三維細(xì)胞培養(yǎng)簡介-閆輝2014.10.9

三維細(xì)胞培養(yǎng)簡介--閆輝2014.10.9第一頁，共24頁。目錄1三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的概念2三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)產(chǎn)生的背景3三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的亮點(diǎn)4三維細(xì)胞培養(yǎng)模型的建立5三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用6三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展前景第二頁，共24頁。1三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的概念

三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)(three-dimensionalcellculture,TDCC)是指將具有三維結(jié)構(gòu)不同的載體與各種不同種類的細(xì)胞在體外共同培養(yǎng),使細(xì)胞能夠在載體的三維立體空間結(jié)構(gòu)中遷移、生長,構(gòu)成三維的細(xì)胞載體復(fù)合物。三維細(xì)胞培養(yǎng)是將細(xì)胞培植在一定的細(xì)胞外基質(zhì)中,細(xì)胞外基質(zhì)（extracellularmatrixc，ＥＣＭ)（1）蛋白充當(dāng)生長支架,使得細(xì)胞能夠分化產(chǎn)生一定的三維組織特異性結(jié)構(gòu),所創(chuàng)建的細(xì)胞生長環(huán)境,則最大程度地模擬體內(nèi)環(huán)境。第三頁，共24頁。2三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)產(chǎn)生的背景細(xì)胞的體外培養(yǎng),關(guān)注的不僅僅是它們的分裂生長,而更為重要的是它們經(jīng)過傳代后能否維持體內(nèi)的性狀。在很多情況下,單層細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)所取到的研究結(jié)果和體內(nèi)的情況不符合,因?yàn)榧?xì)胞在體外改變的環(huán)境下增生,逐漸喪失了原有的性狀。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)完全在體內(nèi)進(jìn)行,但由于體內(nèi)的多種因素制約以及體內(nèi)和外界環(huán)境相互影響而變得復(fù)雜化,難以研究單一過程。第四頁，共24頁。另外,我們在動(dòng)物身上所觀察到的結(jié)果,往往是最終呈現(xiàn)的表現(xiàn),而非研究者最為關(guān)心的中間過程。顯然,如何填補(bǔ)單層細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的鴻溝,一直是生命科學(xué)家思索的問題。尤其是在發(fā)育生物學(xué)領(lǐng)域,迫切需要建立一套細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),既能生長傳代,還能最大程度地維持體內(nèi)性狀,并分化產(chǎn)生新的組織結(jié)構(gòu),以便全面研究發(fā)育過程。隨著組織工程的新興發(fā)展,三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)就應(yīng)運(yùn)而生了。第五頁，共24頁。3

三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的亮點(diǎn)①三維培養(yǎng)體系為細(xì)胞提供類似體內(nèi)生長環(huán)境的支架或基質(zhì)，細(xì)胞通過緊密連接和/或縫隙連接等連接方式建立細(xì)胞間及細(xì)胞與胞外基質(zhì)間的聯(lián)系，形成一定的三維結(jié)構(gòu)；

②三維培養(yǎng)細(xì)胞在基因表達(dá)、基質(zhì)分泌及細(xì)胞功能活動(dòng)等方面與單層培養(yǎng)均有明顯差異，而與體內(nèi)細(xì)胞生長情況更為相似；因此，三維細(xì)胞培養(yǎng)既能保留體內(nèi)細(xì)胞微環(huán)境的物質(zhì)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，又能體現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)的直觀性及條件可控制性，把體外無細(xì)胞及單層細(xì)胞培養(yǎng)體系與組織器官及整體研究聯(lián)系起來。第六頁，共24頁。4三維細(xì)胞培養(yǎng)模型的建立4.1三維基質(zhì)膠（2）的種類以及常用基質(zhì)膠的介紹4.2三維模型的種類4.3常見三維細(xì)胞培養(yǎng)模型的建立方法第七頁，共24頁。目前已經(jīng)知道的基質(zhì)膠主要有海藻酸鈣凝膠、瓊脂糖凝膠，這兩種凝膠主要適用于懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)，還有一種是血纖維蛋白，將動(dòng)物細(xì)胞和血纖維蛋白原混合，然后加入凝血酶。凝血酶將血纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為不溶性的血纖維蛋白，將動(dòng)物細(xì)胞固定在其中。血纖維蛋白可以促進(jìn)細(xì)胞貼壁，因此無論是懸浮細(xì)胞還是貼壁細(xì)胞都適合。第八頁，共24頁。實(shí)驗(yàn)室大量使用的基質(zhì)膠是Matrigel膠，是從小鼠腫瘤組織中提取的抽提物，在室溫下，Matrigel可自動(dòng)聚集產(chǎn)生類似于哺乳動(dòng)物細(xì)胞基底膜的生物活性基質(zhì)材料。Matrigel基底膜基質(zhì)形成的三維培養(yǎng)基質(zhì)，可促進(jìn)上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞、Sertoli細(xì)胞、黑色素瘤細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、甲狀腺細(xì)胞及毛囊細(xì)胞等的貼壁與分化。同時(shí)，Matrigel還能影響乳腺上皮細(xì)胞的蛋白表達(dá)，支持外周神經(jīng)的新生和牛輸卵管上皮細(xì)胞的分化。高濃度的Matrigel適用于研究體內(nèi)血管生成和腫瘤細(xì)胞遷移及腫瘤模型的建立等。第九頁，共24頁。4.2三維細(xì)胞培養(yǎng)模型的種類三維立體培養(yǎng)的方法有多種，常用的有膠內(nèi)培養(yǎng)模式(細(xì)胞與膠原膠混合)、膠上培養(yǎng)模式(細(xì)胞生長于膠原膠表面)和三明治培養(yǎng)模式(細(xì)胞生長于兩層膠原中間)。第十頁，共24頁。4.2常見三維細(xì)胞培養(yǎng)模型的建立方法

