生物化學(xué)與分子生物學(xué)第二十一章DNA重組及重組DNA技術(shù)

第8版生物化學(xué)與分子生物學(xué)第二十一章

DNA重組及重組DNA技術(shù)

GeneticRecombinationandGeneticEngineering主要內(nèi)容2自然界的DNA的重組和基因轉(zhuǎn)移13重組DNA技術(shù)在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用重組DNA技術(shù)2發(fā)生在同源序列間的重組，又稱基本重組。是最基本的DNA重組方式，通過鏈的斷裂和再連接，在兩個DNA分子同源序列間進行單鏈或雙鏈片段的交換。以E.coli的同源重組為例，了解同源重組機制的Holliday模型。一、同源重組(homologousrecombination)第一節(jié)自然界的DNA的重組和基因轉(zhuǎn)移3Holliday模型中，同源重組主要4個關(guān)鍵步驟①兩個同源染色體DNA排列整齊②一個DNA的一條鏈斷裂、并與另一個DNA對應(yīng)的鏈連接，形成Holliday中間體③通過分支移動產(chǎn)生異源雙鏈DNA④Holliday中間體切開并修復(fù)，形成兩個雙鏈重組體DNA，分別為：片段重組體(patchrecombinant)拼接重組體(splicerecombinant)4片段重組體

：

切開的鏈與原來斷裂的是同一條鏈，重組體含有一段異源雙鏈區(qū)，其兩側(cè)來自同一親本DNA。拼接重組體：

切開的鏈并非原來斷裂的鏈，重組體異源雙鏈區(qū)的兩側(cè)來自不同親本DNA。5Holliday連接體Holliday連接體（Hollidayintermediate），RobinHolliday1964年發(fā)現(xiàn)Holliday連接體一旦形成就能進行重排，從而改變鏈的彼此關(guān)系，形成不同的構(gòu)象，構(gòu)象決定了在Holliday連接體拆分時是否發(fā)生重組。6

內(nèi)切酶

(recBCD)DNA侵擾(recA)分支遷移

(recA)

內(nèi)切酶(recBCD)

DNA

連接酶5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′3′3′5′3′5′3′3′5′5′3′5′3′5′3′Holiday中間體5′3′5′3′5′3′5′3′7Holiday中間體5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′5′5′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′內(nèi)切酶(RuvC)內(nèi)切酶(RuvC)

DNA連接酶

DNA連接酶片段重組體拼接重組體8RecA右手螺旋的核蛋白細絲，6個圍一圈重組酶Lehninger's.Principles.of.Biochemistry.4th9二、位點特異重組位點特異重組(site-specificrecombination)

是由整合酶催化，在兩個DNA序列的特異位點間發(fā)生的整合λ噬菌體的DNA整合細菌的位點特異性重組免疫球蛋白基因重排10（一）λ噬菌體DNA的整合λ噬菌體的整合酶識別噬菌體和宿主染色體的特異靶位點發(fā)生選擇性整合噬菌體重組位點attP，大腸桿菌重組位點attB，15bp核心序列整合酶Int、整合宿主因子IHF、Xis參與切除11特異的重組位點—附著位點細菌∽attB，由BOB’組成噬菌體∽attP，由POP’組成

O稱為核心序列、B、P稱為臂重組酶——λ整合酶（integrase，Int）非細菌重組所必需整合宿主因子（integrationhostfactor，IHF）Xis蛋白：改變DNA結(jié)構(gòu)，使其對整合呈惰性參與切除反應(yīng)噬菌體編碼宿主編碼整合反應(yīng)12λ噬菌體的生活史溶菌生長途徑(lysispathway)溶源菌生長途徑(lysogenicpathway)13

