實驗報告-不同因素對酶的影響

生物化學(xué)實驗（甲）課程名酶的基指導(dǎo)質(zhì)實驗——底物專一性劑、激活劑和抑制、最適溫度實驗名稱：實驗類型：分離鑒定實驗同組學(xué)生姓名：一、實驗?zāi)康暮鸵螅ū靥睿┒?、實驗?nèi)容和原理（必填）三、主要儀器設(shè)備（必填）四、操作方法和實驗步驟五、實驗數(shù)據(jù)記錄和處理六、實驗結(jié)果與分析（必填）七、討論、心得I.酶的基本性質(zhì)一一底物專一性一、實驗?zāi)康暮鸵罅私饷傅膶Ｒ恍浴?.掌握驗證酶的專一性的基本原理及方法。3.學(xué)會排除干擾因素，設(shè)計酶學(xué)實驗。二、實驗基本原理酶是一種具有催化功能的蛋白質(zhì)。酶蛋白結(jié)構(gòu)決定了酶的功能——酶的高效性，酶催化的反應(yīng)（酶促反應(yīng)）要比相應(yīng)的沒有催化劑的反應(yīng)快103-1017倍。酶催化作用的一個重要特點是具有高度的底物專一性，即一種酶只能對某一種底物或一類底物起催化作用，對其他底物無催化反應(yīng)。根據(jù)各種酶對底物的選擇程度不同，它們的專一性可以分為下列幾種：1.相對專一性一種酶能夠催化一類具有相同化學(xué)鍵或基團的物質(zhì)進行某種類型的反應(yīng)。2.絕對專一性：有些酶對底物的要求非常嚴格只作用于一種底物，而不作用于任何其他物質(zhì)。如脲酶只能催化尿素進行水解而生成二氧化碳和氨。如xx酶只作用于xx而不作用其它雙糖，淀粉酶只作用于淀粉，而不作用于纖維素。3.立體異構(gòu)專一性有些酶只有作用于底物的立體異構(gòu)物中的一種，而對另一種則全無作用。如酵母中的糖酶類只作用于D-型糖而不能作用于L-型的糖。本實驗以唾液淀粉酶、蔗糖酶對淀粉、蔗糖水解反應(yīng)的催化作用來觀察酶的專一性。采用Benedict試劑檢測反應(yīng)產(chǎn)物。Benedict試劑是堿性硫酸銅溶液，具有一定的氧化能力，能與還原性糖的半縮醛羥基發(fā)生氧化還原反應(yīng)，生成磚紅色氧化亞銅沉淀。Na2CO3+2H2O2NaOH+H2CO3CuSO4+2NaOHCu（OH）2+Na2SO4還原糖（—CHOor—C=O）+2Cu（OH）2Cu2O（磚紅色或黃色）+2H2O+糖的氧化產(chǎn)物在分子結(jié)構(gòu)上，淀粉幾乎沒有，而蔗糖、棉子糖全無半縮醛基，它們均無還原性，因此它們與Benedict試劑無呈色反應(yīng)。淀粉被淀粉酶水解，產(chǎn)物為葡萄糖；蔗糖和棉子糖被蔗糖酶水解，其產(chǎn)物為果糖和葡萄糖，它們都為具有自由半縮醛羥基的還原糖，與Benedict試劑共熱，即產(chǎn)生xxCu2O沉淀。本實驗以此顏色反應(yīng)觀察淀粉酶、蔗糖酶對淀粉和蔗糖的水解作用。三、實驗材料與試劑1、實驗材料⑴蔗糖酶（樣品W）；⑵xx唾液（含唾液淀粉酶）;2、實驗試劑⑴蔗糖酶液蔗糖酶液（樣品W）加蒸餾水適當(dāng)稀釋，備用；⑵唾液淀粉酶液（學(xué)生自制）取0.5mL唾液至25ml量筒中，用蒸餾水（稀釋）到25ml，用棉花過濾備用。唾液稀倍數(shù)因人而異，可稀釋50?400倍，甚至更高；（⑶5%蔗糖（A.R.）溶液；⑷0.5%淀粉溶液（含0.3%NaCl）；⑸Benedict試劑；四、實驗器材與儀器1.