質(zhì)粒與載體課件

質(zhì)粒與載體課件第1頁(yè)/共66頁(yè)1.質(zhì)粒概述質(zhì)粒（plasmid）：一種獨(dú)立于染色體外，能進(jìn)行自主復(fù)制的細(xì)胞質(zhì)遺傳因子，主要存在于各種微生物細(xì)胞中。

牛牛文庫(kù)文檔分享第2頁(yè)/共66頁(yè)1.1質(zhì)粒的分子結(jié)構(gòu)通常以共價(jià)閉合環(huán)狀的超螺旋雙鏈DNA分子存在于細(xì)胞中；也發(fā)現(xiàn)有線型雙鏈DNA質(zhì)粒和RNA質(zhì)粒；疏螺旋體、鏈霉菌和酵母菌

牛牛文庫(kù)文檔分享第3頁(yè)/共66頁(yè)1.2質(zhì)粒的檢測(cè)

提取所有胞內(nèi)DNA后電鏡觀察；

超速離心或瓊脂糖凝膠電泳后觀察；通常用堿裂解法提取質(zhì)粒

牛牛文庫(kù)文檔分享第4頁(yè)/共66頁(yè)1.3質(zhì)粒的命名第1個(gè)字母(小寫(xiě))：p，質(zhì)粒（plasmid）;第2，3個(gè)字母（大寫(xiě)）：人名，實(shí)驗(yàn)室名，表型性狀或其他特征的英文縮寫(xiě);編號(hào)（阿拉伯?dāng)?shù)字）：區(qū)別同一類型的不同質(zhì)粒例：pUC18,pUC19

牛牛文庫(kù)文檔分享第5頁(yè)/共66頁(yè)1.4質(zhì)粒的主要類型質(zhì)粒與宿主的關(guān)系：質(zhì)粒所含的基因?qū)λ拗骷?xì)胞一般是非必需的；在某些特殊條件下，質(zhì)粒有時(shí)能賦予宿主細(xì)胞以特殊的機(jī)能，從而使宿主得到生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。

牛牛文庫(kù)文檔分享第6頁(yè)/共66頁(yè)質(zhì)粒的主要類型（P202）質(zhì)粒所編碼的功能和賦予宿主的表型效應(yīng)致育因子(Fertilityfactor，F(xiàn)因子)抗性因子(Resistancefactor，R因子)產(chǎn)細(xì)菌素的質(zhì)粒（Bacteriocinproductionplasmid）毒性質(zhì)粒(virulenceplasmid)代謝質(zhì)粒(Metabolicplasmid)隱秘質(zhì)粒(crypticplasmid)

牛牛文庫(kù)文檔分享第7頁(yè)/共66頁(yè)1.5質(zhì)粒的一般特性

非必要遺傳物質(zhì)一般控制次要性狀，能自我復(fù)制并穩(wěn)定遺傳。質(zhì)粒的存在一般也有助于生物在特殊環(huán)境下的生長(zhǎng)；

在細(xì)胞內(nèi)的大小和數(shù)量不相同一般大質(zhì)粒（分子量>60M道爾頓）拷貝數(shù)少，小質(zhì)粒（分子量<15M道爾頓）拷貝數(shù)較多。氯霉素等可抑制染色體DNA復(fù)制而使質(zhì)粒拷貝數(shù)擴(kuò)增；

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互不相容性屬于同一組并具有共同阻遏物的質(zhì)粒不能在同一細(xì)胞并存；

具有可轉(zhuǎn)移性及穩(wěn)定性以較高頻率（10-6），通過(guò)細(xì)胞間的接合作用或其它機(jī)制從供體轉(zhuǎn)移至受體，在細(xì)胞分裂前復(fù)制，均等分配至子細(xì)胞中；

可整合性在一定條件下，質(zhì)?？梢哉系饺旧wDNA上，并可重新脫落下來(lái)

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可重組性不同質(zhì)粒或質(zhì)粒與染色體上的基因可以在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外進(jìn)行交換并形成新的重組質(zhì)粒；

可消除性經(jīng)高溫、吖啶橙或絲裂霉素C等可以消除質(zhì)粒，宿主細(xì)胞同時(shí)也失去質(zhì)粒所攜帶的表型性狀；

耐堿性與染色體DNA相比，質(zhì)粒有較高的耐堿性，調(diào)pH至12.4，可使染色體DNA變性，通過(guò)離心將其與質(zhì)粒分離

牛牛文庫(kù)文檔分享第10頁(yè)/共66頁(yè)2.質(zhì)粒的復(fù)制和調(diào)節(jié)2.1質(zhì)粒的大小常見(jiàn)質(zhì)粒大小的范圍為1～200kb，個(gè)別大質(zhì)?？蛇_(dá)800～1000kb質(zhì)粒的大小常用分子量MD或堿基對(duì)數(shù)kb來(lái)表示。1MD的雙鏈DNA≈1.65kb。未知質(zhì)粒的大小通?？梢栽谙嗤瑮l件下與已知其大小的幾個(gè)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒比較并依其電泳距離作圖來(lái)估算。最精確的測(cè)定需要對(duì)質(zhì)粒DNA作序列分析，然后從所含堿基數(shù)目來(lái)直接推算出其大小和分子量。