H2鞭毛素阻遏蛋白Hin重組酶轉(zhuǎn)位片段hinH2IH1

H1鞭毛素hinH2IDNA啟動序列H1啟動序列（二）細菌的特異位點重組鼠傷寒沙門氏菌H片段倒位決定鞭毛相轉(zhuǎn)變14免疫球蛋白是具有抗原決定簇結(jié)合特異性的各種球蛋白分子的總稱。多樣性是免疫球蛋白的重要特性。自然界的抗原種類極多，每種抗原還有不同的抗原決定簇，因此具有多種特異性的免疫球蛋白分子的種類也必定是極其眾多的，可以有幾百萬種。可是，脊椎動物基因組內(nèi)所有的基因總共不過幾萬個左右。因此，決不可能有那么多的免疫球蛋白基因去編碼每一種特定的免疫球蛋白分子。研究證是通過基因重排來實現(xiàn)免疫球蛋白的多樣性。在胚胎細胞中，V、J、(D)和C基因是分散排列的，在B細胞發(fā)育成熟過程中，基因組中組成免疫球蛋白分子的各個基因開始發(fā)生重排，V區(qū)基因發(fā)生y—J或y—D—J重排，與C基因連接，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生mRNA。隨機重排的結(jié)果可以產(chǎn)生108—10l0種免疫球蛋白分子。(三)免疫球蛋白基因的重排15免疫球蛋白基因的結(jié)構(gòu)免疫球蛋白(Ig)，由兩條輕鏈(L鏈)和兩條重鏈(H鏈)組成，分別由三個獨立的基因族編碼，其中兩個編碼輕鏈(和)，一個編碼重鏈。

輕鏈的基因片段：重鏈的基因片段：LVJCLVDJC16重鏈(IgH)基因的V-D-J重排和輕鏈(IgL)基因的V-J重排均發(fā)生在特異位點上。在V片段的下游，J片段的上游以及D片段的兩側(cè)均存在保守的重組信號序列(recombinationsignalsequence,RSS)。此重排的重組酶基因rag(recombinationactivatinggene)共有兩個，分別產(chǎn)生蛋白質(zhì)RAG1和RAG2。

CACAGTG(12/23)ACAAAAACCGTGTCCACTGTTTTTGG重組信號序列基因片段17免疫球蛋白基因重排過程18三、轉(zhuǎn)座重組由插入序列和轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的基因移位或重排稱為轉(zhuǎn)座(transposition)?？梢苿拥男蛄袉卧翰迦胄蛄?insertionsequences,IS)轉(zhuǎn)座子(transposons)19插入序列(insertionsequences,IS)組成：二個分離的反向重復(fù)(invertedrepeats,IR)序列特有的正向重復(fù)序列一個轉(zhuǎn)座酶（transposase)編碼基因

IRTransposaseGeneIR發(fā)生形式：保守性轉(zhuǎn)座(conservativetransposition)復(fù)制性轉(zhuǎn)座(duplicativetransposition)（一）插入序列轉(zhuǎn)座20插入位點兩端往往會出現(xiàn)重復(fù)序列Lehninger's.Principles.of.Biochemistry.4th21Lehninger's.Principles.of.Biochemistry.4th保守性轉(zhuǎn)座復(fù)制性轉(zhuǎn)座22轉(zhuǎn)座子(transposons)——可從一個染色體位點轉(zhuǎn)移到另一位點的分散重復(fù)序列。

轉(zhuǎn)座子組成：反向重復(fù)序列轉(zhuǎn)座酶編碼基因抗生素抗性等有用的基因IRIRTransposaseGene有用基因（二）轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座23“轉(zhuǎn)座子”先驅(qū)麥克林托克芭芭拉?麥克林托克81歲才獲得諾貝爾生理或醫(yī)學(xué)獎，成為遺傳學(xué)研究領(lǐng)域第一位獨立獲得諾貝爾獎的女科學(xué)家。

巴巴拉·麥克林托克（BarbaraMcClintock，1902-1992）

麥克林托克理論的影響是非常深遠的，她發(fā)現(xiàn)能跳動的控制因子，可以調(diào)控玉米籽粒顏色基因的活動，這是生物學(xué)史上首次提出的基因調(diào)控模型，對后來莫諾和雅可布等提出操縱子學(xué)說提供了啟發(fā)。24

