堿裂解法原理染色體DNA比質(zhì)粒DNA分子大得多

堿裂解法原理染色體DNA比質(zhì)粒DNA分子大得多第一頁(yè)，共76頁(yè)。一、核酸的分類DNA(脫氧核糖核酸)

主要存在于細(xì)胞核的染色體中。核外也有少量DNA，如線粒體DNA（mtDNA），葉綠體DNA（cpDNA），質(zhì)粒DNA。RNA（核糖核酸）

存在于細(xì)胞質(zhì)中，如mRNA,rRNA,tRNA等。除上述DNA，RNA外，還有非細(xì)胞形式存在的病毒和噬菌體，其或只含DNA，或只含有RNA。第二頁(yè)，共76頁(yè)。二、DNA提取的幾種方法(一）非基因組DNA的提取

質(zhì)粒DNA的提取堿裂解法煮沸法

線粒體、葉綠體DNA的提取差速離心結(jié)合SDS裂解法第三頁(yè)，共76頁(yè)。質(zhì)粒DNA－堿裂解法

堿裂解法原理染色體DNA比質(zhì)粒DNA分子大得多，且染色體DNA為線狀分子，而質(zhì)粒DNA為共價(jià)閉合環(huán)狀分子；當(dāng)用堿處理DNA溶液時(shí)，線狀染色體DNA容易發(fā)生變性，共價(jià)閉環(huán)的質(zhì)粒DNA在回到中性pH時(shí)即恢復(fù)其天然構(gòu)象；變性染色體DNA片段與變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片結(jié)合形成沉淀，而復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒DNA分子則以溶解狀態(tài)存在液相中，從而可通過(guò)離心將兩者分開(kāi)。第四頁(yè)，共76頁(yè)。質(zhì)粒DNA－堿裂解法

堿裂解法流程圖對(duì)數(shù)期菌體溶液III中和溶液I充分重懸溶液II裂解上清液抽提離心洗滌酒精沉淀干燥溶解沉淀質(zhì)粒DNA溶液第五頁(yè)，共76頁(yè)。質(zhì)粒DNA－煮沸法

煮沸法原理染色體DNA比質(zhì)粒DNA分子大得多，且染色體DNA為線狀分子，而質(zhì)粒DNA為共價(jià)閉合環(huán)狀分子；當(dāng)加熱處理DNA溶液時(shí)，線狀染色體DNA容易發(fā)生變性，共價(jià)閉環(huán)的質(zhì)粒DNA在冷卻時(shí)即恢復(fù)其天然構(gòu)象；變性染色體DNA片段與變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片結(jié)合形成沉淀，而復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒DNA分子則以溶解狀態(tài)存在液相中，從而可通過(guò)離心將兩者分開(kāi)。第六頁(yè)，共76頁(yè)。細(xì)胞器DNA－差速離心法差速離心法原理是利用物質(zhì)比重的不同分離混合物的一種方法。將待分離物質(zhì)置于均勻介質(zhì)（蔗糖）中，以一定的轉(zhuǎn)速進(jìn)行離心，比重大的物質(zhì)優(yōu)先沉降，比重小的卻處于上層，從而得以分離。線粒體和葉綠體是生物體內(nèi)半自主性細(xì)胞器，自身可編碼蛋白，它們的比重和大小一定，因而在同一離心場(chǎng)內(nèi)的沉降速度也一定，根據(jù)這一原理，常用不同轉(zhuǎn)速的離心法，將細(xì)胞內(nèi)各種組分分級(jí)分離出來(lái)。第七頁(yè)，共76頁(yè)。（二）基因組DNA的提?。瑿TAB法

CTAB法原理CTAB（hexadecyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化銨），是一種陽(yáng)離子去污劑，可溶解細(xì)胞膜，并與核酸形成復(fù)合物。該復(fù)合物在高鹽溶液中（>0.7mol/LNaCl）是可溶的，通過(guò)有機(jī)溶劑抽提，去除蛋白、多糖、酚類等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來(lái)。注：CTAB溶液在低于15℃時(shí)會(huì)形成沉淀析出，因此在將其加入冰冷的植物材料之前必須預(yù)熱，且離心時(shí)溫度不要低于15℃。第八頁(yè)，共76頁(yè)。

