↓固定于乙酸纖維素膜↓安裝于氧電極上↓測(cè)定銨（氨）微生物傳感器

氧電極

Pt乙酸纖維素膜(硝化菌)透氣膜聚四氟乙烯膜2021/5/938③主要特性響應(yīng)時(shí)間：2min(pH=10的緩沖溶液中)測(cè)量范圍：1～42mg/L相對(duì)誤差：<4%使用時(shí)間：20day2021/5/9393.免疫傳感器

（1）動(dòng)物的防疫機(jī)制：2021/5/940動(dòng)物的防衛(wèi)系統(tǒng)動(dòng)物防衛(wèi)系統(tǒng)清除有害因子外界:病原體體內(nèi):異常細(xì)胞維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定2021/5/941動(dòng)物的免疫防線：第一道防線（非特異性）物理生化屏障：皮膚、粘膜、皮膚及粘膜分泌物、胃酸第二道防線（非特異性）吞噬細(xì)胞、體液中抗菌蛋白、炎癥應(yīng)答第三道防線（特異性）細(xì)胞免疫、體液免疫（抗原抗體反應(yīng)）2021/5/942抗原與抗體抗原(antigen,Ag)是一類能誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)發(fā)生免疫應(yīng)答，并能與免疫應(yīng)答的產(chǎn)物(抗體或效應(yīng)細(xì)胞)發(fā)生特異性結(jié)合的物質(zhì)。性質(zhì)：抗原具有免疫原性和反應(yīng)原性兩種性質(zhì)。

2021/5/943免疫原性是指抗原刺激機(jī)體后，機(jī)體免疫系統(tǒng)能形成免疫應(yīng)答的產(chǎn)物的特異性免疫反應(yīng)。反應(yīng)原性是指產(chǎn)生的免疫應(yīng)答的產(chǎn)物與抗原進(jìn)行特異性結(jié)合的免疫反應(yīng)。

2021/5/944化學(xué)本質(zhì)：抗原一般是蛋白質(zhì)或脂多糖，存在于細(xì)胞、病毒、細(xì)菌和真菌的表面及血液和組織液中，外源性DNA、RNA也可視為抗原物質(zhì)?？乖煞滞庠葱钥乖蛢?nèi)源性抗原半抗原或不全抗原：沒(méi)有免疫原性，但有免疫反應(yīng)性，與載體蛋白結(jié)合后有抗原性。嗎啡2021/5/945常見(jiàn)外源性抗原2021/5/946抗體免疫系統(tǒng)受抗原刺激后，由被激活的淋巴細(xì)胞（漿細(xì)胞）產(chǎn)生能與抗原發(fā)生特異性結(jié)合的球蛋白，這類球蛋白稱為抗體。占血漿蛋白的20%。2021/5/947抗原抗體反應(yīng)：抗體與抗原能夠在動(dòng)物體內(nèi)或體外發(fā)生特異性的緊密結(jié)合。免疫電極傳感器就是利用抗原、抗體在體外的特異性結(jié)合反應(yīng)。2021/5/9482021/5/949（2）免疫電極傳感器免疫電極(immunobioelectrode)是以免疫物質(zhì)（抗原或抗體）作為敏感元件的電化學(xué)生物傳感器。免疫物質(zhì)的高特異性識(shí)別使免疫電極具有很高的特異性。

根據(jù)測(cè)定過(guò)程是否需要標(biāo)記物可分為直接免疫電極（directimmunoelectrode）和間接免疫電極（indirectimmunoelectrode）。

2021/5/950①直接免疫電極——不用任何標(biāo)記物

例如（設(shè)抗體為被測(cè)物）：抗體電信號(hào)（電壓）電化學(xué)或電學(xué)變化膜電壓變化特點(diǎn)：不需額外試劑，儀器要求簡(jiǎn)單，操作容易，響應(yīng)快；缺點(diǎn)：靈敏度低，因而難以作為標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法。2021/5/951（2）間接免疫電極

——需要制備酶標(biāo)抗體或酶標(biāo)抗原結(jié)合物

▲利用標(biāo)記物將免疫反應(yīng)的信號(hào)放大后間接測(cè)定抗原或抗體，這類電極稱為間接免疫電極，亦稱酶聯(lián)免疫測(cè)定法（ELISA法）（enzymelinkedimmunoassay）。2021/5/952例如（設(shè)抗體為被測(cè)物）：推測(cè)試樣中抗體濃度