牛牛文庫(kù)文檔分享第11頁(yè)/共66頁(yè)2.2質(zhì)粒的拷貝數(shù)質(zhì)粒的數(shù)量亦稱為質(zhì)粒在每一細(xì)胞中存在的拷貝數(shù)(copynumber)不同質(zhì)粒在細(xì)胞中的拷貝數(shù)各異。一般而言，質(zhì)粒的拷貝數(shù)與其分子量成反比關(guān)系，分子量大的拷貝數(shù)低，分子量小的拷貝數(shù)高。如F因子這一類質(zhì)粒，每個(gè)細(xì)胞中只有1～2個(gè)拷貝的質(zhì)粒，它們的復(fù)制受到嚴(yán)格控制，稱為嚴(yán)緊型質(zhì)粒(stringentplasmids)或低拷貝質(zhì)粒。分子量小的(如ColE1質(zhì)粒)拷貝數(shù)高，每個(gè)細(xì)胞中有10～100個(gè)拷貝的質(zhì)粒，說(shuō)明它們的復(fù)制不受到嚴(yán)格控制，稱為松弛型質(zhì)粒(relaxedplasmids)或高拷貝質(zhì)粒?；蚬こ讨袨楂@得大量的基因產(chǎn)物所用的載體質(zhì)粒便是這類松弛型質(zhì)粒。

牛牛文庫(kù)文檔分享第12頁(yè)/共66頁(yè)2.3質(zhì)粒復(fù)制的模型復(fù)制子(replicon)是一個(gè)復(fù)制單位，細(xì)菌染色體是一個(gè)復(fù)制子，每一個(gè)質(zhì)粒也是一個(gè)復(fù)制子。復(fù)制起點(diǎn)是復(fù)制子起始復(fù)制的部位，作為一個(gè)復(fù)制子,至少需要有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn),即ori位點(diǎn)。大腸桿菌染色體的復(fù)制起點(diǎn)稱為oriC，質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)叫做oriV。質(zhì)粒的復(fù)制主要是通過(guò)θ型復(fù)制和滾環(huán)復(fù)制兩種方式之一進(jìn)行的，其中以θ型復(fù)制為主。在θ型復(fù)制中，有單向復(fù)制和雙向復(fù)制兩種類型，如R1、R100等的復(fù)制是單向的，而F和R6k是雙向復(fù)制類型。

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質(zhì)粒只編碼一種或少數(shù)幾種與復(fù)制有關(guān)的蛋白質(zhì)。而復(fù)制所需要的其它蛋白，如DNA聚合酶、連接酶、引物酶、連接酶、RNA-H酶、解旋酶(gyrase)和拓?fù)洚悩?gòu)酶I、dnaB

和dnaC基因產(chǎn)物(沿鏈延伸的DNA合成酶)等都是利用寄主的復(fù)制酶體系。復(fù)制起點(diǎn)(ori)區(qū)的功能ori位點(diǎn)周?chē)男》秶鶧NA是質(zhì)粒復(fù)制所必需的在大多數(shù)質(zhì)粒中，與復(fù)制有關(guān)的蛋白質(zhì)基因位于它們的作用位點(diǎn)---ori序列附近將ori區(qū)克隆到一個(gè)不能自主復(fù)制的環(huán)狀雙鏈DNA分子上并引入原核細(xì)胞后,該重組DNA具有自主復(fù)制能力。

牛牛文庫(kù)文檔分享第14頁(yè)/共66頁(yè)pBR322是最早人工構(gòu)建的質(zhì)粒載體。通過(guò)將下面幾部分不同來(lái)源的DNA片段連接起來(lái)而構(gòu)成的環(huán)狀質(zhì)粒：來(lái)源于ColE1的衍生質(zhì)粒pMB1的DNA復(fù)制起點(diǎn)(ori)及rop區(qū)；來(lái)源于質(zhì)粒pSC101的四環(huán)素抗性基因(tetr)；來(lái)源于轉(zhuǎn)座子Tn3的氨卞青霉素抗性基因(ampr)。

牛牛文庫(kù)文檔分享第15頁(yè)/共66頁(yè)ori區(qū)域常決定了質(zhì)粒的許多特性，如質(zhì)粒的寄主范圍和質(zhì)粒的拷貝數(shù)。質(zhì)粒如ColE1類型的質(zhì)粒，包括pBR322、pET和pUC具有較窄的寄主范圍，這些質(zhì)粒只在E.coli

及一些親緣關(guān)系較近的如沙門(mén)氏菌(Salmonella)和克氏桿菌(Klebsiella)中復(fù)制。RP4、RK2和RSF1010及從G+細(xì)菌中分離的滾環(huán)復(fù)制的質(zhì)粒都屬于廣寄主范圍(broadhostrange)質(zhì)粒。廣寄主范圍的質(zhì)粒一般是編碼與復(fù)制起始有關(guān)的所有蛋白，這樣就不依賴于寄主的功能。