CTAB提取緩沖液的經(jīng)典配方組份Tris-HCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）NaClCTABβ-巰基乙醇終濃度100mM20mM1.4M2%(W/V)0.1%（V/V）使用前加入Tris-HCl（pH8.0）提供一個(gè)緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞；EDTA螯合Mg2+或Mn2+離子，抑制DNase活性；NaCl提供一個(gè)高鹽環(huán)境，使DNP充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解細(xì)胞膜，并結(jié)合核酸，使核酸便于分離；β-巰基乙醇是抗氧化劑，有效地防止酚氧化成醌，避免褐變，使酚容易去除（二）基因組DNA的提?。瑿TAB法第九頁(yè)，共76頁(yè)。

CTAB提取緩沖液的改進(jìn)配方組份Tris-HCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）NaClCTABPVP40β-巰基乙醇終濃度100mM20mM1.4M3%(W/V)5%(W/V)2%（V/V）使用前加入PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的絡(luò)合物，能與多酚形成一種不溶的絡(luò)合物質(zhì)，有效去除多酚，減少DNA中酚的污染；同時(shí)它也能和多糖結(jié)合，有效去除多糖。（二）基因組DNA的提?。瑿TAB法第十頁(yè)，共76頁(yè)。

CTAB法流程圖植物材料裂解液上層溶液液氮研磨抽提細(xì)胞裂解干燥溶解離心洗滌酒精沉淀DNA溶液（二）基因組DNA提?。瑿TAB法第十一頁(yè)，共76頁(yè)。SDS法原理（二）基因組DNA的提?。璖DS法SDS是一種陰離子去垢劑，在高溫（55～65℃）條件下能裂解細(xì)胞，使染色體離析，蛋白變性，釋放出核酸；提高鹽(KAc或NH4Ac)濃度并降低溫度（冰?。?，使蛋白質(zhì)及多糖雜質(zhì)沉淀，離心后除去沉淀；上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反復(fù)抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。組份Tris-HCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）NaClSDS終濃度10mM20mM0.4M2%

SDS法DNA提取緩沖液第十二頁(yè)，共76頁(yè)。

SDS法流程圖（以動(dòng)物組織為例）動(dòng)物組織細(xì)胞裂解上層溶液組織勻漿抽提干燥溶解離心洗滌酒精沉淀DNA溶液（二）基因組DNA的提取－SDS法第十三頁(yè)，共76頁(yè)。（三）基因組DNA－其它方法

物理方式：玻璃珠法、超聲波法、研磨法、凍融法化學(xué)方式：異硫氰酸胍法、堿裂解法生物方式：酶法

根據(jù)細(xì)胞裂解方式的不同有：第十四頁(yè)，共76頁(yè)。（三）基因組DNA－其它方法

吸附材料結(jié)合法：

根據(jù)核酸分離純化方式的不同有：硅質(zhì)材料

陰離子交換樹(shù)脂磁珠

高鹽低pH值結(jié)合核酸，低鹽高pH值洗脫?？旖莞咝?。低鹽高pH值結(jié)合核酸，高鹽低pH值洗脫。適用于純度要求高的實(shí)驗(yàn)。磁性微粒掛上不同基團(tuán)可吸附不同的目的物，從而達(dá)到分離目的。第十五頁(yè)，共76頁(yè)。（三）基因組DNA－其它方法濃鹽法：

有機(jī)溶劑抽提法：

密度梯度離心法：

利用RNP和DNP在鹽溶液中溶解度不同，將二者分離有機(jī)溶劑作為蛋白變性劑，同時(shí)抑制核酸酶的降解作用利用不同內(nèi)容物密度不同的原理分離各種內(nèi)容物第十六頁(yè)，共76頁(yè)。（四）動(dòng)物基因組DNA的提取