抗體↓固定化酶標(biāo)抗原膜抗體與酶標(biāo)抗原結(jié)合↓

改變酶標(biāo)抗原存在狀態(tài)↓固定化酶標(biāo)抗原膜←底物狀態(tài)改變的酶標(biāo)抗原催化底物反應(yīng)↓反應(yīng)速度與試樣中抗體濃度有關(guān)↓2021/5/9532021/5/9544.DNA傳感器DNA測(cè)定主要指靶DNA的檢測(cè)、DNA序列測(cè)定和DNA雜交測(cè)定。DNA測(cè)定在分子生物學(xué)及其基因操作研究、臨床診斷、反恐偵檢、食品安全、檢疫等方面應(yīng)用廣泛。傳統(tǒng)的DNA檢測(cè)主要依靠膜上分子雜交和電泳，其特點(diǎn)是技術(shù)要求高，時(shí)間長(zhǎng)、成本高、效率低。近年來(lái)DNA傳感器和DNA列陣的出現(xiàn)，使DNA的檢測(cè)大大減化。2021/5/955（1）DNA傳感器的特點(diǎn)①特異性好。②穩(wěn)定性好—離體DNA比蛋白質(zhì)（酶）分子穩(wěn)定。③制備簡(jiǎn)單，DNA可用儀器批量合成。④DNA的操作方法具有通用性，容易標(biāo)準(zhǔn)化。⑤結(jié)合芯片技術(shù)，可制備DNA列陣，實(shí)現(xiàn)高通量測(cè)定。⑥靈敏度高，可以達(dá)到10-11mol/L以上。⑦用途極其廣泛。2021/5/956（2）DNA傳感器的分類★按轉(zhuǎn)換器的不同可分為電極型（電化學(xué)型）、光學(xué)型和質(zhì)量型等。其中應(yīng)用最廣泛的電極型DNA傳感器，根據(jù)其作用原理的不同可分為五大類：A.直接DNA電化學(xué)型（directDNAelectrochemistry）B.間接DNA電化學(xué)型（indirectDNAelectrochemistry）C.特異性氧化還原指示劑型（specificredoxindicator）D.DNA介導(dǎo)的帶電輸出型（DNA-mediatedchargetransport）E.納米顆粒電化學(xué)放大型（nanoparticleselectrochemicalenhancing）2021/5/957（3）DNA電化學(xué)傳感器原理DNA電化學(xué)傳感器通常由已知序列的單鏈DNA（ssDNA，通常稱為探針）分子和電極組成。樣品中互補(bǔ)的ssDNA固定化ssDNA

dsDNA電極表面

電信號(hào)變化識(shí)別和測(cè)定靶基因雜交反應(yīng)結(jié)構(gòu)變化電化學(xué)反應(yīng)2021/5/9585.組織電極與細(xì)胞器電極傳感器直接采用動(dòng)植物組織薄片作為敏感元件的電化學(xué)傳感器稱組織電極傳感器,其原理是利用動(dòng)植物組織中的酶,優(yōu)點(diǎn)是酶活性及其穩(wěn)定性均比離析酶高,材料易于獲取,制備簡(jiǎn)單,使用壽命長(zhǎng)等。但在選擇性、靈敏度、響應(yīng)時(shí)間等方面還存在不足。

2021/5/959動(dòng)物組織電極主要有:腎組織電極、肝組織電極、腸組織電極、肌肉組織電極、胸腺組織電極等。測(cè)定對(duì)象主要有:谷氨酰胺、葡萄糖胺6磷酸鹽、D氨基酸、H2O2、地高辛、胰島素、腺苷、AMP等。植物組織電極敏感元件的選材范圍很廣,包括不同植物的根、莖、葉、花、果等。植物組織電極制備比動(dòng)物組織電極更簡(jiǎn)單,成本更低并易于保存。

2021/5/960細(xì)胞器電極傳感器是利用動(dòng)植物細(xì)胞器作為敏感元件的傳感器。細(xì)胞器是指存在于細(xì)胞內(nèi)的被膜包圍起來(lái)的微小“器官”,如線粒體、微粒體、溶酶體、過(guò)氧化氫體、葉綠體、氫化酶顆粒、磁粒體等等。其原理是利用細(xì)胞器內(nèi)所含的酶(往往是多酶體系)。2021/5/961五、生物傳感器的應(yīng)用在發(fā)酵工業(yè)中的應(yīng)用在食品分析中的應(yīng)用在環(huán)境監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用在生物醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用在軍事上的應(yīng)用2021/5/962參數(shù)傳感器參數(shù)傳感器溫度熱電偶，熱敏電阻，鉑電阻溫度計(jì)DCO2CO2電極，膜管傳感器罐壓隔膜式壓力表醇類物質(zhì)濃度膜管傳感器，生物傳感器氣體流量熱質(zhì)量流量計(jì)基質(zhì)和代謝物濃度生物傳感器攪拌轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)速傳感器NH4+銨離子電極，氨電極，生物傳感器攪拌功率應(yīng)變計(jì)金屬離子濃度離子選擇性電極料液量測(cè)力傳感器排氣中氧分壓熱磁氧分析儀氣泡接觸電極排氣中CO2分壓紅外氣體分析儀流加物料流量轉(zhuǎn)速傳感器，測(cè)力傳感器濁度或菌體濃度光導(dǎo)纖維法。