細菌的可流動性元件A插入序列：轉(zhuǎn)座酶編碼基因兩側(cè)連接反向末端重復(fù)序列(箭頭所示)B轉(zhuǎn)座子Tn3：含有轉(zhuǎn)座酶、β-內(nèi)酰胺酶及阻遏蛋白編碼基因C轉(zhuǎn)座子Tn10：含四環(huán)素抗性基因及兩個相同的插入序列IS10L25由轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座26四、原核細胞：接合、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)（一）接合作用當(dāng)細胞與細胞、或細菌通過菌毛相互接觸時，質(zhì)粒DNA從一個細胞（細菌）轉(zhuǎn)移至另一細胞（細菌）的DNA轉(zhuǎn)移稱為接合作用(conjugation)。27可接合質(zhì)粒如F因子(Ffactor)質(zhì)?！毦旧w外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子28（二）轉(zhuǎn)化作用通過自動獲取或人為地供給外源DNA，使細胞或培養(yǎng)的受體細胞獲得新的遺傳表型，稱為轉(zhuǎn)化作用

(transformation)。

例：溶菌時，裂解的DNA片段被另一細菌攝取。2930（三）轉(zhuǎn)導(dǎo)作用當(dāng)病毒（噬菌體）從被感染的（供體）細胞釋放出來、再次感染另一（供體）細胞時，發(fā)生在供體細胞與受體細胞之間的DNA轉(zhuǎn)移及基因重組即為轉(zhuǎn)導(dǎo)作用(transduction)。31基因重組技術(shù)

DNARecombinationTechnique32基因工程誕生的理論基礎(chǔ)DNA是遺傳物質(zhì)肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實驗1944年Avery，確定了基因的分子載體是DNA，而不是蛋白質(zhì)噬菌體轉(zhuǎn)染實驗1952年AlfredHershy和MarshaChase進一步證明遺傳物質(zhì)是DNADNA雙螺旋結(jié)構(gòu)1953年JamesD.Watson和FrancisH.C.Crick揭示了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)和半保留復(fù)制機制33基因工程誕生的理論基礎(chǔ)中心法則和遺傳密碼1957年Crick又提出了遺傳信息傳遞的“中心法則”1964年MarshallNirenberg和GobindKhorana等終于破譯了64個遺傳密碼34基因工程誕生的技術(shù)突破限制性內(nèi)切酶（restrictionenzymes）1970年H.O.Smith等分離出第一種限制性核酸內(nèi)切酶。WernerArber理論預(yù)見限制酶DanielNathans用限制酶切得SV40DNA片斷HamiltonO.Smith得到第一個限制酶1978年Nobel生理或醫(yī)學(xué)獎35基因工程誕生的技術(shù)突破DNA連接酶（ligase）1967年5個實驗室?guī)缀跬瑫r發(fā)現(xiàn)了DNA連接酶。載體（vector）1972年前后使用小分子量的細菌質(zhì)粒和噬菌體作載體。在細菌細胞里的大量擴增。感受態(tài)體系1970年M.Mandel和A.Higa發(fā)現(xiàn)經(jīng)過氯化鈣處理的大腸桿菌容易吸收噬菌體DNA。1972年S.Cohen發(fā)現(xiàn)這種處理過的細菌同樣能吸收質(zhì)粒DNA。36基因工程誕生的技術(shù)突破瓊脂糖凝膠電泳1960s發(fā)明了瓊脂糖凝膠電泳，可將不同長度的DNA分離開DNA測序技術(shù)1975年F.Sanger、A.Maxam和W.Gilbert發(fā)明了DNA快速測序技術(shù)1980年Nobel化學(xué)獎37基因工程的誕生Berg的開創(chuàng)性實驗1972年斯坦福大學(xué)的PaulBerg小組完成了首次體外重組實驗：將SV40的DNA片斷與噬菌體的DNA片斷連接起來（用DNA末端轉(zhuǎn)移酶，而非限制性內(nèi)切酶）1980年Nobel化學(xué)獎38基因工程的誕生Boyer-Cohen實驗：第一次成功的基因克隆實驗1973年斯坦福大學(xué)的S.Cohen小組將含有卡那霉素抗性基因的大腸桿菌R6-5質(zhì)粒與含有四環(huán)素抗性基因的另一種大腸桿菌質(zhì)粒pSC101連接成重組質(zhì)粒，具有雙重抗藥性。后來又把非洲爪蟾核糖體基因片段同pSC101質(zhì)粒重組，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，并在菌體內(nèi)成功轉(zhuǎn)錄出相應(yīng)的mRNA。39發(fā)明重組DNA技術(shù)開創(chuàng)生物工程時代StanleyCohen1986Nobel生理或醫(yī)學(xué)獎(發(fā)現(xiàn)神經(jīng)生長因子和表皮生長因子)