牛牛文庫(kù)文檔分享第16頁(yè)/共66頁(yè)2.4質(zhì)粒復(fù)制的調(diào)控

質(zhì)粒的復(fù)制機(jī)制同染色體基本相同

質(zhì)粒的復(fù)制的調(diào)控主要是控制拷貝數(shù)

質(zhì)粒的復(fù)制復(fù)制調(diào)控機(jī)制一般采用直接或間接的負(fù)調(diào)控機(jī)制。

負(fù)調(diào)控因子可以是蛋白質(zhì)、RNA或DNA重復(fù)序列。抑制物-靶位調(diào)控(inhibitor-targetregulation)其特點(diǎn)是依賴一小段反向轉(zhuǎn)錄的RNA作為抑制物，通過(guò)它與目標(biāo)RNA的互補(bǔ)結(jié)合以阻止質(zhì)粒復(fù)制的起始。

牛牛文庫(kù)文檔分享第17頁(yè)/共66頁(yè)目標(biāo)RNA是質(zhì)粒DNA復(fù)制的引物或是用于編碼復(fù)制所需的Rep蛋白的mRNA。屬于這一復(fù)制調(diào)控類型的質(zhì)粒包括ColE1、pT181、p15A、pMB1、RSF1010、loDF13、R1等ColE1質(zhì)粒復(fù)制調(diào)控ColE1質(zhì)粒復(fù)制調(diào)控6.6kb的小質(zhì)粒，拷貝數(shù)10-20

復(fù)制不需要質(zhì)粒編碼蛋白質(zhì)，而是依賴于宿主的復(fù)制酶體系

從一個(gè)固定原點(diǎn)oriV開(kāi)始，進(jìn)行單向復(fù)制。

牛牛文庫(kù)文檔分享第18頁(yè)/共66頁(yè)ColE1的復(fù)制需要一個(gè)RNA引物。RNAⅡ是質(zhì)粒復(fù)制的引物前體,PRNAⅡ是編碼RNAⅡ的啟動(dòng)子,RNAⅡ轉(zhuǎn)錄是在RNA聚合酶作用下，從復(fù)制原點(diǎn)上游方向555bp處起始轉(zhuǎn)錄(將RNA與DNA的轉(zhuǎn)換處定為復(fù)制原點(diǎn))。當(dāng)這個(gè)RNAⅡ延伸至復(fù)制原點(diǎn)oriV時(shí)，由RNAaseH將RNA切斷，從而產(chǎn)生3’-OH末端。然后DNA聚合酶以此為引物合成DNA，復(fù)制從起始點(diǎn)oriV開(kāi)始向右進(jìn)行。

牛牛文庫(kù)文檔分享第19頁(yè)/共66頁(yè)3’5’5’3’oriVLorLightstrandHorHeavystrandNewLStrandsynthesisedfirstONLY580bpsneededforplasmidtoreplicateinhostcell-555RNAIIRNAI-445RNAPolymeraseRNAIIstartsat-555onHstrandColE1的復(fù)制

牛牛文庫(kù)文檔分享第20頁(yè)/共66頁(yè)-445-5553’-445TranscriptionbeyondoriVHybridisationat/nearoriV-5553’3’RNAaseHcleavesatoriV2/3bpaccuracy-445ONLY580bpsneededandONLY13afteroriV

牛牛文庫(kù)文檔分享第21頁(yè)/共66頁(yè)質(zhì)粒編碼的兩個(gè)負(fù)調(diào)控因子Rop蛋白質(zhì)和反義RNA(RNAⅠ)，控制了DNA復(fù)制過(guò)程中所必需的引物的合成。在ColE1復(fù)制原點(diǎn)上游方向445bp處(相當(dāng)于RNAⅡ的第111個(gè)堿基的位置)處起始轉(zhuǎn)錄另一個(gè)RNA分子，其轉(zhuǎn)錄方向與RNAⅡ相反，它是由雙鏈DNA鏈上的另一條鏈(C-鏈)為模板進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的，這個(gè)RNA分子稱為RNAI，屬于反義RNA。

牛牛文庫(kù)文檔分享第22頁(yè)/共66頁(yè)上節(jié)課的總結(jié)1.原核生物基因組的特點(diǎn)2.質(zhì)粒及載體1）.質(zhì)粒的概念及種類2）.質(zhì)粒復(fù)制模型3）.質(zhì)粒復(fù)制的調(diào)控抑制物-靶位調(diào)控

牛牛文庫(kù)文檔分享第23頁(yè)/共66頁(yè)這個(gè)反義RNAI有111個(gè)堿基與RNAⅡ的5’末端互補(bǔ)，這樣,RNAI與RNAⅡ互補(bǔ)形成雙鏈RNA結(jié)構(gòu),使之不能為RNAaseH所識(shí)別(人們通常認(rèn)為RNAaseH只識(shí)別DNA-RNA雜合雙鏈，而不識(shí)別雙鏈RNA結(jié)構(gòu))。RNAⅡ的轉(zhuǎn)錄繼續(xù)進(jìn)行，不能在分子原點(diǎn)區(qū)域產(chǎn)生有活性的引物而對(duì)復(fù)制起負(fù)調(diào)控作用。因此，RNAI控制著質(zhì)粒的拷貝數(shù)。這個(gè)機(jī)理解釋了ColE質(zhì)粒的拷貝數(shù)調(diào)控,由于RNAI是由質(zhì)粒編碼合成的,當(dāng)質(zhì)粒的濃度高時(shí),就會(huì)產(chǎn)生較多的RNAI分子,而高濃度的RNAI就會(huì)來(lái)又干擾RNAⅡ的加工,從而抑制復(fù)制。