漏斗，2.脫脂棉花；3.恒溫水浴（37°C，100°C）；4.量筒;5.試管；6.燒杯；7.吸量管。五、實驗操作方法和步驟㈠檢查試劑取3支試管，按下表操作:試劑處理123。.號％淀粉(0.3%NaCl)溶液(ml)35%蔗糖溶液（ml）3蒸慵水（ml）3Benedict試劑(ml)222搖勻，置沸水浴煮沸2~3min記錄觀察結(jié)果注：1、檢查目的：試劑是否有干擾因素存在。2、也可對蔗糖酶液、唾液淀粉酶液進行檢查是否也有干擾因素存在，請自己設(shè)計。㈡淀粉酶的專一性取三支試管，按下表操作：注：可增加一組唾液淀粉酶液經(jīng)100C加熱3min處理后的樣品對照組。㈢蔗糖酶的專一性取三支試管，按下表操作：注：可增加一組蔗糖酶液經(jīng)100C加熱3min處理后的樣品對照組。六、結(jié)果分析討論各試管觀察結(jié)果依次是：（一）：1號xx，2號藍色，3號藍色Benedict試劑是堿性硫酸銅溶液，具有一定的氧化能力，能與還原性糖的半縮醛羥基發(fā)生氧化還原反應(yīng)，生成磚紅色氧化亞銅沉淀。3只試管都為藍色說明幾只試管中都沒有果糖和葡萄糖，說明在不加酶時，淀粉和蔗糖不易水解。試劑無干擾因素的存在。（1號試管是xx可能是因為有少部分的淀粉水解）（二）：1號土黃色，2號xx，3號藍色加入唾液淀粉酶，1號試管底物是淀粉，所以很容易水解成葡萄糖，與Benedict試劑共熱，即產(chǎn)生xxCu2O沉淀。所以1號顏色變化比較大。（2號可能是因為蔗糖在37°C恒溫水浴中也有少部分水解，所以顏色變化，但變化不明顯。）總的來看可以看出唾液淀粉酶只對淀粉有催化活性，不能催化蔗糖水解，具有對淀粉的底物專一性。3號是對照。（三）：1號藍色，2號xx，3號藍色加入蔗糖酶，2號試管底物是蔗糖，所以很容易水解成果糖和葡萄糖，與Benedict試劑共熱，即產(chǎn)生xxCu2O沉淀。所以2號顏色變化比較大。（1號可能是因為淀粉在37C恒溫水浴中也有部分水解，所以有顏色變化，但變化不明顯。)從這三支試管看出蔗糖酶只對蔗糖的水解有催化作用，對淀粉無催化作用，具有對蔗糖的底物專一性。3號是對照。七、思考題1.觀察酶專一性實驗為什么要設(shè)計這3組實驗？每組各有何意義？蒸餾水有何用？第一組作為整個實驗的空白對照組，檢測Benedict試劑對實驗結(jié)果的顏色有何影響，排除干擾因素的存在。第二組作為檢測淀粉酶的專一性實驗組，第三組作為檢測蔗糖酶的專一性的實驗組。蒸餾水作為每一個組中的空白對照，與組內(nèi)其余兩組進行對照。將酶液煮沸10min后，重做二、三的操作，觀察有何結(jié)果？各試管都為藍色，因為酶在煮沸過程中已經(jīng)變性，失去催化活性，故不能催化各自對應(yīng)底物的水解反應(yīng)。3.在此實驗中，為什么要用0.5%淀粉(0.3%NaCl)溶液？0.3%NaCl的作用是什么？0.3%NaCl中的Cl-是作為激活劑激活唾液淀粉酶的活性，使實驗結(jié)果不至于因為唾液淀粉酶的活性不足而導(dǎo)致不同。八、注意事項1.試管要干凈，所有試劑加量準(zhǔn)確，加好試劑后要搖勻。2.使用試劑時不要人為造成試劑間的互相污染；試劑用好瓶蓋要立即蓋好，防止試劑間的互相污染。以免實驗結(jié)果的錯誤。影響酶活性的因素一一激活劑和抑制劑一、實驗?zāi)康暮鸵罅私饧せ顒┖鸵种苿γ复俜磻?yīng)速度的影響。