主要方法：(1)濃鹽法利用RNP和DNP在電解溶液中溶解度不同，將二者分離。1）用1M氯化鈉提取,得到的DNP粘液2)與含有少量異戊醇的氯仿一起搖蕩,使乳化3)離心除去蛋白質(zhì),此時(shí)蛋白質(zhì)凝膠停留在水相及氯仿相中間，而DNA位于上層水相中4)用2倍體積95%乙醇可將DNA鈉鹽沉淀出來(lái).第十七頁(yè)，共76頁(yè)。用SDS或二甲苯酸鈉等去污劑使蛋白質(zhì)變性,可以直接從生物材料中提取DNA。由于細(xì)胞中DNA與蛋白質(zhì)之間常借靜電引力或配位鍵結(jié)合,而陰離子去污劑能夠破壞這種價(jià)鍵,所以常用陰離子去污劑提取DNA。（2）陰離子去污劑法:第十八頁(yè)，共76頁(yè)。（3）苯酚抽提法:苯酚作為蛋白變性劑,同時(shí)抑制了DNase的降解作用。用苯酚處理勻漿液時(shí),由于蛋白與DNA連接鍵已斷,蛋白分子表面又含有很多極性基團(tuán)與苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。離心分層后取出水層，多次重復(fù)操作，再合并含DNA的水相。利用核酸不溶于醇的性質(zhì)，用乙醇沉淀DNA。此法的特點(diǎn)是使提取的DNA保持天然狀態(tài)。第十九頁(yè)，共76頁(yè)。1.材料、設(shè)備及試劑材料：冷凍或新鮮抗凝全血，組織樣品設(shè)備：EP管、微量取液器(20μl,200μl,1000μl)，臺(tái)式高速離心機(jī)，渦旋振蕩器試劑：裂解液ligsisbuffer（40mMTris-醋酸，20mM醋酸鈉,1mMEDTA,1%SDS,pH8.0）、Tris-飽和酚、氯仿、異戊醇、NaAc、RNA酶、無(wú)水乙醇、滅菌水第二十頁(yè)，共76頁(yè)。1）在500μl抗凝血中加入ligsisbuffer1000μl，充分顛混至清亮。以4000rpm，離心5min。棄上清液。2）沉淀中加入ligsisbuffer1500μl，充分勻漿。以6000rpm，離心5min

。3）徹底棄去上清，加入extractionbuffer500μl（裂解細(xì)胞），混勻置于37℃，水溶1h

。4）加入8μl的蛋白酶K，顛混，37℃過(guò)夜（或55℃，3h，但是37℃效果要好些）。

5）每管加入450μl飽和酚（取溶液下層）緩慢搖晃10min，以5500rpm，離心15min。2.操作步驟（血樣）第二十一頁(yè)，共76頁(yè)。6）取上清，每管加入250μl飽和酚和250μl氯仿－異戊醇（24：1），搖勻10min，以5500rpm，離心15min。

7）取上清，每管加入500μl氯仿－異戊醇，搖勻10min，以5500rpm，離心15min。

8）取上清，每管加50μl的3M的NaAC＋，適量無(wú)水乙醇（預(yù)冷）至滿，搖勻放入-20℃保存2h以上。9）以12000rpm，離心20min。去上清，加入70％乙醇500μl，以12000rpm，離心5min，去上清，50－60℃干燥。10）加入50μl滅菌去離子水，轉(zhuǎn)彈，混勻。第二十二頁(yè)，共76頁(yè)。核酸的理化性質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)通常與蛋白質(zhì)結(jié)合，以復(fù)合物形式存在三、核酸制備的一般原則微溶于水，不溶于乙醇，氯仿等有機(jī)溶劑在酸性溶液中容易降解，在中性或弱堿性溶液中較穩(wěn)定。DNA溶液粘度很大，RNA的粘度較小在強(qiáng)大離心力的作用下，可以從溶液中沉降下來(lái)第二十三頁(yè)，共76頁(yè)。分離純化核酸總的原則：核酸純化應(yīng)達(dá)到的要求：①核酸樣品中不應(yīng)存在對(duì)酶有抑制作用的有機(jī)溶劑

