生物化學(xué)與分子生物學(xué)：第14章 DNA的生物合成

第十四章DNA的生物合成DNAReplication11.DNA與染色體---DNA高度盤繞成基因組原核生物DNA真核生物染色體DNA2.DNA的結(jié)構(gòu)

DNA的生物合成又稱DNA復(fù)制。

復(fù)制（replication）是指遺傳物質(zhì)的傳代，以母鏈DNA為模板，按照堿基配對(duì)原則指導(dǎo)合成子鏈DNA的過程。復(fù)制親代DNA子代DNA本章主要內(nèi)容DNA復(fù)制的基本特征DNA復(fù)制的酶學(xué)和拓?fù)鋵W(xué)變化原核生物DNA復(fù)制過程真核生物DNA的生物合成過程逆轉(zhuǎn)錄和其他復(fù)制方式

第一節(jié)

DNA復(fù)制的基本規(guī)律

DNA復(fù)制的方式為半保留復(fù)制

(semi-conservativereplication)

DNA復(fù)制的形式為雙向復(fù)制

(bidirectionalreplication)

DNA復(fù)制的過程為半不連續(xù)復(fù)制

(semi-discontinuousreplication)7

一、DNA以半保留方式進(jìn)行復(fù)制（semiconservativereplication）

DNA復(fù)制時(shí)，母鏈DNA解開為兩股單鏈，各自作為模板，按堿基配對(duì)規(guī)律合成與模板互補(bǔ)的子鏈，形成子代DNA雙鏈，其中一股單鏈從親代完整地接受過來，另一股單鏈則是合成的，故稱半保留復(fù)制。

8AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+母鏈DNA復(fù)制過程中形成的復(fù)制叉子代DNA子鏈繼承母鏈遺傳信息的幾種可能方式:

全保留式半保留式混合式10半保留復(fù)制的實(shí)驗(yàn)依據(jù)

1958年，Messelson和Stahl用實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

1、把細(xì)菌放在含15NH4Cl的培養(yǎng)液中培養(yǎng)若干代，密度梯度離心分離出DNA是含15N的重DNA。

2、把含15N-DNA的細(xì)菌放14NH4Cl普通培養(yǎng)液中培養(yǎng)。子一代的DNA是中等密度DNA

。

3、繼續(xù)培育出子二代，其DNA則是中等密度DNA與普通DNA各占一半。

DNA半保留復(fù)制的實(shí)驗(yàn)證據(jù)含N15-DNA的細(xì)菌培養(yǎng)于14NH4Cl培養(yǎng)液

第一代

第二代梯度離心結(jié)果培養(yǎng)于14NH4Cl培養(yǎng)液重DNA普通DNA中等密度DNADNA半保留復(fù)制的意義按半保留復(fù)制的方式，子代保留了親代DNA的全部遺傳信息，體現(xiàn)了遺傳過程的相對(duì)保守性。遺傳的保守性是相對(duì)的，而不是絕對(duì)的。自然界還存在著普遍的變異現(xiàn)象。DNA復(fù)制時(shí)，從復(fù)制起始點(diǎn)(origin)向兩個(gè)方向解鏈，形成兩個(gè)延伸方向相反的復(fù)制叉，稱為雙向復(fù)制。二、DNA復(fù)制從起點(diǎn)的兩個(gè)方向延伸-雙向復(fù)制(bidirectionalreplication)

