化學檢測技術

關于化學檢測技術第1頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月一、糖類的化學檢測糖類包括多糖、雙糖、單糖單糖和某些雙糖具有游離羰基——還原糖多糖和蔗糖等無還原性——非還原糖糖類化學檢測主要是利用游離羰基的還原性質(zhì)，與試劑（氧化劑）進行氧化還原反應而進行測定的。非還原糖必須轉(zhuǎn)化為還原糖再進行測定2第2頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月最常用的試劑：斐林（Fehling）試劑基本組成：

A：CuSO4溶液

B:NaOH和酒石酸鉀鈉溶液使用時A、B等體積混合(生成酒石酸鉀鈉銅）酒石酸鉀鈉銅是氧化劑，可與還原糖的游離羰基發(fā)生氧化還原反應，而進行糖的測定。3第3頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月定糖常用方法1、蘭—愛農(nóng)（Lane-Eynon）法次甲基藍（亞甲基藍、四甲基藍）法、（置換法、直接滴定法）反應終點用次甲基藍指示劑顯示（還原糖滴定斐林試劑，由于次甲基藍氧化能力比二價銅弱，待二價銅全部還原后，過量1D還原糖使次甲基藍還原，藍色消失）多糖或其他非還原糖需轉(zhuǎn)化為還原糖后再滴定如淀粉，可用酸解或酶解4第4頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月操作要點（1）斐林試劑的標定（a）標定預備試驗

A、B各5mL＋10mL水（250mL三角瓶中）搖勻，加熱至沸騰，＋2D1％次甲基藍溶液，用標準葡萄糖液滴定至藍色消失，耗標準葡萄糖液（0.1％或0.2％）V1mL。（b）標定A、B各5mL＋10mL水（250mL三角瓶中）搖勻，從滴定管中預先加入（V1-1)mL標準葡萄糖液，搖勻后加熱至沸騰，＋2D1％次甲基藍溶液，用標準葡萄糖液滴定至藍色消失（滴定在1min內(nèi)完成），記錄消耗標準葡萄糖液的總毫升數(shù)V05第5頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月(2)定糖（a）定糖預備試驗

A、B各5mL＋10mL樣品糖液（250mL三角瓶中）搖勻，加熱至沸騰，＋2D1％次甲基藍溶液，用標準葡萄糖液滴定至藍色消失，耗標準葡萄糖液（0.1％或0.2％）V2mL。（b）定糖

A、B各5mL＋10mL樣品糖液（250mL三角瓶中）搖勻，補加（V0-V2）mL水，并從滴定管中預先加入（V2-1)mL標準葡萄糖液，搖勻后加熱加熱至沸騰，＋2D1％次甲基藍溶液，用標準葡萄糖液滴定至藍色消失（滴定在1min內(nèi)完成），記錄消耗標準葡萄糖液的總毫升數(shù)V。6第6頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月

(3)計算還原糖含量（以葡萄糖計）＝（V0-V)×c×(1/10)×n注意：（a）AB分開儲存，防止Cu++變化，臨用混合（b）單標移液管吸液準確，外壁也需擦干凈（c）體積需控制在一定范圍內(nèi)，對pH有影響（d）煮沸時間要一致（e）注意指示劑加入時間和加入量一致（f）滴定速度一致（后滴定0.5～1mL，1min內(nèi)完成）（g）產(chǎn)物Cu2O不穩(wěn)定，次甲基藍變色也不穩(wěn)定，暴露于空氣或沸騰顏色變化，滴定過程不能搖動，不可中途中止加熱

7第7頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月斐林試劑快速法：在斐林試劑中加入亞鐵氰化鉀（黃血鹽）反應終點為藍色消失，淡黃色出現(xiàn)。反應終點比蘭－愛農(nóng)法更為明顯。8第8頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月2、碘量法I2→NaIO(氧化劑）其氧化能力較弱，僅適用于醛糖的測定，與酮糖不起反應操作要點：（1）標準硫代硫酸鈉溶液配制，0.05mol/L，沸騰后冷卻水配制，存放在棕色瓶中，一周后用標準重鉻酸鉀標定。（2）標準碘液配制，0.1mol/L（3）空白滴定：空白液，用硫代硫酸鈉滴定試劑中全部碘9第9頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月碘量瓶中，10mL0.1mol/L碘液＋15mL0.1mol/LNaOH＋5mL空白液，搖勻后暗反應15min＋1mL1mol/L硫酸溶液，用0.05mol/L硫代硫酸鈉滴定至淺黃色，加0.2mL0.5％淀粉液作指示劑，滴定至藍色消失，記錄V0(4)樣品滴定：以5mL樣品液代替空白液，V1(5)計算：醛糖含量＝（V0