和過(guò)高濃度的金屬離子；②其它生物大分子的污染應(yīng)降低到最低程度；③排除其它核酸分子的污染。①應(yīng)保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性；②排除其它分子(蛋白，脂類，多糖類)的污染。第二十四頁(yè)，共76頁(yè)。核酸制備時(shí)應(yīng)注意的事項(xiàng):

①盡量簡(jiǎn)化操作步驟，縮短提取過(guò)程。②減少化學(xué)因素對(duì)核酸的降解。③減少物理因素對(duì)核酸的降解：機(jī)械剪切力和高溫④防止核酸的生物降解：排除核酸酶。

第二十五頁(yè)，共76頁(yè)。降低溫度，改變pH及鹽的濃度，都利于對(duì)核酸酶活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制劑更有利，當(dāng)然，幾個(gè)條件并用更好。對(duì)于DNA，抑制DNase活力很容易，但防止機(jī)械張力拉斷則更重要。對(duì)于RNA，因分子較小，不易被機(jī)械張力拉斷，但抑制RNase活力較難，故在RNA提取中設(shè)法抑制RNase更重要。核酸酶的抑制和抑制劑

第二十六頁(yè)，共76頁(yè)。①加入少量金屬離子螯合劑，如0.01mol/LEDTA或檸檬酸鈉，DNase基本可以全部失活。

②去垢劑、蛋白變性劑及DNase抑制劑也可使DNase失活。DNase抑制第二十七頁(yè)，共76頁(yè)。①操作要帶手套。②所有器皿要嚴(yán)格消毒，③試劑處理④低溫操作⑤在分離過(guò)程中要加入一定的RNase抑制劑。

RNase抑制第二十八頁(yè)，共76頁(yè)。

常用的RNA酶抑制劑

焦磷酸二乙酯（DEPC）抑制強(qiáng)烈、不徹底

異硫氰酸胍有效抑制、分解核蛋白氧釩核糖核苷復(fù)合物有效抑制RNA酶的蛋白抑制劑（RNasin）有效抑制其它：SDS、尿素、硅藻土等有效抑制上述大部分試劑有致癌之嫌，應(yīng)謹(jǐn)慎操作！第二十九頁(yè)，共76頁(yè)。核酸本身帶負(fù)電荷，結(jié)合帶正電荷的蛋白質(zhì)。用于核酸提取的去垢劑，一般都是陰離子去垢劑。

去垢劑的作用：1、溶解膜蛋白及脂肪，使細(xì)胞膜破裂；2．溶解核糖體上面的蛋白質(zhì)，使其解聚，將核酸釋放出來(lái)；3．對(duì)RNase、DNase有一定的抑制作用。如：SDS、脫氧膽酸鈉、4-氨基水楊酸鈉、萘-1.5-二磺酸鈉、三異丙基萘磺酸鈉核酸制備中常用的去垢劑第三十頁(yè)，共76頁(yè)。作用：1.使蛋白質(zhì)變性、沉淀，從核酸提取液中分離除去，以防造成蛋白污染。2.使蛋白質(zhì)變性，故可使核糖體解聚釋放出核酸。3.某些蛋白質(zhì)變性劑也有抑制RNase活性和破裂細(xì)胞的作用

如：苯酚、氯仿、鹽酸胍、DEPC核酸制備中常用的蛋白質(zhì)變性劑第三十一頁(yè)，共76頁(yè)。DNase:降解DNA

RNase：降解RNA蛋白酶K：降解蛋白質(zhì)溶菌酶：破碎細(xì)胞

核酸制備中常用的酶第三十二頁(yè)，共76頁(yè)。四、核酸制備的一般步驟：破碎組織細(xì)胞提取純化I.材料準(zhǔn)備II.破碎細(xì)胞或包膜－內(nèi)容物釋放III.核酸分離、純化IV.沉淀或吸附核酸，并去除雜質(zhì)