原核生物是單點(diǎn)起始雙向復(fù)制。其環(huán)形DNA為單復(fù)制子，只有一個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)。真核生物是多復(fù)制子雙向復(fù)制。其線形DNA有多個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)，形成多個(gè)復(fù)制子。（復(fù)制子是獨(dú)立完成復(fù)制的功能單位，一個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)起始的DNA復(fù)制區(qū)域稱為復(fù)制子replicon）。16原核生物的DNA雙向復(fù)制形成θ結(jié)構(gòu)17A.環(huán)狀雙鏈DNA及復(fù)制起始點(diǎn)B.復(fù)制中的兩個(gè)復(fù)制叉C.復(fù)制接近終止點(diǎn)(termination,ter)oriterABC原核生物DNA復(fù)制185’3’oriorioriori5’3’5’5’3’3’5’5’3’復(fù)制3’真核生物DNA復(fù)制19三、DNA復(fù)制反應(yīng)呈半不連續(xù)性355解鏈方向3′5′前導(dǎo)鏈(leadingstrand)后隨鏈(laggingstrand)3′3′5′岡崎片段20DNA合成酶只能催化DNA鏈從5到3端

前導(dǎo)鏈(leadingstrand)

：復(fù)制方向與解鏈方向一致的子鏈。領(lǐng)頭鏈復(fù)制是連續(xù)的。

后隨鏈(laggingstrand)

：復(fù)制方向與解鏈方向相反的子鏈。隨從鏈的復(fù)制是不連續(xù)的，形成多個(gè)岡崎片段。岡崎片段（Okazakifragment）：1968年，日本科學(xué)家岡崎用電鏡觀察到，原核生物大小在一千至二千核苷酸范圍，真核生物數(shù)百個(gè)核苷酸。復(fù)制中不連續(xù)的DNA片段。21第二節(jié)

DNA復(fù)制的酶學(xué)和拓?fù)鋵W(xué)變化

參與DNA復(fù)制的酶與物質(zhì)：

1、模板(template)底物

2、

dNTPs（N:A,G,C,T）3、解螺旋酶（解鏈酶）（helicase)4、拓?fù)洚悩?gòu)酶（topoisomerase)5、單鏈DNA結(jié)合蛋白SSB6、DNA聚合酶（DNApolymerase,DNA-pol)7、引物酶（primase)8、引物（primer)9、DNA連接酶（ligase)10、其他因子1、復(fù)制的基本化學(xué)反應(yīng)：核苷酸和核苷酸之間，通過3`,5`磷酸二酯鍵的生成而逐一聚合。反應(yīng)底物是dNTP，加入單鏈的是dNMP。（dNMP）n+d(NTP)（dNMP）n+1+PPi2、復(fù)制的方向性：新鏈只能從5`-端向3`-端延長（所有新生成的RNA或DNA單鏈其方向都是5`→3`，模板鏈與之反向互補(bǔ)平行）。3`3`5`5`模板鏈新生鏈復(fù)制的化學(xué)反應(yīng)

253`,5`磷酸二酯鍵的生成

一、DNA聚合酶催化脫氧核苷酸間的聚合

（DNA-depeendentpolymerase,DNA-pol)

全稱：依賴DNA的DNA聚合酶（DNA-dependentpolymerase)

簡(jiǎn)稱：DNA-pol活性：5`→3`聚合活性

外切酶活性DNA聚合酶的多種活性5′

AGCTTCAGGATA

|||||||||||3′TCGAAGTCCTAGCGAC5′35外切酶活性:53外切酶活性:?能切除引物及突變的DNA片段。能辨認(rèn)錯(cuò)配的堿基對(duì)，并將其水解。3′

（一）原核生物的DNA聚合酶

DNA-polIDNA-polII

DNA-polⅢ

原核生物的DNA聚合酶1、DNA-polⅢ：

結(jié)構(gòu)：由10種亞基組成的不對(duì)稱異聚合體。其中αεθ組成核心酶。功能：①真正的復(fù)制酶，α亞基具聚合活性。②ε亞基有3`→5`核酸外切酶活性和堿基選擇功能。２個(gè)核心酶(α、ε、θ)1個(gè)-復(fù)合物（、、、、、

