藥物靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)與篩選課件

藥物靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)與篩選基因靶標(biāo)核糖核酸靶標(biāo)蛋白靶標(biāo)一、基因靶標(biāo)1、在基因數(shù)據(jù)庫中搜尋藥物靶標(biāo)

（1）表達(dá)序列標(biāo)志(expressedsequencetag,EST)數(shù)據(jù)庫（2）歸納邏輯設(shè)計(jì)程序EST是從一個隨機(jī)選擇的cDNA克隆進(jìn)行5’端和3’端單一次測序獲得的短的cDNA部分序列,代表一個完整基因的一小部分,在數(shù)據(jù)庫中其長度一般從20到7000bp不等,平均長度為360±120bp。EST來源于一定環(huán)境下一個組織總mRNA所構(gòu)建的cDNA文庫,因此EST也能說明該組織中各基因的表達(dá)水平。首先從樣品組織中提取mRNA,在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下用oligo(dT)作為引物進(jìn)行RT-PCR合成cDNA,再選擇合適的載體構(gòu)建cDNA文庫,對各菌株加以整理,將每一個菌株的插入片段根據(jù)載體多克隆位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行兩端一次性自動化測序,這就是EST序列的產(chǎn)生過程。Copyrightrestrictionsmayapply.Kim,J.-M.etal.DNARes200613:275-286;doi:10.1093/dnares/dsl016ImmunohistochemicalstainingforTHandalpha-tubulinintheSNofanMPTPmicemodelTHalpha-tubulinCopyrightrestrictionsmayapply.CelldeathactivityofdifferentiallyexpressedgenesinPDUpregulatedgenesDownregulatedgenesAminoAcidSequencesofOrexins(食欲素)andOrexinReceptors(A)Structuresofmatureorexin-Aand-BpeptidesCell1998;92(4):573-585

Localizationof

prepro-orexinmRNAandImmunoreactivePeptideinAdultRatBrain

Cell1998;92(4):573-585Up-Regulationofprepro-orexinmRNAinFastedRatsCell1998;92(4):573-585一、基因靶標(biāo)2、基因芯片技術(shù)（1）普通基因芯片（2）ChIP-DSL（couplingChIPwithaDNAselectionandligationstrategy），芯片/DNA選擇結(jié)扎技術(shù)INH(異煙阱)-inducedmRNAexpressionprofilesmonitoredbymicroarrayhybridizationanalysis.用INH處理INH敏感的結(jié)核菌株(紅:INH處理的;綠:INH未處理的)PNAS1999;96(22):12833-12838.

用INH處理INH耐藥的結(jié)核菌株用乙硫異煙胺處理INH耐藥的結(jié)核菌株TemporalproINH-inducedexpressionofselectedgenes.PNAS1999;96(22):12833-12838.RolesofINH-inducedgenesinthecontextofaproposedpathwayformycolicacid(結(jié)核環(huán)脂酸)biosynthesis.PNAS1999;96(22):12833-12838.

E2-inducedgeneexpressionandthebiologicalrelevanceofdirectERtargetgenesPNAS2007;104（2):4852-4857

E2-inducedgeneexpressionandthebiologicalrelevanceofdirectERtargetgenesPNAS2007;104（2):4852-4857

一、基因靶標(biāo)3、基因敲除（knock-out)技術(shù)Aglutamatesynapse.TrendsPharmacolSci.2005;26(6):283-286

GMS:修飾后的NMDA受體FlowchartoftheKnockoutStrategyCurrBiol.2005;15(18):1663-1669

mde2IsRequiredforSegregationofHomologousCentromeresduringMeiosisICurrBiol.2005;15(18):1663-1669