V.核酸溶解在適量緩沖液或水中第三十三頁(yè)，共76頁(yè)。1、材料準(zhǔn)備最好使用新鮮材料，低溫保存的樣品材料不要反復(fù)凍融提取血液基因組DNA時(shí)，要選擇有核細(xì)胞（白細(xì)胞）組培細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)，否則會(huì)造成DNA降解含病毒的液體材料DNA含量較少，提取前先富集基因組DNA的提取質(zhì)粒DNA的提取使用處于對(duì)數(shù)期的新鮮菌體（老化菌體導(dǎo)致開(kāi)環(huán)質(zhì)粒增加）培養(yǎng)時(shí)應(yīng)加入篩選壓力，否則菌體易污染，質(zhì)粒易丟失盡量選擇高拷貝的質(zhì)粒，如為低拷貝或大質(zhì)粒，則應(yīng)加大菌體用量菌株不要頻繁轉(zhuǎn)接（質(zhì)粒丟失）第三十四頁(yè)，共76頁(yè)。

微生物：溶菌酶、SDS裂解。

高等植物：搗碎器破碎、液氮研磨。

酶法：蛋白酶，如胰蛋白酶，冰凍法：反復(fù)凍融或液氮凍后組織搗碎。

動(dòng)物：液氮處理后用勻漿器或者研缽破碎。

細(xì)胞器DNA：首先純化細(xì)胞器。以上處理時(shí)均要同時(shí)加入核酸酶抑制劑2）破碎細(xì)胞（防止核酸酶的作用）第三十五頁(yè)，共76頁(yè)。首先使脫氧核糖核蛋白、核糖體、病毒的核蛋白與其它成分分離使核酸與蛋白質(zhì)分離除去脂類多糖的除去3）破碎抽提核酸除去雜質(zhì)第三十六頁(yè)，共76頁(yè)。根據(jù)所需核酸的性質(zhì)和特點(diǎn)除去其它核酸污染,并除去提取過(guò)程中的系列試劑(鹽、有機(jī)溶劑等）雜質(zhì)，最后得到均一的核酸樣品。

4）核酸的純化第三十七頁(yè)，共76頁(yè)。核酸保存的主要條件是溫度和介質(zhì)

溫度：

4℃樣品經(jīng)常使用-70℃是長(zhǎng)期保存的良好溫度，為一次性保存-20℃保存,避免反復(fù)凍融保存介質(zhì)：

滅菌水

TE緩沖溶液(最常用)：

10mmol/LTris-ClpH8.01mmol/LEDTApH8.05）核酸樣品的保存第三十八頁(yè)，共76頁(yè)。6）注意事項(xiàng)——材料準(zhǔn)備最好使用新鮮材料，低溫保存的樣品材料不要反復(fù)凍融提取血液基因組DNA時(shí)，要選擇有核細(xì)胞（白細(xì)胞）細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)，否則會(huì)造成DNA降解含病毒的液體材料DNA含量較少，提取前先富集第三十九頁(yè)，共76頁(yè)。6）注意事項(xiàng)——細(xì)胞裂解材料應(yīng)適量，過(guò)多會(huì)影響裂解，導(dǎo)致DNA量少，純度低針對(duì)不同材料，選擇適當(dāng)?shù)牧呀忸A(yù)處理方式：植物材料－－液氮研磨動(dòng)物組織－－勻漿或液氮研磨組培細(xì)胞－－蛋白酶K細(xì)菌－－溶菌酶破壁高溫溫浴時(shí)，定時(shí)輕柔振蕩第四十頁(yè)，共76頁(yè)。6）注意事項(xiàng)——核酸分離、純化采用吸附材料吸附的方式分離DNA時(shí)，應(yīng)提供相應(yīng)的緩沖體系采用有機(jī)（酚/氯仿）抽提時(shí)應(yīng)充分混勻，但動(dòng)作要輕柔離心分離兩相時(shí)，應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時(shí)間針對(duì)不同材料的特點(diǎn)，在提取過(guò)程中輔以相應(yīng)的去雜質(zhì)的方法第四十一頁(yè)，共76頁(yè)。6）注意事項(xiàng)——核酸沉淀、溶解當(dāng)沉淀時(shí)間有限時(shí)，用預(yù)冷的乙醇或異丙醇沉淀，沉淀會(huì)更充分沉淀時(shí)加入1/10體積的NaAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀沉淀后應(yīng)用70％的乙醇洗滌，以除去鹽離子等晾干DNA，讓乙醇充分揮發(fā)（不要過(guò)分干燥）若長(zhǎng)期儲(chǔ)存建議使用TE緩沖液溶解TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+離子，抑制DNasepH值為8.0，可防止DNA發(fā)生酸解