2.學(xué)習(xí)檢定激活劑和抑制劑影響酶促反應(yīng)速度的原理和方法。二、實驗基本原理在酶促反應(yīng)過程中，酶的活性常受某些物質(zhì)的影響，有些物質(zhì)能使酶的活性增加，稱為激活劑；某些物質(zhì)它們并不引起酶蛋白變性，但能使酶分子上的某些必需基團（主要是指酶活性中心上的一些基團）發(fā)生變化，因而引起酶活力下降，甚至喪失，致使酶反應(yīng)速度降低，稱為酶的抑制劑。酶的激活劑種類：1、一些簡單的無機離子，如Mg2+、Cl-等；2、一些中等大小的有機分子，如抗壞血酸等也是激活劑，它們對某些含巰基的酶具有激活作用；3、有些酶的催化作用易受某些抑制劑的影響，因而能除去抑制劑的物質(zhì)也可稱為激活劑，如EDTA能除去重金屬，因而能解除重金屬對酶的抑制作用。4、具有蛋白質(zhì)性質(zhì)的大分子物質(zhì)，這些激活劑是指可對某些無活性的酶原起作用的酶。酶的抑制劑有許多種：如重金屬離子（Ag+、Hg2+、Pb2+、Cu2+等）、CO、氯化物、H2S、砷化物、氟化物、生物堿、有機磷農(nóng)藥等都是抑制劑。少量的激活劑或抑制劑就能影響酶的活性，而且常具有特異性。值得注意的是激活劑和抑制劑不是絕對的，各種激活劑對酶的作用是不同的。本實驗利用淀粉被水解的不同階段產(chǎn)物與碘有不同顏色反應(yīng)，定性觀察唾液淀粉酶在酶促反應(yīng)中激活或抑制現(xiàn)象。淀粉經(jīng)酶促水解為葡萄糖的不同階段的產(chǎn)物與碘作用的顏色反應(yīng)如下：淀;h扮一紫色糊;隋一紅色暗月精-京色*啪-i麥亨瀚葡莓i糖藍色顯碧:色顯打:色不顯1（碘色不藍L色色）不岳（碘］:色仍為多糖（無還原性）（有還琪性）本實驗中，Cl-為唾液淀粉酶的激活劑；Cu2+為唾液淀粉酶的抑制劑。利用淀粉被水解的不同階段產(chǎn)物與碘有不同的呈色反應(yīng)，定性觀察唾液淀粉酶在酶促反應(yīng)中激活和抑制現(xiàn)象。淀粉+碘藍色淀粉+淀粉酶水解產(chǎn)物+碘顏色變化水解的程度是通過水解混合物遇碘溶液所呈現(xiàn)的顏色之變化來判斷的。三、實驗材料與試劑1、實驗材料xx唾液2、實驗試劑⑴唾液淀粉酶（學(xué)生自制）取唾液1ml至25ml量筒中，用蒸餾水稀釋至25ml，用棉花過濾備用。唾液稀釋倍數(shù)因人而異，可稀釋50?400倍，甚至更高。⑵0.1%淀粉溶液⑶1.0%氯化鈉溶液⑷1.0%硫酸銅溶液⑸1.0%硫酸鈉溶液⑹碘化鉀-碘液四、實驗器材與儀器1.試管及試管架2.量筒3.漏斗4.脫脂棉花5.點滴板6.吸量管7.恒溫水?。?7°C）五、實驗操作方法和步驟取試管4支，按下表操作：注意：⑴找出準(zhǔn)確的保溫時間，是本實驗是實驗?zāi)芊癯晒Φ年P(guān)鍵步驟之一，唾液淀粉酶液濃度可根據(jù)個人情況而定，通過37C水浴溶保溫計時，反應(yīng)時間最好在8?15min以內(nèi)，只有確定準(zhǔn)確的保溫時間才能進行實驗。（2）加入酶液后，務(wù)必充分搖勻，保證酶與全部淀粉液接觸的反應(yīng)才能得到理想的顏色梯度變化結(jié)果。（3）碘化鉀-碘液不要過早地加到點滴板上，以免碘液揮發(fā)，影響顯色效果。六、結(jié)果分析討論1號試管為xx，2號為淺黃色，3號為褐色，4號為淺褐色。