牛牛文庫(kù)文檔分享第24頁(yè)/共66頁(yè)一般當(dāng)一個(gè)細(xì)胞中ColE的拷貝數(shù)達(dá)到16時(shí),就會(huì)幾乎完全抑制質(zhì)粒的復(fù)制。調(diào)控蛋白,rop基因位于ColE1復(fù)制原點(diǎn)下游方向不遠(yuǎn)處。Rop蛋白增強(qiáng)了RNA1和RNA2的相互作用，從而加強(qiáng)了RNAI的抑制作用。反義RNA對(duì)質(zhì)粒復(fù)制的抑制作用，控制著質(zhì)粒的拷貝數(shù)，反義基因發(fā)生突變將會(huì)增進(jìn)引物的形成和質(zhì)粒的復(fù)制，即增加其拷貝數(shù)。野生型ColE1的拷貝數(shù)約是20個(gè)/每個(gè)細(xì)胞，當(dāng)反義基因發(fā)生缺陷時(shí)，其拷貝數(shù)超過(guò)250，

牛牛文庫(kù)文檔分享第25頁(yè)/共66頁(yè)+600+400 -500Rop/RomDimer5’3’5’3’RNAasecut3’oriVSummaryofColE1replicationcontrolRNAIRNAII

牛牛文庫(kù)文檔分享第26頁(yè)/共66頁(yè)R1質(zhì)粒復(fù)制調(diào)控R1質(zhì)粒約90kb，拷貝數(shù)為每個(gè)細(xì)胞1-2個(gè)。RepA蛋白是質(zhì)粒復(fù)制起始必需的因子。由repA基因編碼，有兩個(gè)轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子，PcopB和PrepA。從PcopB轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生CopB和RepA兩個(gè)產(chǎn)物。從PrepA

轉(zhuǎn)錄僅產(chǎn)生RepA。CopB為PrepA的阻遏蛋白。R1質(zhì)粒復(fù)制區(qū)還有copA基因，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為反義RNA，能與repA基因產(chǎn)物RNA互補(bǔ)，形成雙鏈RNA，被RNaseIII降解，RepA無(wú)法合成，抑制質(zhì)粒復(fù)制。復(fù)制區(qū)有tap基因，其產(chǎn)物Tap蛋白為轉(zhuǎn)錄活化蛋白，能促進(jìn)RepA的合成。

牛牛文庫(kù)文檔分享第27頁(yè)/共66頁(yè)copBcopAtaprepAoriV

5’3’3’5’RepressorRNAIantisenseRNAIIShine-DelgarnorepARepAinitiatesreplicationTap

牛牛文庫(kù)文檔分享第28頁(yè)/共66頁(yè)重復(fù)子-競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合調(diào)控(iteron-bindingregulation)最常見(jiàn)于質(zhì)粒如：F、P1、R6k、RK2、RP4和pSC101等，是通過(guò)蛋白質(zhì)即RepA蛋白進(jìn)行復(fù)制調(diào)控。這些質(zhì)粒在復(fù)制的起始位點(diǎn)(ori)和復(fù)制基因(rep)附近存在著多個(gè)長(zhǎng)度為17-22bp的DNA短片段(叫做重復(fù)子,iteron)，它們能與復(fù)制必需的Rep蛋白競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，從而抑制了質(zhì)粒的復(fù)制和拷貝數(shù)的增加。

牛牛文庫(kù)文檔分享第29頁(yè)/共66頁(yè)由于含有重復(fù)子序列，這些質(zhì)粒也叫重復(fù)子質(zhì)粒(Iteronplasmids)，通常在ori區(qū)有3-7個(gè)重復(fù)子。除此之外,通常在不遠(yuǎn)處還有這些重復(fù)序列。pSC101是最簡(jiǎn)單的重復(fù)子質(zhì)粒。pSC101質(zhì)粒復(fù)制調(diào)控repA基因編碼的RepA蛋白是復(fù)制起始所必需的，在ori區(qū)有3個(gè)重復(fù)子序列，R1、R2和R3，RepA就是通過(guò)與它們的結(jié)合而控制質(zhì)粒的拷貝數(shù)。RepA蛋白是pSC101和許多其它重復(fù)子質(zhì)粒復(fù)制所需的唯一由質(zhì)粒編碼的蛋白質(zhì)。寄主染色體編碼的其它蛋白如DnaA,DnaB,DnaC和DnaG與ori區(qū)結(jié)合后，質(zhì)粒的復(fù)制才起始。