第四十二頁(yè)，共76頁(yè)。DNA中含有蛋白、多糖、多酚類雜質(zhì)DNA在溶解前，有酒精殘留，酒精抑制后續(xù)酶解反應(yīng)DNA中殘留有金屬離子重新純化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等雜質(zhì)重新沉淀DNA，讓酒精充分揮發(fā)增加70％乙醇洗滌的次數(shù)（2-3次）五、.DNA提取常見(jiàn)問(wèn)題問(wèn)題一：DNA樣品不純，抑制后續(xù)酶解和PCR反應(yīng)。

原因?qū)Σ叩谒氖?yè)，共76頁(yè)。材料不新鮮或反復(fù)凍融未很好抑制內(nèi)源核酸酶的活性提取過(guò)程操作過(guò)于劇烈，DNA被機(jī)械打斷外源核酸酶污染DNA樣品反復(fù)凍融盡量取新鮮材料，低溫保存材料避免反復(fù)凍融液氮研磨或勻漿組織后，應(yīng)在解凍前加入裂解緩沖液在提取內(nèi)源核酸酶含量豐富的材料的DNA時(shí)，可增加裂解液中螯合劑的含量細(xì)胞裂解后的后續(xù)操作應(yīng)盡量輕柔所有試劑用無(wú)菌水配制，耗材經(jīng)高溫滅菌將DNA分裝保存于緩沖液中，避免反復(fù)凍融問(wèn)題二：DNA降解對(duì)策

原因第四十四頁(yè)，共76頁(yè)。實(shí)驗(yàn)材料不佳或量少破壁或裂解不充分沉淀不完全洗滌時(shí)DNA丟失盡量選用新鮮（幼嫩）的材料動(dòng)植物要?jiǎng)驖{研磨充分；細(xì)菌、酵母裂解前先用生物酶或機(jī)械方式破壁高溫裂解時(shí)，時(shí)間適當(dāng)延長(zhǎng)（對(duì)于動(dòng)物細(xì)胞、細(xì)菌可增加PK的用量）低溫沉淀，延長(zhǎng)沉淀時(shí)間加輔助物，促進(jìn)沉淀洗滌時(shí)，最好用槍頭將洗滌液吸出，勿傾倒問(wèn)題三：DNA提取量少對(duì)策

原因第四十五頁(yè)，共76頁(yè)。（一）．材料：組織或者細(xì)胞（二）.方法：TRIzol法，試劑盒六.動(dòng)物基因組總RNA的提取第四十六頁(yè)，共76頁(yè)。1、總RNA提取試劑盒亞硫氫胍，巰基乙醇，n-月桂肌氨酸：變性細(xì)胞內(nèi)及核蛋白復(fù)合物，釋放RNA；有效抑制核酸酶。苯酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）（pH4.7）：酸平衡苯仿可抽提去除雜物。DNA及蛋白沉淀到有機(jī)相，RNA留在水相。酸性有機(jī)溶劑的抽提可免除用氯化鋰選擇沉淀RNA。用鋰沉淀導(dǎo)致小于5.8sRNA的丟失，并不利于下游操作。乙酸鈉（pH4.0）：維持變性的細(xì)胞裂解液的pH值，及沉淀RNA。第四十七頁(yè)，共76頁(yè)。1．TRIzol試劑2．氯仿3．異丙醇4．75%乙醇（DEPC水配制）5．DEPC水2、TRIzol法提取RNA試劑準(zhǔn)備:第四十八頁(yè)，共76頁(yè)。（三）操作步驟1、TRIzol法（組織）戴一次性手套將組織樣品從液氮中取出，用干滅過(guò)的剪刀將樣品外包裹用紗布及表層的肉樣剪掉，然后放入干滅過(guò)的研缽中，往研缽中倒入液氮，快速研磨成細(xì)末狀；用1ml一次性塑料吸頭挑取細(xì)末裝入滅過(guò)菌的7mL一次性塑料離心管中用電子天平進(jìn)行稱量，每管中稱取0.2g肉樣；往管中加入2mLTRIZOL，用力振蕩后于15-30C溫育5min以裂解細(xì)胞，再加入0.4mL三氯甲烷并劇烈振蕩15s后于15-30C溫育3min；第四十九頁(yè)，共76頁(yè)。將離心管置于冷凍離心機(jī)2-4C10000rpm/min離心15min，小心吸取上清轉(zhuǎn)入另一離心管中，加入等體積異丙醇，混勻后于15-30C溫育15min以沉淀總RNA；將離心管置于冷凍離心機(jī)2-8C10000rpm/min離心15min，棄上清；加入2mL用冰預(yù)冷的75%乙醇漂洗，2-8C7000rpm/min離心5min，棄上清，于室溫干燥10min；加入適量DEPC處理水并于55-60C水浴溫育10