－V1）C×M×n注意：暗反應后需酸化再滴定，滴定時開始輕搖（碘揮發(fā)），后再搖（淀粉吸附碘）配合次甲基藍法測定某些糖含量（如：果糖）10第10頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月3、銅試劑法

將還原糖與二價銅離子反應生成的Cu2O用碘氧化，再用硫代硫酸鈉滴定反應液中剩余的碘而測定樣品還原糖的含量。（1）銅試劑的配制主要提供二價銅離子及碘（2）標準曲線的制作11第11頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月(a)標準葡萄糖液的配制

0.1%或0.05％（根據(jù)所用銅離子試劑定）(b)三角瓶編號123456

葡萄糖標準液（mL)012345

蒸餾水（mL)543210

銅試劑（mL)555555

沸水浴10min，冷卻至室溫,(c)各加入0.5mol/L硫酸5mL，振蕩，待紅色Cu2O完全溶解后，用硫代硫酸鈉滴定至終點，記錄耗用量V(d)繪標準曲線葡萄糖含量（mg）為縱坐標，（V0-V)為橫坐標12第12頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月二、蛋白質(zhì)和氨基酸的化學檢測蛋白質(zhì)含氮量幾乎恒定，平均16％測出N含量×6.25，即為蛋白質(zhì)量eg：

含氮量每克N相當?shù)鞍踪|(zhì)量

肉、蛋、豆16％6.25面粉17.6％5.70奶品15.7％6.38花生18.2％5.50鮭精蛋白31.5％3.1713第13頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月蛋白質(zhì)常用檢測方法1、定氮法（經(jīng)典的，仲裁的）

凱氏定氮法或微量凱氏定氮法（1）原理消化、蒸餾、吸收、滴定計算（2）操作要點

(a)消化：目的：使樣品中的蛋白質(zhì)分解，其中氮與硫酸反應生成(NH4)2SO4

凱氏定氮瓶，樣品＋K2SO4-CuSO4、濃H2SO4,通風廚內(nèi)進行，消化液全部移入100mL容量瓶定容。14第14頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月15第15頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月(b)蒸餾：目的：堿化蒸餾使氨游離。加10～50ml30%氫氧化鈉，防止漏氣。(c)吸收：5mL2％H3BO3吸收或一定量標準酸溶液（如25mL0.05mol/LH2SO4)＋甲基紅－溴甲酚綠幾滴(d)滴定計算：若H3BO3吸收：0.01mol/LHcl滴定至綠色→淡紫紅色樣品中的總氮量（mg)=（A-B)×C×14×n

若標準硫酸接收：0.1mol/L標準NaOH滴定，甲基紅→黃色終點樣品中總氮量=（C1V1-C2V2)×14×n粗蛋白含量＝樣品的總氮量×6.2516第16頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月2、雙縮脲試劑法蛋白質(zhì)含有兩個以上脲鍵，有雙縮脲反應：蛋白質(zhì)（多肽）＋CuSO4→（NaOH）→銅－鈉雙縮脲絡合物（紫紅色絡合物）A∝Cp，與蛋白質(zhì)的分子量和氨基酸組成無關Tris緩沖液干擾P的測定，測定范圍1～10mg/mL17第17頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月操作：（1）雙縮脲試劑的配制

CuSO4、酒石酸鉀鈉、NaOH、0.1%KI(2)標準曲線的制作1％標準酪蛋白(mL)00.20.40.60.81.0蒸餾水(mL)1.00.80.60.40.20雙縮脲試劑(mL)444444室溫反應30min測A540(3)樣品測定：

1mL＋4mL雙縮脲試劑，30min，測A54018第18頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月3、福林－酚試劑法是雙縮脲法的發(fā)展，靈敏高100倍，需時較長，而且對雙縮脲反應有干擾的物質(zhì)對其影響更大，酚類和檸檬酸也有干擾。原理：（1）堿性銅試劑——雙縮脲反應（2）稀釋的苯酚試劑——與酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸反應呈藍色（3）兩種呈色反應可疊加19第19頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月操作：（1）福林－酚試劑的配制甲液：堿性銅試劑（A、NaOH、NaCO3,B、CuSO4和酒石酸鉀鈉)

乙液：稀釋的苯酚試劑（2）標準蛋白溶液配制結晶牛血清蛋白溶于0.9％NaCl或用酪蛋白（凱氏定氮法測定含量）（3）標準曲線制作（4）樣品測定

1mL樣品（含P15～500μg）＋5mL甲液，室溫10min，＋乙液0.5mL，混勻，室溫30min，測A500~75020第20頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月氨基酸含量測定方法1、茚三酮顯色法