牛牛文庫(kù)文檔分享第30頁(yè)/共66頁(yè)第二種調(diào)控機(jī)理是由于重復(fù)子序列間的相互作用使兩個(gè)質(zhì)粒偶聯(lián)在一起,從而抑制了質(zhì)粒復(fù)制的起始,這種調(diào)控方式被叫做偶聯(lián)模型(couplingorhandcuffingmodel）。重復(fù)子質(zhì)粒的復(fù)制是通過(guò)兩種機(jī)制進(jìn)行調(diào)控的第一,RepA蛋白通過(guò)與自身的啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合而抑制自身的合成,這種調(diào)控方式被叫做轉(zhuǎn)錄自體調(diào)控(transcriptionalautoregulation)。質(zhì)粒的濃度越高,合成的RepA蛋白就約多,相應(yīng)地就越多的抑制自身的合成。因此,RepA蛋白的濃度總是維持在一定的范圍內(nèi),復(fù)制的起始受到嚴(yán)格的調(diào)控

牛牛文庫(kù)文檔分享第31頁(yè)/共66頁(yè)

牛牛文庫(kù)文檔分享第32頁(yè)/共66頁(yè)3.質(zhì)粒的穩(wěn)定性(細(xì)胞分裂中的質(zhì)粒分配)在細(xì)胞分裂過(guò)程中發(fā)生的質(zhì)粒不平均的分配,是導(dǎo)致質(zhì)粒不穩(wěn)定性的重要原因。要使質(zhì)粒能夠保持穩(wěn)定的遺傳,至少需要滿足下面兩個(gè)方面的條件:第一是每個(gè)世代每個(gè)質(zhì)粒平均都必須至少發(fā)生一次復(fù)制；第二是當(dāng)細(xì)胞分裂時(shí),復(fù)制產(chǎn)生的質(zhì)?？截惐仨毱骄峙涞絻蓚€(gè)子細(xì)胞中去。質(zhì)粒分配到子細(xì)胞的途徑可分成隨機(jī)分配(randomdistribution)和主動(dòng)分配(activedistribution)兩種不同方式。

牛牛文庫(kù)文檔分享第33頁(yè)/共66頁(yè)主動(dòng)分配的機(jī)理對(duì)低拷貝質(zhì)粒而言，則需要某種特定機(jī)制，將細(xì)胞分裂與質(zhì)粒復(fù)制協(xié)調(diào)起來(lái)，以保證每個(gè)細(xì)胞至少獲得一個(gè)拷貝。如：FR1和P1。這些質(zhì)粒的穩(wěn)定性：(1)質(zhì)粒結(jié)構(gòu)中還存在編碼主動(dòng)分配體系的par區(qū)。(2)質(zhì)粒編碼的致死蛋白來(lái)抑制不含質(zhì)粒的分離子Par區(qū),又叫做分配區(qū)(partitionregions)或分配座位(partitionlocus)是指在細(xì)胞分裂過(guò)程中使質(zhì)粒拷貝數(shù)均等的分配到子細(xì)胞中的質(zhì)粒DNA序列。在F質(zhì)粒中par區(qū)是同復(fù)制起點(diǎn)緊密相鄰的，而在R1質(zhì)粒中則是遠(yuǎn)離其復(fù)制起點(diǎn)。質(zhì)粒的復(fù)制與分配是分開(kāi)獨(dú)立進(jìn)行的。

牛牛文庫(kù)文檔分享第34頁(yè)/共66頁(yè)在F質(zhì)粒中，par區(qū)由sopA和sopB兩個(gè)基因及sopC區(qū)組成,這三個(gè)因素是質(zhì)粒分配的基本因素,其中sopA和sopB

叫做反式作用基因(trans-actinggenes)編碼反式作用蛋白,sopC叫做順式作用位點(diǎn)(cis-actingsite)。順式作用位點(diǎn)sopC由12個(gè)43bp的正向重復(fù)序列組成,在每個(gè)43bp的正向重復(fù)序列中,又有一對(duì)7bp的反向重復(fù)序列。SopC區(qū)的功能類似于真核染色體上的著絲粒,所以

sopC區(qū)也叫類著絲粒位點(diǎn)(centrmere-likesite)。反式作用蛋白SopB與順式作用位點(diǎn)sopC區(qū)結(jié)合,形成蛋白-核酸復(fù)合體,稱為分配復(fù)合體(partitioncomplex),參與質(zhì)粒的分配。

牛牛文庫(kù)文檔分享第35頁(yè)/共66頁(yè)質(zhì)粒DNA在位于細(xì)胞中央的復(fù)制體(replisome)的作用下進(jìn)行復(fù)制。質(zhì)粒復(fù)制后,分配蛋白與類著絲粒位點(diǎn)結(jié)合形成分配復(fù)合體。然后,一種尚未知的結(jié)構(gòu)很快地將質(zhì)?？截愐葡蚣?xì)胞的兩極,使復(fù)制后的質(zhì)粒DNA均等的分配到兩個(gè)子細(xì)胞中。接著可能是在分配蛋白的作用下,使分配后的質(zhì)粒限定于細(xì)胞的特定區(qū)域。