HerbBoyer

40基因工程的主要操作內(nèi)容目的基因的獲取從復(fù)雜的生物基因組中，經(jīng)過酶切消化或PCR擴增等步驟，分離出帶有目的基因的DNA片斷重組體的制備將目的基因的DNA片斷插入到能自我復(fù)制并帶有選擇性標記（抗菌素抗性）的載體分子上重組體的轉(zhuǎn)化將重組體（載體）轉(zhuǎn)入適當(dāng)?shù)氖荏w細胞中克隆鑒定挑選轉(zhuǎn)化成功的細胞克?。ê心康幕颍┠康幕虮磉_使導(dǎo)入寄主細胞的目的基因表達出我們所需要的基因產(chǎn)物41本節(jié)主要內(nèi)容

相關(guān)概念DNA克隆工具酶目的基因基因載體基本原理關(guān)鍵步驟與過程42一、重組DNA技術(shù)相關(guān)概念克隆(clone)來自同一始祖的相同副本或拷貝的集合。獲取同一拷貝的過程稱為克隆化(cloning)，即無性繁殖。（一）DNA克隆技術(shù)水平：

分子克隆(molecularclone)，即DNA克隆細胞克隆個體克?。▌游锘蛑参铮?3重組DNA技術(shù)又稱：分子克?。╩olecularcloning）DNA克?。―NAcloning）基因工程（geneticengineering）目的：①分離獲得某一感興趣的基因或DNA②獲得感興趣基因的表達產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）主要過程包括篩選44（二）工具酶限制性核酸內(nèi)切酶

DNA聚合酶Ⅰ

逆轉(zhuǎn)錄酶

T4DNA連接酶堿性磷酸酶末端轉(zhuǎn)移酶

TaqDNA聚合酶45重組DNA技術(shù)中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸內(nèi)切酶識別特異序列，切割DNADNA連接酶催化DNA中相鄰的5′磷酸基和3′羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個DNA分子或片段連接DNA聚合酶Ⅰ合成雙鏈cDNA分子或片段連接缺口平移制作高比活探針DNA序列分析填補3′末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而無53外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA3末端標記等反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA替代DNA聚合酶I進行填補，標記或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5′羥基末端磷酸化，或標記探針末端轉(zhuǎn)移酶在3′羥基末端進行同質(zhì)多聚物加尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基46限制性核酸內(nèi)切酶是一類能夠識別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列（4—8bp），并由此處切割DNA雙鏈的核酸內(nèi)切酶來源：原核生物功能：自我保護——細菌的限制和修飾系統(tǒng)（R/M體系）47限制（Restriction）限制性內(nèi)切酶將侵入細菌體內(nèi)的外源DNA切成小片斷。48修飾（Modification）細菌自身的DNA堿基被甲基化酶甲基化修飾所保護，不能被自身的限制性內(nèi)切酶識別切割49限制性內(nèi)切酶的類型目前鑒定出三種不同類型的限制性內(nèi)切酶：I型限制性內(nèi)切酶II類限制性內(nèi)切酶III類限制性內(nèi)切酶50I型限制性內(nèi)切酶Recognizesitecut1-1.5kb切割位點不確定：在距離特異性識別位點約1000-1500bp處隨機切開一條單鏈。51II型限制性內(nèi)切酶識別位點序列：未甲基化修飾的雙鏈DNA上的特殊靶序列（多數(shù)是回文序列）。EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’PstI5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’

產(chǎn)生粘性末端EcoRV5’-GATATC-3’3’-CTATAG-5’

產(chǎn)生平齊末端5253II型限制性內(nèi)切酶是應(yīng)用最廣泛的內(nèi)切酶同裂酶（Isoschizomers)識別位點和切點完全相同HindIII5’-AAGCTT-3’3’-TTCGAA-5’HsuI5’-AAGCTT-3’3’-TTCGAA-5’XmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’

SmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’

識別位點相同，但切點不同54識別的序列不同，但能切出相同的粘性末端：如BamHI、BglⅡ、BclI、XhoⅡ等同尾酶(Isocaudamers）5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’

BamHIBclI5’-TGATCA-3’3’-ACTAGT-5’

5’-AGATCT-3’3’-TCTAGA-5’

BglⅡ5’-UGATCY-3’3’-YCTAGU-5’XhoⅡU代表嘌呤；Y代表嘧啶。55III類限制性內(nèi)切酶在完全肯定的位點切割DNA，但反應(yīng)需要ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。在基因工程操作中用途不大。EcoP1:AGACCEcoP15:CAGCAG56限制性內(nèi)切酶的命名1973年H.OSmith和D.Nathans提議的命名系統(tǒng)，命名原則如下：用屬名的第一個字母和種名的頭兩個字母組成3個字母的略語表示寄主菌的物種名。大腸桿菌（Escherichiacoli）用Eco表示；流感嗜血菌（Haemophilusinfluenzae）用Hin表示用一個右下標的大寫字母表示菌株或型。如Ecok,EcoR（現(xiàn)在都寫成平行，如EcoRI）。如果一種特殊的寄主菌內(nèi)有幾種不同的限制與修復(fù)系統(tǒng)，用羅馬字母表示。如EcoRI，EcoRV57第一個字母取自產(chǎn)生該酶的細菌屬名，用大寫；第二、第三個字母是該細菌的種名，用小寫；第四個字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。命名BamHI

屬

系

株序bacillusamyloguefaciensH株淀粉化芽孢桿菌H株的第一種酶Hin

dⅢ

屬

種

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血桿菌d株的第三種酶58影響限制性內(nèi)切酶活性的因素DNA的純度（DNA中的雜質(zhì)如蛋白質(zhì)、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA）DNA的甲基化程度（基因工程中必須使用甲基化酶失活突變的菌株）溫度（大多數(shù)是37℃，少數(shù)要求40-65℃）緩沖液(Buffer)（購買的都配）MgCl2、NaCl/KCl：提供Mg2+和離子強度；Tris-HCl：維持pH；二硫蘇糖醇（DTT）：保持酶穩(wěn)定性；牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的穩(wěn)定；59DNA連接酶從細菌DNA環(huán)化現(xiàn)象推測，必定存在一種能把兩條DNA雙鏈連接到一起的酶。DNA連接酶（ligase)的發(fā)現(xiàn)DNA復(fù)制滾環(huán)復(fù)制，D環(huán)復(fù)制，一定有斷口。60DNAligase的特點兩種DNA連接酶大腸桿菌連接酶只能連接粘性末端T4噬菌體的連接酶不但能連接粘性末端，還能連接平末端61連接反應(yīng)的機理AMP與連接酶的賴氨酸-氨基相連ATP與連接酶形成共價“連接酶-AMP”復(fù)合物，并釋放出焦磷酸PPiATP（NAD+)提供激活的AMPAMP隨后從連接酶的賴氨酸-氨基轉(zhuǎn)移到DNA一條鏈的5‘端P上，形成“DNA-腺苷酸”復(fù)合物3‘-OH對磷原子作親核攻擊，形成磷酸二脂鍵，釋放出AMP62DNA聚合酶基因工程中常用的DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶KlenowfragmentT7DNA聚合酶T4DNA聚合酶修飾過的T7DNA聚合酶逆轉(zhuǎn)錄酶63常用DNA聚合酶的特性比較DNA聚合酶3’5’外切酶活性5’3’外切酶活性聚合速率持續(xù)能力大腸桿菌DNA聚合酶低有中低Klenowfragment低無中低T4DNA聚合酶高無中低T7DNA聚合酶高無快高化學(xué)修飾T7DNA聚合酶低無快高遺傳修飾T7DNA聚合酶無無快高逆轉(zhuǎn)錄酶無無低中TaqDNA聚合酶無有快高64T4多核苷酸激酶來源T4噬菌體的pseT基因編碼。從T4感染大腸桿菌細胞中分離出來。多種哺乳動物細胞中也發(fā)現(xiàn)這種酶功能催化磷酸從ATP轉(zhuǎn)給雙鏈或單鏈DNA或RNA的5’-OH端。不論5’-OH端突出與否655’