膠內(nèi)培養(yǎng)模式的建立方法Matrigel母液濃度10.6mg/mL（3）,放置于4℃溶解(4)。消化細(xì)胞,重懸至完全培養(yǎng)基中計(jì)數(shù),細(xì)胞懸液濃度為1×106/mL。使用時(shí)置于冰上,用預(yù)冷的細(xì)胞重懸液與Matrigel等體積混勻,24孔板中每孔加入100μl。37℃放置30min使其成膠,添加完全培養(yǎng)液。置于37℃5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育,第二日換液,此后每隔一日換液一次[1]。第十一頁，共24頁。膠上培養(yǎng)模式的建立方法在24孔培養(yǎng)板中每孔加入75μl冰上過夜解凍的Matrigel，置于37℃孵箱中孵育15min以上使Matrigel聚集。同時(shí)胰酶消化常規(guī)培養(yǎng)的正常鼻咽細(xì)胞及其高轉(zhuǎn)移潛能亞株5-8F,計(jì)數(shù)后離心收集細(xì)胞.然后把細(xì)胞懸浮于含2%Matrigel的Keratinocyte-SFM培養(yǎng)液中，細(xì)胞濃度為2*104/ml用加樣槍吹打成單個(gè)細(xì)胞后,每孔加入400μl細(xì)胞懸液于已經(jīng)凝固的Matrigel上，置于含5%CO2的37℃孵箱中培養(yǎng)，每3-4天換新鮮培養(yǎng)液[2]。第十二頁，共24頁。三明治培養(yǎng)模型的建立方法三明治模式前期工作和凝膠上模式相同,不同之處在于凝膠上的細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)融合至(70、80)%左右時(shí),吸去培養(yǎng)液,用無菌PBS沖洗兩次后添加第二層膠(200μl/孔),在37℃下培養(yǎng)30min使其凝固后,再在膠原凝固面上添加培養(yǎng)液[3]。第十三頁，共24頁。三種模型的簡單解釋第十四頁，共24頁。4.3不同模型的比較對于膠上培養(yǎng)模式，細(xì)胞可以黏附于細(xì)胞外基質(zhì)表面并向再造基質(zhì)膠中生長，但是只有貼近Matrigel膠的細(xì)胞才能得到固體細(xì)胞外基質(zhì)的支撐，其他不能貼近再造基質(zhì)膠的細(xì)胞仍然處于2D培養(yǎng)條件下，在培養(yǎng)過程中不能形成完全的立體克隆；對于膠內(nèi)培養(yǎng)模式，細(xì)胞直接重懸于完全融化的Matrigel膠條件下，細(xì)胞生長于完全固態(tài)的細(xì)胞外基質(zhì)中，可以很好地模擬體內(nèi)腫瘤細(xì)胞生長微環(huán)境，在培養(yǎng)過程中形成了巨大的、無極性的球狀細(xì)胞克隆。所以大多數(shù)的實(shí)驗(yàn)建立三維模型采用膠內(nèi)培養(yǎng)模式，但相對來說膠上培養(yǎng)模式簡單一些，對于操作的要求低一些。三種模型共同的缺點(diǎn)是無法對細(xì)胞直接利用顯微鏡進(jìn)行連續(xù)的觀察，需要對某一特定時(shí)間的膠原塊進(jìn)行固定制作電鏡標(biāo)本。第十五頁，共24頁。BCA2D細(xì)胞培養(yǎng)模型B細(xì)胞生長于Matrigel膠表面C細(xì)胞重懸于Matrigel膠中[4]第十六頁，共24頁。5三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用5.1腫瘤生物學(xué)三維細(xì)胞培養(yǎng)已被廣泛運(yùn)用到腫瘤學(xué)研究,在腫瘤的實(shí)驗(yàn)性治療、腫瘤的侵襲性、轉(zhuǎn)移和中心壞死的機(jī)制、腫瘤的血管形成和營養(yǎng)供給、體內(nèi)基因表達(dá)的模擬等方面發(fā)揮了不可替代的作用[5]。同時(shí)可以研究不同細(xì)胞間的相互作用，觀察兩種不同的細(xì)胞類型是否融合或是不相關(guān)地各自生長第十七頁，共24頁。5.2軟骨和骨組織成熟的軟骨細(xì)胞和干細(xì)胞被廣泛用于三維細(xì)胞培養(yǎng),以再生損傷的軟骨、骨、韌帶、肌腱和膝關(guān)節(jié)半月板。在培養(yǎng)系統(tǒng)中常加入一些生長因子,以刺激分化,產(chǎn)生組織.5.3循環(huán)系統(tǒng)和心臟各組織都配備有大小各異的血管。如何在成熟的組織中及時(shí)產(chǎn)生血管網(wǎng)絡(luò)是組織工程的重要課題;在治療領(lǐng)域,所關(guān)心的也是如何有目的地改變血管形成,利用三維培養(yǎng)可以清楚地觀察到細(xì)胞通過空間增殖、遷移和錨定,最終形成管狀結(jié)構(gòu)。第十八頁，共24頁。