min以溶解總RNA，取適量用于DU640核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定濃度。余下總RNA樣品的水溶液須保存在-80C。

第五十頁(yè)，共76頁(yè)。2、TRIzol法（細(xì)胞）將1mlTrizol加入1-5×105細(xì)胞（6孔板）中，室溫放置3min。

將全部溶液轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中，加入0.2ml氯仿，振蕩15s，靜置2min。4℃離心，12000g×15min，取上清液(約400ul)。加入0.4ml異丙醇，將管中液體輕輕混勻，室溫靜置10min。4℃離心，12000g×10min，棄上清。加入1ml75%乙醇，輕輕洗滌沉淀。4℃，7500g×5min，棄上清。晾干，加入適量的DEPCH2O溶解（65℃促溶10-15min）。第五十一頁(yè)，共76頁(yè)。（四）RNA電泳檢測(cè)和定量

RNA電泳檢測(cè)核酸濃度儀檢測(cè)第五十二頁(yè)，共76頁(yè)。RNA電泳檢測(cè)和定量1、核酸濃度儀檢測(cè)純度：OD260/OD280≥1.8

濃度：稀釋倍數(shù)×讀數(shù)比色皿需經(jīng)濃鹽酸：甲醇（1：1）溶液浸泡！第五十三頁(yè)，共76頁(yè)。

RNA電泳檢測(cè)和定量2、瓊脂糖電泳檢測(cè)制備1.2%凝膠：將1.2g瓊脂糖溶于63mLDEPC處理水，冷卻至60C，加入20mL5甲醛凝膠電泳緩沖液和17mL37%甲醛，混勻后在通風(fēng)櫥內(nèi)灌制凝膠，于室溫放置30min，使凝膠凝固;制備總RNA樣品：在一滅過(guò)菌的0.5mL的微量離心管中混合4.5μL總RNA，2μL5甲醛凝膠電泳緩沖液，3.5μL37%的甲醛和10μL去離子甲酰胺，于65C水浴溫育15min，冰浴冷卻，稍加離心使管內(nèi)液體集中于管底。往管中加入2μL甲醛凝膠加樣緩沖液和1μL1mg/mL的EB溶液，混勻;

第五十四頁(yè)，共76頁(yè)。電泳檢測(cè)：將已凝固的凝膠浸入1甲醛凝膠電泳緩沖液中，5V/cm電壓預(yù)電泳5min。然后將已制備好的總RNA樣品加入點(diǎn)樣孔，5V/cm電壓電泳1h。結(jié)束電泳，將凝膠放入紫外透射儀內(nèi)觀察。通城豬肌肉組織總RNA電泳檢測(cè)結(jié)果第五十五頁(yè)，共76頁(yè)。通城豬不同組織總RNA的電泳檢測(cè)結(jié)果第五十六頁(yè)，共76頁(yè)。RNA檢測(cè)結(jié)果第五十七頁(yè)，共76頁(yè)。（五）注意事項(xiàng)1.

所有玻璃器皿均應(yīng)在使用前于180℃的高溫下干烤2hr或更長(zhǎng)時(shí)間；2.

塑料器皿用0.1%DEPC水浸泡或用氯仿沖洗；3.