6種亞基）1對(duì)-亞基（可滑動(dòng)的DNA夾子）全酶結(jié)構(gòu)包括：2、DNA-polII

有3`→5`核酸外切酶活性和聚合酶活性，對(duì)模板要求不高主要參與DNA損傷的應(yīng)急狀態(tài)修復(fù)（SOS修復(fù)）。3、DNA-polI

單一肽鏈的大分子，二級(jí)結(jié)構(gòu)以α-螺旋為主，從A至R共18個(gè)α-螺旋肽段。I螺旋與O螺旋之間有較大的空隙，可容納DNA鏈。小片段：A—F螺旋區(qū)大片段（Klenow片段）：G—R螺旋區(qū)polIDNA-polI作用：切除引物和突變片段；

（5`→3`核酸外切酶活性）復(fù)制和修復(fù)中的空隙填補(bǔ)；

（DNA聚合酶活性）復(fù)制中的錯(cuò)誤校讀。

（3→5`核酸外切酶活性）323個(gè)氨基酸小片段5核酸外切酶活性大片段/Klenow片段

604個(gè)氨基酸DNA聚合酶活性

5核酸外切酶活性N端C端木瓜蛋白酶DNA-polⅠKlenow片段是分子生物學(xué)常用的工具酶。

35

（二）真核生物的DNA聚合酶

DNA聚合酶主要有5種。

DNA-polα：起始引發(fā)，有引物酶活性

DNA-polβ：參與低保真復(fù)制

DNA-polγ：線粒體DNA復(fù)制酶

DNA-polδ：延長子鏈的酶，有解螺旋酶活性

DNA-polε：校對(duì)、修復(fù)、填補(bǔ)去除引物的缺口真核生物的DNA聚合酶真核生物的DNA聚合酶真核生物和原核生物DNA聚合酶的比較E.Coli真核細(xì)胞

功能DnaG引物酶Ⅱ低保真復(fù)制，DNA修復(fù)線粒體DNA合成Ⅲ前導(dǎo)鏈和后隨鏈合成，解旋酶Ⅰ校對(duì)和填補(bǔ)缺口線粒體DNA合成（一）復(fù)制的保真性依賴正確的堿基選擇利用“錯(cuò)配”實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，DNApolⅢ對(duì)核苷酸的參入（incorporation）具有選擇功能。二、DNA聚合酶的堿基選擇和校對(duì)

功能實(shí)現(xiàn)復(fù)制保真性Poly（dA）21引物Poly(dT)20dT,dA,dG,dCDNA合成體系Poly（dA）21引物Poly(dT)20dT,dA,dG,dCDNA合成體系（無ε亞基）21位上：dT21位上：dA,dG,dC,dT錯(cuò)配實(shí)驗(yàn)DNApolⅢ對(duì)嘌呤的不同構(gòu)型表現(xiàn)不同親和力，因此實(shí)現(xiàn)其選擇功能。原核生物DNA-polI、真核生物DNA-pol和真核生物DNA-pol具有3`→5`外切酶活性，可以在復(fù)制過程中辨認(rèn)并切除錯(cuò)配的堿基，對(duì)復(fù)制錯(cuò)誤進(jìn)行校正，這個(gè)過程叫錯(cuò)配修復(fù)（mismatchrepair）。（二）DNA聚合酶的核酸外切酶活性辨認(rèn)切除錯(cuò)配堿基并加以校正（即時(shí)校讀功能）

DNA復(fù)制的保真性，依賴三種機(jī)制：

①

遵守嚴(yán)格的堿基配對(duì)規(guī)律;②

聚合酶在復(fù)制延長中對(duì)堿基的選擇功能;③

復(fù)制出錯(cuò)時(shí)有即時(shí)的校讀功能。

三、復(fù)制中的解鏈伴有DNA分子

拓?fù)鋵W(xué)變化DNA分子的堿基埋在螺旋內(nèi)部，只有解成單鏈才能發(fā)揮模板作用

（一）多種酶參與DNA解鏈和穩(wěn)定單鏈狀態(tài)蛋白質(zhì)（基因）通用名功能DnaA(dnaA)辨認(rèn)復(fù)制起始點(diǎn)DnaB(dnaB)解旋酶解開DNA雙鏈DnaC(dnaC)運(yùn)送和協(xié)同DnaBDnaG(dnaG)引物酶催化RNA引物合成SSB單鏈結(jié)合蛋白穩(wěn)定已解開的單鏈DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ解開超螺旋原核生物復(fù)制中參與DNA解鏈的相關(guān)蛋白質(zhì)