牛牛文庫(kù)文檔分享第36頁(yè)/共66頁(yè)寄主致死體系F質(zhì)?；蚪M中控制寄主致死功能的基因ccdA

和ccdB,屬于同一個(gè)自我調(diào)節(jié)的操縱子,分別編碼分子量為8.3kDa和11.7kDa的兩種蛋白。在含質(zhì)粒的細(xì)胞中,CcdA蛋白作為解毒劑專門(mén)與毒劑CcdB蛋白結(jié)合,并使之失效。在沒(méi)有CcdA蛋白的情況下,CcdB蛋白通過(guò)抑制DNA解旋酶的活性,或是通過(guò)引發(fā)解旋酶誘導(dǎo)寄主染色體DNA發(fā)生雙鏈斷裂從而使染色體在細(xì)胞分裂過(guò)程中無(wú)法進(jìn)行正確的分配。在新產(chǎn)生的無(wú)質(zhì)粒的子細(xì)胞中,開(kāi)始的時(shí)候是含有CcdA和CcdB這兩種蛋白。但由于無(wú)ccd操縱子可發(fā)生進(jìn)一步的轉(zhuǎn)錄,因此隨后這兩種蛋白質(zhì)的濃度便逐漸下降稀釋。

牛牛文庫(kù)文檔分享第37頁(yè)/共66頁(yè)毒劑CcdB和解毒劑CcdA具有不同的穩(wěn)定性,是導(dǎo)致分裂后細(xì)胞致死的關(guān)鍵因素。也就是說(shuō),CcdA蛋白質(zhì)不穩(wěn)定,易被蛋白水解酶(protease)降解,于是較穩(wěn)定的CcdB蛋白質(zhì)便可行使其對(duì)寄主細(xì)胞的致死作用。隨機(jī)分配機(jī)制ColE1等多數(shù)高拷貝質(zhì)粒一般沒(méi)有專門(mén)的par基因，它們可以依賴于高拷貝質(zhì)粒的隨機(jī)分配來(lái)實(shí)現(xiàn)分裂過(guò)程中的穩(wěn)定性。

牛牛文庫(kù)文檔分享第38頁(yè)/共66頁(yè)4.質(zhì)粒之間的不相容性不相容性通常是指親緣關(guān)系相近的兩種質(zhì)粒，在非選擇性條件下常常不能穩(wěn)定地存在于同一個(gè)細(xì)胞中，經(jīng)過(guò)若干代的培養(yǎng)，只含有同一種質(zhì)粒的細(xì)胞越來(lái)越多，而含有兩種質(zhì)粒的細(xì)胞相對(duì)減少。兩個(gè)質(zhì)粒如果不能同時(shí)穩(wěn)定地共存于一種細(xì)菌細(xì)胞中，則這兩個(gè)質(zhì)粒屬于同一不相容群，即Incgroups；如果能夠穩(wěn)定地存在于同一種細(xì)胞內(nèi)，則它們屬于不同的不相容群。RP4和RK2為IncP質(zhì)粒，不能穩(wěn)定地共存于大腸桿菌細(xì)胞中，而RSF1010屬于IncQ，因此能與RK2共存大腸桿菌細(xì)胞中

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質(zhì)粒的不相容性與質(zhì)粒復(fù)制起始密切相關(guān)不同的不相容群的兩質(zhì)粒

牛牛文庫(kù)文檔分享第40頁(yè)/共66頁(yè)相同的不相容群的兩質(zhì)粒

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質(zhì)粒的不相容性與質(zhì)粒分配也有關(guān)系

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牛牛文庫(kù)文檔分享第43頁(yè)/共66頁(yè)5.質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移性根據(jù)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移性，質(zhì)粒可分為轉(zhuǎn)移性和非轉(zhuǎn)移性兩類轉(zhuǎn)移性質(zhì)粒是指質(zhì)粒能自動(dòng)的從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞,甚至還能帶動(dòng)供體細(xì)胞的染色體DNA向受體細(xì)胞轉(zhuǎn)移,這類質(zhì)粒常常被叫做自主轉(zhuǎn)移質(zhì)粒(self-transmissibleplasmid)。如：F質(zhì)粒。有些質(zhì)粒雖然不能自主轉(zhuǎn)移,但能被其它一些自主轉(zhuǎn)移質(zhì)粒所轉(zhuǎn)移,這類質(zhì)粒又被叫做可移動(dòng)質(zhì)粒(mobilizableplasmids)。如ColE1質(zhì)粒

牛牛文庫(kù)文檔分享第44頁(yè)/共66頁(yè)自主轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的特點(diǎn)大腸桿菌的F質(zhì)粒、R1、R100、ColV、ColIb-P9、R6k、RP4，天藍(lán)色鏈霉菌的致育質(zhì)粒SCP1和SCP2，糞鏈球菌的致育質(zhì)粒

pAD1和豌豆根瘤菌的共生質(zhì)粒pJB5JI等均屬于自主轉(zhuǎn)移質(zhì)粒。G－細(xì)菌中的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒多是低拷貝的大質(zhì)粒，其中較小的R6k質(zhì)粒也有38kb。