有機(jī)玻璃的電泳槽等，可先用去污劑洗滌，雙蒸水沖洗，乙醇干燥，再浸泡在3%H2O2室溫10min，然后用0.1%DEPC水沖洗，晾干；第五十八頁(yè)，共76頁(yè)。4.

配制的溶液應(yīng)盡可能的用0.1%DEPC，在37℃處理12hr以上。然后用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑，應(yīng)當(dāng)用DEPC處理過(guò)的無(wú)菌雙蒸水配制，然后經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾除菌；5.

操作人員戴一次性口罩、手套，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中手套要勤換；6.

設(shè)置RNA操作專用實(shí)驗(yàn)室，所有器械等應(yīng)為專用。第五十九頁(yè)，共76頁(yè)。（六）影響RNA提取的因素

1、材料：新鮮，切忌使用反復(fù)凍融的材料如若材料來(lái)源困難，且實(shí)驗(yàn)需要一定的時(shí)間間隔?？梢韵葘⒉牧腺A存在TRIzol或樣品貯存液中，于－70℃或－20℃保存如要多次提取，請(qǐng)分成多份保存液氮長(zhǎng)期保存，－70℃短期保存第六十頁(yè)，共76頁(yè)。影響RNA提取的因素

2、樣品破碎及裂解：根據(jù)不同材料選擇不同的處理方法：培養(yǎng)細(xì)胞：通?？芍苯蛹恿呀庖毫呀饨湍负图?xì)菌：一般TRIzol可直接裂解，對(duì)于一些特殊的材料可先用酶或者機(jī)械方法破壁動(dòng)植物組織：先液氮研磨和勻漿，后加裂解液裂解。期間動(dòng)作快速，樣品保持冷凍樣品量適當(dāng)，保證充分裂解為減少DNA污染，可適當(dāng)加大裂解液的用量第六十一頁(yè)，共76頁(yè)。3、純化：在使用氯仿抽提純化時(shí)，一定要充分混勻，且動(dòng)作快速經(jīng)典的純化方法，如LiCl沉淀等，雖然經(jīng)濟(jì)，但操作時(shí)間長(zhǎng)，易造成RNA降解；柱離心式純化方法：抽提速度快，能有效去除影響RNA后續(xù)酶反應(yīng)的雜質(zhì)，是目前較為理想的選擇。影響RNA提取的因素第六十二頁(yè)，共76頁(yè)。RNA提取常見(jiàn)問(wèn)題

RNA的降解

OD260/OD280比值偏低電泳帶型異常下游實(shí)驗(yàn)效果不佳第六十三頁(yè)，共76頁(yè)。RNA降解

新鮮細(xì)胞或組織：裂解液的質(zhì)量外源RNase的污染裂解液的用量不足組織裂解不充分另外某些富含內(nèi)源酶的樣品(如脾臟，胸腺等)，很難避免RNA的降解。建議在液氮條件下將組織碾碎，并且勻漿時(shí)使用更多裂解液。第六十四頁(yè)，共76頁(yè)。RNA降解冷凍樣品：樣品取材后應(yīng)立即置于液氮中速凍，然后可以移至-70℃冰箱保存。樣品要相對(duì)小一點(diǎn)；先用液氮研磨，再加裂解液勻漿；樣品與裂解液充分接觸前避免融化，研磨用具必須預(yù)冷，碾磨過(guò)程中及時(shí)補(bǔ)充液氮。第六十五頁(yè)，共76頁(yè)。OD260/OD280比值偏低

蛋白質(zhì)污染：不要吸入中間層及有機(jī)相，加入氯仿后首先混勻，并且離心分層的離心力和時(shí)間要足夠。減少起始樣品量，確保裂解完全、徹底解決辦法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。苯酚殘留：不要吸入中間層及有機(jī)相，加入氯仿后首先混勻，并且離心分層的離心力和時(shí)間要足夠。解決辦法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。第六十六頁(yè)，共76頁(yè)。OD260/OD280比值偏低抽提試劑殘留：確保洗滌時(shí)要徹底懸浮RNA，并且徹底去掉75%乙醇。解決辦法:再沉淀一次后，溶解。