3’

HO--OH5’

3’

HO--OH3’

P--OH5’

3’

HO--P5’

ATPT4多核苷酸激酶天然的DNA的5’端都是磷酸化的。（1）催化DNA的5’端磷酸化（用于連接反應(yīng)）多核苷酸激酶的用途66交換反應(yīng)標記法反應(yīng)混合物中具有超量(-32P)ATP和ADP時，多核苷酸激酶能催化(-32P)ATP的-32P與DNA5’端的磷酸交換。3’

P--OH5’

3’

HO--P5’

3’

32P--OH5’

3’

HO--32P5’

(-32P)ATP、ADP多核苷酸激酶反應(yīng)效果不理想。多核苷酸激酶的用途（2）同位素標記DNA的5’端。67多核苷酸激酶的用途（2）同位素標記DNA的5’端。5’

3’

HO--OH5’

3’

HO--OH3’

32P--OH5’

3’

HO--32P5’

(-32P)ATP多核苷酸激酶3’

P--OH5’

3’

HO--P5’

堿性磷酸酶正向反應(yīng)（forwardreaction）68堿性磷酸酶堿性磷酸酶種類細菌性堿性磷酸酶（從大腸桿菌中分離出來，Bacterialalkalinephosphatase，BAP）有抗熱性小牛腸堿性磷酸酶（從小牛腸中純化出來，Calfintestinalalkalinephosphatase，CIP）SDS中加熱68℃可完全失活69催化脫掉DNA（或RNA）5’端的磷酸根。3’

P--OH5’

3’

HO--P5’

5’

3’

HO--OH5’

3’

HO--OH堿性磷酸酶防止線性化的載體份子自我連接堿性磷酸酶的特性堿性磷酸酶的功能：70單一酶切口的載體的粘性末端容易自我連接AAGCTTTTCGAAHindⅢ酶切A-OHTTCGA-PP-AGCTTHO-A堿性磷酸酶5’

5’

5’

71A-OHTTCGA-OHHO-AGCTTHO-AOH與OH不能形成磷酸二酯鍵，所以不能自我連接。但同一酶切后的外源DNA的5’端有P，能與脫磷酸的載體OH連接。72ATTCGA

AGCTTAAGCTTA

ATTCGA

連接酶-OH與-OH連不住其中每條鏈上都有一個nick，但轉(zhuǎn)入細菌后會被修復(fù)。3’

P-AGCTTA-OH5’

3’

HO-ATTCGA-P5’

外源DNA73（三）基因載體定義為攜帶目的基因，實現(xiàn)其無性繁殖或表達有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子。常用載體質(zhì)粒DNA噬菌體DNA病毒DNA74克隆載體(cloningvector)為使插入的外源DNA序列被擴增而特意設(shè)計的載體稱為克隆載體。表達載體(expressionvector)為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽鏈而特意設(shè)計的載體稱為表達載體。75載體的應(yīng)具備的特征：能自主復(fù)制，有復(fù)制起點；具有1個以上的遺傳標記物，便于重組體的篩選和鑒定；有克隆位點（外源DNA插入點），常具有多個單一酶切位點，稱為多克隆位點；分子量小，以容納較大的外源DNA。761.質(zhì)粒

(plasmid)特點

能在宿主細胞內(nèi)獨立自主復(fù)制；帶有某些遺傳信息,會賦予宿主細胞一些遺傳性狀。7778λ噬菌體DNA改造系統(tǒng)λgt系列（插入型，適用cDNA克?。〦MBL系列（置換型，適用基因組克?。?.噬菌體(phage)M13噬菌體DNA改造系統(tǒng)（含lacZ基因）M13mp系列pUC系列7980813.粘性質(zhì)粒(cosmid)82酵母人工染色體

(yeastartificialchromosome,YAC)細菌人工染色體

(bacterialartificialchromosome,BAC)動物病毒DNA改造的載體（如腺病毒，腺病毒相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒）其他83（二）表達載體表達載體是指用來在宿主細胞中表達外源基因的載體。根據(jù)宿主細胞分為：原核表達載體真核表達載體841.原核表達載體