復(fù)制起始時(shí)DnaA辨認(rèn)E.coli上復(fù)制起始點(diǎn)oriC（originC），DnaC輔助DnaB(解螺旋酶)結(jié)合起始點(diǎn)并打開雙鏈。（DnaADnaBDnaC分別是dnaAdnaBdnaC基因產(chǎn)物)。E.coli基因圖E.Coli基因圖解旋酶（helicase）又稱DnaB，其作用是利用ATP供能來解開DNA雙鏈。單鏈DNA結(jié)合蛋白（singlestrandedDNAbindingprotein，SSB）作用是在復(fù)制中維持模板處于單鏈狀態(tài)并保護(hù)單鏈的完整。復(fù)制過程中不斷與單鏈DNA結(jié)合和脫離。引物酶（primase）又稱DnaG，作用是催化形成短片段的RNA引物，在其3`-OH端開始復(fù)制。

(二)DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶（DNAtopoisomerase）

拓?fù)洌褐肝矬w或圖像作彈性移位而又保持物體不變的性質(zhì)。復(fù)制解鏈中的DNA分子繞雙螺旋軸高速解鏈旋轉(zhuǎn)（旋轉(zhuǎn)100次/秒），會(huì)造成解鏈前方的DNA分子纏繞打結(jié)，通過拓?fù)洚悩?gòu)酶的作用，以改變DNA分子拓?fù)錁?gòu)象，解除DNA分子纏繞打結(jié)。

108局部解鏈后復(fù)制過程正超螺旋的形成：拓?fù)洚悩?gòu)酶作用特點(diǎn)：既能水解，又能連接磷酸二酯鍵拓?fù)洚悩?gòu)酶分類：拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ切斷DNA雙鏈中一股鏈，使DNA解鏈旋轉(zhuǎn)不致打結(jié)；適當(dāng)時(shí)候封閉切口，DNA變?yōu)樗沙跔顟B(tài)。反應(yīng)不需ATP。拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ切斷DNA分子兩股鏈，斷端通過切口旋轉(zhuǎn)使超螺旋松弛。利用ATP供能，連接斷端，DNA分子進(jìn)入負(fù)超螺旋狀態(tài)。作用機(jī)制：作用：連接DNA單鏈3`-OH末端和相鄰DNA單鏈的5`-P末端,使二者生成3`，5`-磷酸二酯鍵，從而把兩段相鄰的DNA單鏈連成完整的鏈，需ATP。圖四、DNA連接酶連接復(fù)制中產(chǎn)生的單鏈缺口（DNAligase）HO5’3’3’5’DNA連接酶ATPADP5’3’5’3’POO-O-OPOO-O-O提供核糖3-OH提供5-P結(jié)果DNA聚合酶引物或延長中的新鏈游離dNTP去PPi(dNTP)n+1連接酶復(fù)制中不連續(xù)的兩條單鏈不連續(xù)→連續(xù)鏈拓?fù)涿盖袛?、整理后的兩鏈改變拓?fù)錉顟B(tài)DNA聚合酶，拓?fù)涿负瓦B接酶催化3,5-磷酸二酯鍵生成的比較