試管1中顏色最深，說明CuSO4可以抑制淀粉酶的活性；試管2中顏色最淺，基本呈碘色，故淀粉酶活性最高，說明NaCl可以激活淀粉酶的活性；試管3、4中顏色基本一致，且深淺居于試管1、2之間，淀粉酶活性一般，說明Na+、SO42-對淀粉酶活性都沒有影響。故總體上看，可以得出Cl-是唾液淀粉酶的激活劑，Cu2+是唾液淀粉酶的抑制劑。七、思考題1.激活劑可分哪幾類？本實驗xxNaCl、硫酸銅是屬于哪種類型？激活劑可分為：簡單無機離子、中等大小有機分子、能除去抑制劑的物質(zhì)、具有蛋白質(zhì)性質(zhì)的大分子物質(zhì)等。NaCl屬于簡單無機離子；CuSO4屬于重金屬抑制劑。本實驗中，1，2,3,4管各有何用意？為什么要設(shè)計第3管和第4管？1管可觀察抑制劑對反應(yīng)影響的現(xiàn)象，2管可觀察激活劑對反應(yīng)影響的現(xiàn)象，第3管可以將1管中的Na+和2管中的SO42-對反應(yīng)的影響去除，4管作為空白對照。抑制劑與變性劑有何不同？試舉例說明。抑制劑只改變酶的催化活性，并不使蛋白質(zhì)變性，其影響是可逆的；變性劑破壞了蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)變性，并且多數(shù)變性劑的影響是不可逆的。如：Cu2+是唾液淀粉酶的抑制劑，但如果將Cu2+去除淀粉酶的活性又可以變?yōu)檎Ｋ?。八、注意事?.試管要干凈，所有試劑加量準(zhǔn)確，加好試劑后要搖勻。2.使用試劑時不要人為造成試劑間的互相污染，以免實驗結(jié)果的錯誤。3.試劑用好瓶蓋要立即蓋好，防止試劑間的互相污染。4.兩種淀粉不要弄錯。5.激活劑抑制劑實驗中，注意運用點滴板（顯色板）來控制保溫時間；如1，2,3,4管顏色反應(yīng)無明顯差別，可能是唾流淀粉酶活力太高或太低，若酶活性太高可將酶稀釋后重做；若酶活性太低，可延長保溫時間或增加酶的濃度。影響酶活性的因素一一溫度，最適溫度測定一、實驗?zāi)康暮鸵?.了解溫度對酶活力的影響;2.學(xué)習(xí)測定最適溫度的原理和方法；二、實驗基本原理酶的催化反應(yīng)受溫度影響很大，每一種酶所催化的反應(yīng)，在一定條件下，僅在某一溫度范圍內(nèi)表現(xiàn)出最大的活力，即反應(yīng)速度最大時的溫度，這個溫度稱為該酶促反應(yīng)的最適溫度，高于或低于最適溫度時，反應(yīng)速度逐漸下降。因此，酶促反應(yīng)與溫度的關(guān)系，用酶活力對溫度作圖，通常具有鐘罩形曲線特征。溫度與酶活力的關(guān)系測定是選

擇一定的條件，把底物濃度、酶濃度、反應(yīng)時間、pH等固定在最適狀態(tài)下，然后在一系列不同溫度條件下，進行反應(yīng)初速度測定，以酶反應(yīng)初速度對溫度作圖，可以得一個鐘罩形的曲線，即為溫度一酶活性曲線，在某溫度有一酶活力最大值，這個溫度即為最適溫度。實驗①利用唾液淀粉酶為試驗對象，在0°C?65°C之間選擇不同的溫度，進行酶活力測定。根據(jù)淀粉被唾液淀粉酶水解的程度的不同，遇碘呈現(xiàn)顏色的變化來判斷酶活力的大小及最適溫度。實驗②采用蔗糖酶為試驗對象，在室溫至75C之間選擇不同溫度進行酶活力測定。蔗糖酶的活力常以其反應(yīng)產(chǎn)物還原糖（葡萄糖）的生成量來表示。