原核表達載體的基本組成

R：調(diào)節(jié)序列；P：啟動子；SD：SD序列；TT：轉(zhuǎn)錄終止序列852.真核表達載體

酵母表達載體、昆蟲表達載體、哺乳動物細胞表達載體

OriPro：原核復(fù)制起始序列；P：啟動子；MCS：多克隆位點；

TT：轉(zhuǎn)錄終止序列；orieuk：真核復(fù)制起始序列。86二、重組DNA技術(shù)基本原理目的基因的獲取DNA導(dǎo)入受體菌外源基因與載體的連接克隆載體的選擇和構(gòu)建重組體的篩選克隆基因的表達

分選接轉(zhuǎn)篩表達87目的來源獲取的方法蛋白表達cDNA(complementaryDNA)PCR內(nèi)切酶基因序列、結(jié)構(gòu)研究基因組DNA(genomicDNA)生物樣本DNAmiRNA,siRNA化學(xué)合成分——目的基因的獲取88基因組文庫或cDNA文庫基因片斷（目的基因）新的表達載體或克隆載體重組DNA分子含重組分子的轉(zhuǎn)化菌或真核細胞限制性內(nèi)切酶雙酶切受體菌或真核宿主細胞從基因組DNA文庫獲取目的基因89選——載體的選擇與構(gòu)建載體插入DNA片段宿主細胞質(zhì)粒<5~10kb細菌，酵母λ噬菌體載體~20kb細菌黏粒~50kb細菌BAC~400kb細菌YAC~3Mb酵母多種克隆載體90接——目的DNA與載體連接粘末端連接單一相同黏端連接不同黏端連接通過其他措施產(chǎn)生黏端進行連接人工接頭(linker)連接同聚物加尾連接平端連接粘-平末端連接91BamHⅠ切割反應(yīng)

GGATCCCCTAGGT4

DNA連接酶15oCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割載體DNA用BamHⅠ切割重組體載體自連目的基因自連同一限制酶切位點連接92不同限制酶切位點（非配伍末端）的連接EcoRⅠ切割位點Bg

lⅡ切割位點+EcoRⅠ+Bg

lⅡ雙酶切EcoRⅠ+Bg

lⅡ雙酶切T4

DNA連接酶15oC重組體配伍末端的連接情況和同一限制酶切位點連接相似。932.平端連接適用于：限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端粘端補齊或切平形成的平端目的基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4DNA連接酶15oC重組體載體自連目的基因自連94T-A克隆目的片段：由PCR獲得。Taq聚合酶擴增產(chǎn)物在3’-端多加1-2個AT載體：3’-端突出1個T目的片段與載體：形成類似粘性末端的T-A配對95在末端轉(zhuǎn)移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進行粘端連接。

同聚物加尾連接5′3′3′5′載體DNA5′3′3′5′目的基因限制酶或機械剪切限制酶5′3′3′5′5′3′T(T)nT

T(T)nT3′5′5′

3′3′5′3′A(A)nA

A(A)nA3′5′λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端轉(zhuǎn)移酶+dATP末端轉(zhuǎn)移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA連接酶15oC重組體5′96由平端加上新的酶切位點，再用限制酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進行粘端連接。酶法PCR法

人工接頭(linker)連接通過其他措施產(chǎn)生黏端進行連接EcoRⅠEcoRⅠ97受體菌條件安全宿主菌限制酶和重組酶缺陷處于感受態(tài)(competent)

導(dǎo)入方式轉(zhuǎn)化(transformation)——細菌轉(zhuǎn)染(transfection)——真核細胞感染(infection)——真核細胞（四）重組DNA導(dǎo)入受體菌98遺傳物質(zhì)傳遞常見的幾個名詞的區(qū)別類型受體細胞遺傳物質(zhì)（DNA）攜帶或交換方式結(jié)合細菌菌毛相連轉(zhuǎn)化細菌外源DNA直接進入細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)細菌真核細胞由噬菌體攜帶遺傳物質(zhì)由病毒攜帶遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)染真核細胞磷酸鈣或脂質(zhì)體包裹外源DNA99（五）重組體克隆的篩選和鑒定100（五）重組體的篩選