第三節(jié)原核生物DNA復(fù)制過程

一、復(fù)制的起始需要解決兩個(gè)問題(一)DNA解鏈，提供模板(二)合成引物，提供3-OH，形成引發(fā)體(一)DNA解鏈，提供模板復(fù)制起始點(diǎn)結(jié)構(gòu)：E.coli固定的復(fù)制起始點(diǎn)OriC跨度為245bp，包含有3組串連重復(fù)序列和2對(duì)反向重復(fù)序列。E.coli復(fù)制起始點(diǎn)oriCGATTNTTTATTT···GATCTNTTNTATT···GATCTCTTATTAG···11317293244···TGTGGATTA-‖-TTATACACA-‖-TTTGGATAA-‖-TTATCCACA5866166174201209237245

串聯(lián)重復(fù)序列

反向重復(fù)序列5353（一）

DNA的解鏈E.coli復(fù)制起始點(diǎn)oriCGATTNTTTATTT···GATCTNTTNTATT···GATCTCTTATTAG···11317293244···TGTGGATTA-‖-TTATACACA-‖-TTTGGATAA-‖-TTATCCACA5866166174201209237245

串聯(lián)重復(fù)序列

反向重復(fù)序列53531.固定起始點(diǎn)原核生物的復(fù)制起始部位及解鏈

復(fù)制起始過程：

DnaA辨認(rèn)結(jié)合于OriC重復(fù)序列，DnaC輔助DnaB結(jié)合于OriC附近，解開局部雙鏈

，置換出DnaA，DnaG（引物酶）進(jìn)入，形成引發(fā)體。繼續(xù)解鏈，SSB結(jié)合保護(hù)解開的單鏈，拓?fù)洚悩?gòu)酶發(fā)揮作用，引物酶催化生成RNA引物，復(fù)制起始完成。2.DNA解鏈需多中蛋白質(zhì)參與35DnaCDnaBDnaG35oriCDnaB,DnaC,DnaG與OriC共同形成引發(fā)體（二）引物合成和引發(fā)體形成3535引物是由引物酶催化合成的短鏈RNA分子。引物3'HO5'引物酶3535引物5'SSBDnaB引物酶5'復(fù)制延長拓?fù)洚悩?gòu)酶5'聚合酶

二、復(fù)制的延長

復(fù)制的延長是在DNA-polⅢ催化下以dNTP為原料，以dNMP方式逐個(gè)加入到引物或延長中的新鏈3`-OH末端上，逐個(gè)形成3`,5`-磷酸二酯鍵,復(fù)制方向5`→3`，復(fù)制特點(diǎn)：半不連續(xù)性復(fù)制。圖1圖2DNA復(fù)制速度相當(dāng)快，E.coli20分鐘可繁殖一代，每秒可參入2500個(gè)核苷酸。5'3'5'dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH3'3'DNA-pol領(lǐng)頭鏈的合成：領(lǐng)頭鏈的子鏈沿著5→3方向可以連續(xù)地延長。后隨鏈的合成復(fù)制延長過程555RNA酶OHP5DNA-polⅠdNTP55PATP

ADP+Pi55DNA連接酶子鏈上不連續(xù)性片段的連接復(fù)制過程簡(jiǎn)圖5'3'5'dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH3'3'DNA-pol領(lǐng)頭鏈的合成：領(lǐng)頭鏈的子鏈沿著5→3方向可以連續(xù)地延長。后隨鏈的合成

在復(fù)制叉同時(shí)合成前導(dǎo)鏈和后隨鏈復(fù)制過程簡(jiǎn)圖三、復(fù)制的終止：切除引物、填補(bǔ)空缺、

連接缺口

原核生物環(huán)狀DNA采取單復(fù)制子雙向復(fù)制。領(lǐng)頭鏈和隨從鏈上的RNA引物被RNA酶（或DNA-polI）水解，空隙由DNA-polI來催化填補(bǔ)，DNA連接酶將各片段連接成完整的環(huán)狀新鏈，形成兩個(gè)完整的環(huán)狀DNA。

ori5`3`原核生物復(fù)制終止terterori3`3`5`5`5`3`3`5`3`5`555RNA酶OHP5DNA-polⅠdNTP55PATP

ADP+Pi55DNA連接酶子鏈上不連續(xù)性片段的連接（動(dòng)畫7）53355335+53333555（動(dòng)畫7）細(xì)胞周期DNA合成期G1G2SM第四節(jié)真核生物的DNA生物合成