微酸性條件下，氨基酸茚三酮反應生成紫色化合物，亞氨基酸（脯氨酸和羥脯氨酸）茚三酮反應生成黃色化合物。蛋白質(zhì)、多肽和氨基酸均可發(fā)生印三酮反應。取1mL樣品溶液（含氨基酸0.1～50ug)加1mL緩沖液（pH5.0～6.7），再加1mL茚三酮顯色液，100℃

水浴15min，自來水冷卻后，加入3mL60％乙醇溶液，測定OD570，脯氨酸或羥脯氨酸測OD44021第21頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月2、甲醛滴定法氨基酸是兩性電解質(zhì)，不能用一般酸堿指示劑通過氫氧化鈉來測定。加甲醛生成羥甲基衍生物，可以用堿滴定。注意：需用過量中性甲醛。22第22頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月三、核酸的化學檢測根據(jù)核酸所含的磷及戊糖的化學性質(zhì)，可用定磷法、二苯胺法和地衣酚法等進行檢測。1、定磷法（1）核酸的消化（2）磷的測定定磷試劑，45℃水浴25min，冷卻至室溫測OD650

無機磷標準液作標準曲線（3）核酸含量的計算一般DNA含磷9.5％,RNA含磷9.2％，RNA量＝（總磷量－無機磷量）×10.9DNA量＝（總磷量－無機磷量）×10.523第23頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月2、二苯胺法測定DNA含量DNA中的2-脫氧核糖在酸性環(huán)境中與二苯胺試劑一起加熱產(chǎn)生藍色反應，在595nm處有最大吸收峰。在40～400μg范圍內(nèi)，OD595與DNA濃度成正比。（1）二苯胺試劑的配制（2）標準曲線制作（3）樣品DNA含量測定24第24頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月3、地衣酚法測定RNA含量

RNA在濃鹽酸和三氯化鐵的存在下，與3，5－二羥甲苯（地衣酚）反應，生成綠色物質(zhì)。一定濃度范圍內(nèi)，OD670與RNA濃度成正比。所有戊糖均可進行此反應，注意干擾（如DNA）。操作：地衣酚試劑配制；標準曲線制作；樣品RNA測定25第25頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月三、蛋白質(zhì)的免疫化學檢測

利用抗原與抗體之間特異的結合反應而對蛋白質(zhì)進行定性定量分析技術。一、抗原-抗體反應（antigen-antibodyreaction）是指抗原與相應抗體在體內(nèi)或體外發(fā)生的特異性結合反應。

反應的特點：

可逆性

最適比例

特異性

敏感性26第26頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月（1）凝集反應效價測定，細菌、病毒分類（2）沉淀反應沉淀反應、界面（環(huán)狀）試驗、免疫擴散、免疫電泳、免疫親和層析、免疫熒光檢測等（3）免疫標記二、蛋白質(zhì)的免疫化學檢測方法27第27頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月

1、凝集反應

凝集反應（agglutination）是指細菌、紅細胞等顆粒性抗原與相應抗體結合后，在一定條件下出現(xiàn)肉眼可見的凝聚物。其中參與反應的抗原稱為凝集原，其抗體稱為凝集素。28第28頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月直接凝集：細菌或紅細胞與相應抗體直接反應，可出現(xiàn)凝集現(xiàn)象。間接凝集反應：將可溶性抗原包被在與免疫無關的載體顆粒表面，再與相應抗體反應出現(xiàn)顆粒物凝集現(xiàn)象。

間接凝集抑制試驗：將待測抗原與特異性抗體先行混合并作用一定時間，再加入相應致敏載體懸液。若待測抗原與抗體對應，即發(fā)生中和，隨后加入的相應致敏載體顆粒不再被凝集，使本應出現(xiàn)的凝集現(xiàn)象被抑制。29第29頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月30第30頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月

2、沉淀反應可溶性抗原沉淀反應（precipitation）:可溶性抗原與相應的抗體結合后，在一定條件下出現(xiàn)肉眼可見的沉淀。包括：血清蛋白質(zhì)、細胞裂解液或組織浸液、各種微生物蛋白分子等。反應特點：比例性包括：沉淀試驗、界面試驗、免疫擴散（單向免疫擴散、雙向免疫擴散）、免疫電泳、免疫親和層析、免疫熒光31第31頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月沉淀試驗界面試驗32第32頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月33第33頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月3、免疫標記免疫標記技術（immunolabellingtechnique）

用熒光素、酶、放射性核素或化學發(fā)光物質(zhì)等標記抗體或抗原，進行抗原抗體反應的檢測。

34第34頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月常用的免疫標記物質(zhì)：

熒光素,酶,放射性核素,金屬顆粒具體檢測分為：免疫熒光法、酶免疫測定、放射免疫測定法、化學發(fā)光免疫分析、免疫印跡法35第35頁，課件共43頁，創(chuàng)作于2023年2月（1）免疫熒光法免疫熒光法（immunofluorescenc