測定還原糖的方法很多，本實驗選擇3,5-二硝基水揚酸法測定還原糖量。在堿性條件下，3,5-二硝水楊酸與還原糖溶液共熱后被還原成紅色氨基化合物，并在一定濃度范圍內(nèi)，還原糖的量與反應(yīng)溶液所呈棕紅色物質(zhì)顏色的深淺程度xx。因此，可以用分光光度法測定酶促反應(yīng)后生成的還原糖量，從而測定蔗糖水解的速度和酶活力。三、實驗材料與試劑1、實驗材料⑴蔗糖酶液（樣品W）加蒸餾水適當(dāng)稀釋，備用；⑵xx唾液。2、實驗試劑⑴0.2mol/L醋酸緩沖液（pH4.6）⑵5%蔗糖（A.R.）溶液（W/V）（3）3,5一二硝基水揚酸（簡稱DNS）試劑⑷0.5%淀粉溶液（含0.3%NaCl）（5）KI-I2溶液四、實驗器材與儀器1.試管及試管架，2.恒溫水浴，3.吸量管，4.滴管，5.點滴板，6.分光光度計，7.制冰機。五、實驗操作方法和步驟一、溫度對唾液淀粉酶活力的影響1.觀察溫度對酶活動的影響:取5支試管，按下表操作。1.試管及試管架，2.恒溫水浴，3.吸量管，4.滴管，5.點-一管號試劑"一_123450.5峪定粉液(0.3%NaCl)(ml)22222溫度％）讓浴約or室溫375065各保溫5iriin唾液淀粉酶（ml）11111將試管內(nèi)溶液混勻后，置各相應(yīng)溫度，保溫lOminIK-I讖（滴）11111記錄顏色變化注意：⑴找出準(zhǔn)確的保溫時間，是本實驗是實驗?zāi)芊癯晒Φ年P(guān)鍵步驟之一，唾液淀粉酶液濃度可根據(jù)個人情況而定，通過37°C水浴溶保溫計時，反應(yīng)時間最好在8~15min以內(nèi)，只有確定準(zhǔn)確的保溫時間才能進行實驗。（2）加入酶液后，務(wù)必充分搖勻，保證酶與全部淀粉液接觸的反應(yīng)才能得到理想的顏色梯度變化結(jié)果。（3）碘化鉀-碘液不要過早地加到點滴板上，以免碘液揮發(fā)，影響顯色效果。⑷各管保溫時間要相同。2、繪制溫度-酶活力曲線圖，以反應(yīng)溫度為橫坐標(biāo)，反應(yīng)液顏色的深淺程度（代表酶活力的大?。榭v坐標(biāo)。繪制溫度一一酶活力曲線（鐘罩形），確定唾液淀粉酶的最適溫度。二、溫度對蔗糖酶活力的影響1、蔗糖酶最適溫度的測定取試管7支進行編號，0號管為空白對照，以蒸餾水代替酶液，1—7號順序為測定管，向各管加入0.2mol/L醋酸緩沖液（pH4.6）1ml，2%蔗糖溶液0.5ml，然后將各編號管依次放入相應(yīng)溫度（見下表）的恒溫水浴或恒溫箱中，預(yù)熱2min，再逐管準(zhǔn)確計時加入0.5ml經(jīng)適當(dāng)稀釋的蔗糖酶液，迅速混勻；精確反應(yīng)10min后，加入1ml3,5-二硝基水楊酸（DNS）試劑，立即混勻，放入沸水浴中加熱5min。取出用流水冷卻至室溫后，向各管加入5ml蒸餾水，充分混勻。以0號管作空白對照A520值為零，在分光光度計上于520nm波長處測定各管的A520值，并作好記錄。2、繪制溫度一一酶的活力曲線圖以反應(yīng)溫度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的A520（表示反應(yīng)初速度）為縱坐標(biāo)，繪制出溫度一酶活力（A520值）曲線圖，從而可以測出蔗糖酶在本實驗條件下