細(xì)胞周期可分為：S期（Syntheticphase,DNA合成期）G2期（GapⅡ,DNA合成后期）M期（mitoticphase,有絲分裂期）G1期（GapⅠ,DNA合成前期）DNA在每個(gè)細(xì)胞周期只復(fù)制一次1.

真核生物DNA復(fù)制是多復(fù)制子雙向復(fù)制，有多個(gè)起始點(diǎn)；2.

復(fù)制有時(shí)序性，復(fù)制子以分組方式激活而不是同步起動(dòng)；一、復(fù)制的起始

真核生物復(fù)制起始與原核生物基本相似，有以下特點(diǎn)：3.復(fù)制起始點(diǎn)序列較原核oriC短。酵母復(fù)制起始點(diǎn)含11bp的自主復(fù)制序列：A(T)TTTATA(G)TTTA(T)。4.DNA-polα具引物酶活性，DNA-polδ具解螺旋酶活性。5.增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)參與復(fù)制起始。其作用與原核DNA-polⅢ的β亞基相似，形成鉗卡DNA的夾子。二、復(fù)制的延長真核生物復(fù)制延長與原核生物基本相似，有以下特點(diǎn)：1、DNA-polα生成引物（RNA+小段DNA）。2、DNA-polδ在增殖細(xì)胞核抗原PCNA協(xié)助下合成DNA子鏈。3、引物和岡崎片段較原核生物短，單個(gè)復(fù)制子復(fù)制速度慢，但總體速度不慢。3553前導(dǎo)鏈3535親代DNA后隨鏈引物核小體三、真核生物DNA合成后立即組裝成核小體四、端粒酶參與解決染色體末端復(fù)制

1、真核生物復(fù)制終止真核生物復(fù)制終止與原核生物基本相似。不同點(diǎn)：DNA為線形，復(fù)制結(jié)束時(shí)兩條新生子鏈的5`端的引物切下后形成的空隙需端粒酶修補(bǔ)并形成端粒。線性DNA復(fù)制的末端5`3`端粒酶RNA5`3`3`OH5`3`逆轉(zhuǎn)錄反折5`DNA-polε，連接酶TTTGGGTTTGG-OH3`AAACCCAAACCCAAACCCTTTGGGTTTGGGTTTGGG-OH3`AAACCCAAACCCAAACCC端粒酶RNA2、端粒（telomere）是真核生物染色體線性DNA分子末端的膨大的粒狀結(jié)構(gòu)，由DNA和結(jié)合蛋白形成。在維持染色體的穩(wěn)定性和DNA復(fù)制的完整性有重要作用。

端粒DNA序列共同特點(diǎn)是富含T、G短序列的重復(fù)序列(TnGn)x3、端粒酶(telomerase)

是一種RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物。

端粒酶RNA

(AnCn)x

端粒酶協(xié)同蛋白端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶端粒酶端粒酶以其RNA為模板，在其協(xié)同蛋白參與下，其逆轉(zhuǎn)錄酶催化生成DNA單鏈。端粒酶借助其RNA與DNA單鏈有互補(bǔ)堿基序列而辨認(rèn)結(jié)合。以RNA為模板的逆轉(zhuǎn)錄，進(jìn)行母鏈DNA的延長。延長以后的單鏈反折，DNA-polε以其3`-OH末端復(fù)制DNA單鏈，填補(bǔ)引物切除后的缺失，DNA連接酶完成連接。

端粒酶（TBP）類似于反轉(zhuǎn)錄酶，其中的RNA與DNA