6三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展前景近年來,三維細(xì)胞培養(yǎng)作為一項(xiàng)新興的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),其與二維細(xì)胞培養(yǎng)中細(xì)胞的平面生長相比,最大的優(yōu)勢在于提供了一個(gè)三維的立體微環(huán)境,細(xì)胞在這個(gè)微環(huán)境中完成增殖、分化、運(yùn)動(dòng)、凋亡等等一系列過程,很大程度上模擬了人體微環(huán)境中的細(xì)胞狀態(tài),因而具有極大的可開發(fā)性。第十九頁，共24頁。尤其是在抗腫瘤研究領(lǐng)域,模擬腫瘤微環(huán)境,關(guān)注腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用成為了一個(gè)熱點(diǎn)話題。三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),恰恰為腫瘤細(xì)胞的生長提供了與人體相一致的微環(huán)境,因而在為抗腫瘤治療尋找新靶點(diǎn)等方面具有不可替代的價(jià)值,值得進(jìn)一步的開發(fā)和利用。但是必須承認(rèn),目前的三維培養(yǎng)技術(shù)仍然有待發(fā)展,一方面其成本仍較高,另一方面由于培養(yǎng)條件尚處于亞最佳狀態(tài),細(xì)胞的生存能力和分化程度有限,與真實(shí)人體尚存在差異,所以如何通過技術(shù)上的繼續(xù)完善使培養(yǎng)條件盡可能地模擬體內(nèi),是擺在研究人員面前的重要任務(wù)。第二十頁，共24頁。注釋（1）細(xì)胞外基質(zhì)由細(xì)胞分泌到細(xì)胞外間質(zhì)中的大分子物質(zhì)，構(gòu)成復(fù)雜的網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，支持并連接組織結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)組織的發(fā)生和細(xì)胞的生理活動(dòng)。在生物學(xué)中，細(xì)胞外間質(zhì)或細(xì)胞外基質(zhì)是動(dòng)物組織的一部分，不屬于任何細(xì)胞。細(xì)胞外間質(zhì)決定結(jié)締組織的特性，對于一些動(dòng)物組織的細(xì)胞具有重要作用。它決定結(jié)締組織的特性，為細(xì)胞的生存及活動(dòng)提供適宜的場所，并通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)影響細(xì)胞的形狀、代謝、功能、遷移、增殖和分化，主要成分包括糖胺聚糖、蛋白聚糖，結(jié)構(gòu)蛋白，粘著蛋白。第二十一頁，共24頁。（2）基質(zhì)膠可認(rèn)為是一種可溶性的基底膜基質(zhì)。主要成分包括：層黏連蛋白、膠原IV等，同時(shí)含TGF-β成纖維細(xì)胞生長因子、組織纖維酶原活化因子以及其它在EHS腫瘤中自然表達(dá)的生長因子等。（3）三維膠的最終濃度，需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)一步的確定，濃度的高低不僅影響到凝膠的時(shí)間，同時(shí)影響到細(xì)胞在膠內(nèi)存在的狀態(tài)。（4）Matrigel在22-35℃溫度環(huán)境下快速成膠，因此溶解時(shí)在4℃冰上過夜凍融（4度時(shí)會(huì)隨著溫度的上升部分成膠）。所有用品在使用前需置于冰浴，必須使用預(yù)冷的移液管、吸頭及小管操作Matrigel。成膠后的Matrigel可以在4℃24－48小時(shí)后重新呈液態(tài)。(5)

Matrigel基底膜基質(zhì)在室溫條件下，聚合形成具有生物學(xué)活性的三維基質(zhì)，模擬體內(nèi)細(xì)胞基底膜的結(jié)構(gòu)、組成、物理特性和功能,基底膜是細(xì)胞外基質(zhì)特化而形成的一種柔軟、堅(jiān)韌的網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)。第二十二頁，共24頁。參考文獻(xiàn)[1]馮志華,米坤.

Matrigel膠的肺腺癌細(xì)胞株A549體外三維培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)研究[J].西部醫(yī)學(xué),2009,21(9):[2]廖雯婷,汪慧民,李滿枝等.鼻咽癌變不同時(shí)期的體外三維培養(yǎng)模型建立的實(shí)驗(yàn)研究[J].ChineseJournalofCancer,20