G＋細(xì)菌如鏈霉菌，除SCP1是巨大質(zhì)粒外，很多轉(zhuǎn)移質(zhì)粒都是10kb左右的小質(zhì)粒，而且真正參與質(zhì)粒轉(zhuǎn)移的區(qū)域只有2kb。F質(zhì)粒為代表的G-細(xì)菌的自主轉(zhuǎn)移性質(zhì)粒特點(diǎn)F質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移操縱子（tra）含23個(gè)基因，大小為33kb。

牛牛文庫(kù)文檔分享第45頁(yè)/共66頁(yè)tra基因產(chǎn)物與性菌毛形成和雜交對(duì)形成有關(guān)；有些編碼作用于oriT位點(diǎn)的核酸內(nèi)切酶；有些基因產(chǎn)物調(diào)控質(zhì)粒轉(zhuǎn)移。oriT位點(diǎn)：質(zhì)粒轉(zhuǎn)移的起點(diǎn)，質(zhì)粒必須有oriT位點(diǎn)才能自主轉(zhuǎn)移。可移動(dòng)質(zhì)粒的特點(diǎn)可移動(dòng)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移必須利用同一細(xì)胞中自主轉(zhuǎn)移質(zhì)粒編碼合成的性菌毛才能進(jìn)行。可移動(dòng)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移需要兩種元件：bom位點(diǎn)和mob基因。bom位點(diǎn)：類似于F質(zhì)粒的oriT序列mob基因：功能類似于tra基因，負(fù)責(zé)質(zhì)粒轉(zhuǎn)移。

牛牛文庫(kù)文檔分享第46頁(yè)/共66頁(yè)mob基因象許多tra基因一樣，mob基因也編碼特異的核酸內(nèi)切酶，在oriT位點(diǎn)進(jìn)行切割，還編碼其它一些與DNA轉(zhuǎn)移有關(guān)的蛋白質(zhì)可移動(dòng)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移不需要自主轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)移

牛牛文庫(kù)文檔分享第47頁(yè)/共66頁(yè)廣寄主范圍質(zhì)粒的特點(diǎn)所謂廣寄主范圍質(zhì)粒是指質(zhì)粒能通過(guò)接合轉(zhuǎn)作用轉(zhuǎn)移到很多不同種甚至不同屬的寄主內(nèi)，并能穩(wěn)定地存在于這些寄主細(xì)胞內(nèi)。IncP、IncN、IncQ、IncW組的質(zhì)粒寄主范圍廣泛，屬于廣寄主范圍質(zhì)粒(broadhostrangeplasmid)。F質(zhì)粒為窄寄主范圍質(zhì)粒。IncP組的質(zhì)粒常見(jiàn)的有RK2、RP1和RP4等IncP組的質(zhì)粒的寄主較廣,IncP質(zhì)粒自身或帶動(dòng)其它質(zhì)粒能從大腸桿菌轉(zhuǎn)移到幾乎所有的G-細(xì)菌中。IncP質(zhì)粒還能接合轉(zhuǎn)移到G+細(xì)菌、酵母、植物中。

牛牛文庫(kù)文檔分享第48頁(yè)/共66頁(yè)IncP質(zhì)粒雖然能通過(guò)接合作用轉(zhuǎn)移到酵母、植物等這些寄主中,但質(zhì)粒卻不能在這些寄主中復(fù)制,屬于轉(zhuǎn)移寄主。

牛牛文庫(kù)文檔分享第49頁(yè)/共66頁(yè)這類質(zhì)粒的大小為60kb,在大腸桿菌中的拷貝數(shù)為4～7個(gè)，oriV是質(zhì)粒的營(yíng)養(yǎng)復(fù)制區(qū),這類質(zhì)粒也具有與接合轉(zhuǎn)移有關(guān)的tra基因和oriT位點(diǎn)，含有氨芐青霉素抗性、卡那霉素抗性及四環(huán)素抗性。另外,質(zhì)粒上還攜帶有轉(zhuǎn)座子Tn1和插入序列IS21。6.克隆載體載體：人工構(gòu)建的負(fù)責(zé)將外源基因運(yùn)送到宿主細(xì)胞中并進(jìn)行復(fù)制與擴(kuò)增的運(yùn)載工具構(gòu)建載體的基本要求：

為一個(gè)獨(dú)立的復(fù)制子，含有復(fù)制位點(diǎn)，能夠自主復(fù)制

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含有多個(gè)克隆位點(diǎn)，便于外源基因的插入

含有選擇性標(biāo)記，便于對(duì)陽(yáng)性克隆篩選和鑒定

具有生物安全性6.1質(zhì)粒載體分子克隆中絕大多數(shù)的克隆載體是由質(zhì)粒經(jīng)人工修飾改造而成質(zhì)粒作為克隆載體的特點(diǎn)：1）具有獨(dú)立的復(fù)制起點(diǎn)2）具有較小的相對(duì)分子量，利于體外分子操作3）具有較高拷貝數(shù)4）具有便于選擇的標(biāo)記5）易于導(dǎo)入細(xì)胞