1.直接選擇法(1)抗藥性標記選擇(2)標志補救(markerrescue)(3)分子雜交法原位雜交Southern印跡

2.免疫學(xué)方法如免疫化學(xué)方法及酶免檢測分析等101一、載體表型選擇法1、抗藥性標記及其插入失活選擇法原理：pBR322質(zhì)粒上有兩個抗菌素抗性基因:四環(huán)素Tetr和氨卞AmprTetr上有插入位點BamHI和SalI;Ampr上有插入位點PstI102pBR322103pBR322抗菌素標記選擇四環(huán)素：

抑制細菌生長，但不殺死細菌氨芐青霉素抗性基因：產(chǎn)生-內(nèi)酰胺酶，使氨芐青霉素轉(zhuǎn)變?yōu)榍嗝雇?，使?青霉素指示液（I2-KI-Aampicillin）（藍灰色）褪色環(huán)絲氨酸:殺死生長的細菌，但不殺死停止生長的細菌104選擇過程：四環(huán)素抗性插入失活如果在Tetr上插入外源DNA，導(dǎo)致四環(huán)素抗性基因失活，可用四環(huán)素加環(huán)絲氨酸平板培養(yǎng)基選擇重組克隆。Tetr失活的菌生長被四環(huán)素抑制，不被環(huán)絲氨酸殺死，保留下來；Tetr不失活的菌抗四環(huán)素，能分裂生長，反而被環(huán)絲氨酸殺死環(huán)絲氨酸作用機制是抑制細菌細胞壁粘肽的合成，從而使細胞壁缺損。105無環(huán)絲氨酸培養(yǎng)基106氨芐青霉素抗性插入失活選擇過程如果Ampr上插入外源DNA，導(dǎo)致氨芐青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素指示液選擇。107-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)選擇法原理：

載體上有一段-半乳糖苷酶基因（LacZ）的片段（氨基端），其上有外源DNA的插入位點。受體菌基因組中有突變的-半乳糖苷酶基因（片段缺失）?？梢员籌PTG誘導(dǎo)表達。載體和受體菌基因組可以互補形成完整有功能的-半乳糖苷酶（互補）。-半乳糖苷酶乳糖半乳糖葡萄糖Xgal半乳糖5-溴-4-氯靛藍++深藍色108選擇過程假陰性：如果插入的外源DNA正好是3的倍數(shù)并且沒有中止密碼；（不破壞肽）。109-半乳糖苷酶使Xgal分解成藍色產(chǎn)物110根據(jù)插入基因的表型選擇利用插入的外源基因的表達產(chǎn)物特性進行直接選擇。（只在特定條件下）原理：彌補缺陷轉(zhuǎn)化進來的外源基因產(chǎn)物能夠彌補受體菌株的突變型缺陷his-受體菌：外源基因：在不含組氨酸的培養(yǎng)基中生長his+111酶切電泳篩選法ABA或B112不同克隆的酶切結(jié)果113PCR擴增檢測法原理PCR能在模板序列上擴增出預(yù)期DNA片斷。過程（1）從重組克隆中提取質(zhì)粒（或DNA）。（2）用外源DNA插入片斷引物作PCR。（3）電泳PCR產(chǎn)物。（4）檢查是否有PCR產(chǎn)物。（5）PCR產(chǎn)物的長度是否與外源基因一致114核酸雜交檢測法原理：核酸雜交：重組克隆與探針雜交。識別標記放射性同位素：32P檢測用的探針與外源DNA插入片斷互補的序列。非放射性標記：熒光素115核酸雜交檢測方法：

Southernblotting用DNA（或RNA）探針檢測DNA樣品。從宿主細胞中提取DNA（或質(zhì)粒載體），再用探針雜交。只有帶有插入片斷的重組載體才能與探針雜交，在底片上曝光顯示酶切前酶切后插入片斷載體116重組DNA技術(shù)操作過程可形象歸納為小結(jié)分分離目的基因選選擇合適的載體接拼接重組體轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入受體菌篩篩選重組體