牛牛文庫(kù)文檔分享第51頁(yè)/共66頁(yè)克隆質(zhì)粒：快速連接外源目的片段表達(dá)質(zhì)粒：高效表達(dá)外源基因測(cè)序質(zhì)粒：又稱T-載體自殺質(zhì)粒：攜帶外源片段進(jìn)入細(xì)胞后即消解溫敏質(zhì)粒：對(duì)某種溫度敏感穿梭質(zhì)粒：在真核細(xì)胞與原核細(xì)胞間轉(zhuǎn)移載體根據(jù)研究目的分為：

牛牛文庫(kù)文檔分享第52頁(yè)/共66頁(yè)克隆質(zhì)粒pBR322

牛牛文庫(kù)文檔分享第53頁(yè)/共66頁(yè)測(cè)序質(zhì)粒成品為線性，雙鏈DNA3‘端有突出的T堿基，與由Taq酶PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接連接。在插入位點(diǎn)兩側(cè)，有多個(gè)酶切位點(diǎn)，便于后續(xù)操作。在插入位點(diǎn)兩側(cè)，有M13載體通用引物，可直接測(cè)序。

牛牛文庫(kù)文檔分享第54頁(yè)/共66頁(yè)多克隆位點(diǎn)：NcoI，多克隆位點(diǎn)表達(dá)質(zhì)粒

牛牛文庫(kù)文檔分享第55頁(yè)/共66頁(yè)核糖體結(jié)合位點(diǎn)T7噬菌體的啟動(dòng)子引物1組氨酸標(biāo)簽引物2NcoI位點(diǎn)：CCATGGNdeI位點(diǎn)：CATATG此系列載體主要用于外源蛋白在大腸桿菌的高效表達(dá)，同時(shí)表達(dá)的蛋白可用Ni-NTAAgarose進(jìn)行親和層析分離純化目的蛋白該載體使用的宿主菌為Bl21(DE3)，其染色體上克隆有T7噬菌體的RNA聚合酶，且受IPTG誘導(dǎo)。

牛牛文庫(kù)文檔分享第56頁(yè)/共66頁(yè)該載體同樣設(shè)計(jì)有核糖體結(jié)合位點(diǎn)，使用阿拉伯糖操縱子中的啟動(dòng)子，且受阻遏蛋白AraC的調(diào)控，在有阿拉伯糖存在時(shí)克隆的基因表達(dá)。

牛牛文庫(kù)文檔分享第57頁(yè)/共66頁(yè)自殺質(zhì)粒1)使用pBR322的復(fù)制子，保證質(zhì)粒的正常復(fù)制2)攜帶質(zhì)粒RK2的轉(zhuǎn)移位點(diǎn)，可以發(fā)生接合轉(zhuǎn)移3)攜帶經(jīng)改造的Tn5，使得接合轉(zhuǎn)移后發(fā)生轉(zhuǎn)座子隨機(jī)突變4)Tn5中有熒光基因，可以使突變菌株產(chǎn)熒光5)Tn5中攜帶質(zhì)粒(p15V）的復(fù)制子，可發(fā)生質(zhì)粒拯救，快速克隆Tn5插入的DNA片段

牛牛文庫(kù)文檔分享第58頁(yè)/共66頁(yè)溫敏質(zhì)粒復(fù)制子為OriR101復(fù)制蛋白R(shí)epA為溫敏突變攜帶由AraC調(diào)控的λ噬菌體重組酶系統(tǒng)由于大腸桿菌的基因敲除

牛牛文庫(kù)文檔分享第59頁(yè)/共66頁(yè)廣寄主范圍質(zhì)粒載體研究大腸桿菌以外的細(xì)菌，通常需要廣寄主范圍的質(zhì)粒載體。這樣便于在大腸桿菌中進(jìn)行基因操作，然后在轉(zhuǎn)移進(jìn)目的菌株中，進(jìn)而研究目的菌相關(guān)基因的功能。廣寄主范圍質(zhì)粒載體構(gòu)建的理論依據(jù)是自主轉(zhuǎn)移質(zhì)粒能自主轉(zhuǎn)移，并能帶動(dòng)可移動(dòng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)移。一般把RP4或RK2質(zhì)粒中DNA轉(zhuǎn)移位點(diǎn)即oriTDNA序列稱為mob-site。常用的大腸桿菌質(zhì)粒載體如pBR322、pBR325或pACYC184，既不能自主轉(zhuǎn)移也不能被高效誘動(dòng)。如果這些質(zhì)粒上帶有RP4或RK2的mob-site，則能被RP4質(zhì)粒誘動(dòng)轉(zhuǎn)移到不含質(zhì)粒的大、腸桿菌或其他細(xì)菌中。

牛牛文庫(kù)文檔分享第60頁(yè)/共66頁(yè)pK18mobsacB復(fù)制子pMB1，oriV質(zhì)粒RP4的mob-site枯草芽孢桿菌的sacB:提供負(fù)篩選標(biāo)記，即革蘭氏陰性細(xì)菌如果攜帶此基因，在5%蔗糖