CurrBiol.2005;15(18):1663-1669

Double-Strand-BreakFormationIsStronglyReducedinmde2Δ

一、基因靶標(biāo)4、檢測報告基因把靶基因表達(dá)的調(diào)控序列與編碼某種酶活性的基因相連轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi),通過簡單地檢測酶活性的變化,就可以反映化合物對轉(zhuǎn)錄因子和基因表達(dá)的作用性質(zhì)和程度。這種能間接反映基因轉(zhuǎn)錄水平的編碼某種酶活性的基因稱為報告基因。PhosphorylationofsignalingproteinsincellstreatedwithSB247464

orG-CSF.Science.1998;281(5374):257-259

ThemurineG-CSFreceptorconfersresponsivenesstoSB247464.Science.1998;281(5374):257-259未轉(zhuǎn)染受體轉(zhuǎn)染CSF受體GranulocyticcolonyformationinresponsetoSB247464

invitro.GranulopoieticactivityofSB247464

invivo.Science.1998;281(5374):257-259一、基因靶標(biāo)5、低等生物功能基因組篩選

DrugentryrouteintoC.elegans(秀麗隱桿線蟲)NatRevDrugDiscov2006;5:387-398TheserotonergicsynapseofC.elegans.NatRevDrugDiscov2006;5:387-398OverviewoftheRNAinterferencesupportedtargetidentificationprocessNatRevDrugDiscov2006;5:387-398

ChemicalgeneticsasatoolfortargetsiteidentificationNatRevDrugDiscov2006;5:387-398

ChemicalgeneticsasatoolfortargetsiteidentificationNatRevDrugDiscov2006;5:387-398ProcNatlAcadSciUSA.2006;103(27):10414-10419CuringofanematodeE.faecalisinfectiononsolidmediumbyantibiotictreatmentTet:四環(huán)素Cipro:萬古霉素Van:環(huán)丙沙星ProcNatlAcadSciUSA.2006;103(27):10414-10419TheliquidinfectionassaygaugesdifferencesinnematodekillingduetoE.faecalisstrainswithvaryingdegreesofpathogenicityorduetoantibiotictreatment.Cyl:溶細(xì)胞素Amp:氨芐青霉素Scoringlive/deadwormsintheliquidkillingassay

ProcNatlAcadSciUSA.2006;103(27):10414-10419二、核糖核酸靶標(biāo)1、核酶技術(shù)

核酶(ribozyme)

核酶:用于描述具有催化活性的RNA,即化學(xué)本質(zhì)是核糖核酸(RNA)，卻具有酶的催化功能。

●內(nèi)含子(intron)內(nèi)含子是基因內(nèi)的間隔序列，它不出現(xiàn)在成熟的RNA分子中，也就是說在轉(zhuǎn)錄后要通過加工被切除。●外顯子(exon)最后出現(xiàn)在成熟RNA中的基因序列?！窈嗣傅陌l(fā)現(xiàn):1981年，ThomasCech和他的同事在研究四膜蟲的26SrRNA前體加工去除基因內(nèi)含子時獲得一個驚奇的發(fā)現(xiàn)∶內(nèi)含子的切除反應(yīng)發(fā)生在僅含有核苷酸和純化的26SrRNA前體而不含有任何蛋白質(zhì)催化劑的溶液中，可能的解釋只能是:內(nèi)含子切除是由26SrRNA前體自身催化的，而不是蛋白質(zhì)?！窈嗣傅淖C實(shí)為了證明這一發(fā)現(xiàn)，他們將編碼26SrRNA前體DNA克隆到細(xì)菌中并在無細(xì)胞系統(tǒng)中轉(zhuǎn)錄成26SrRNA前體分子。結(jié)果發(fā)現(xiàn)這種人工制備的26SrRNA前體分子在沒有任何蛋白質(zhì)催化劑存在的情況下，切除了前體分子中的內(nèi)含子。這種現(xiàn)象稱為自我剪接(self-splicing)，這是人類第一次發(fā)現(xiàn)RNA具有催化化學(xué)反應(yīng)的活性，具有這種催化活性的RNA稱為核酶。ThomasCech因發(fā)現(xiàn)了核酶而獲得1989年諾貝爾化學(xué)獎。內(nèi)含子的切除:核酶的作用機(jī)理

除了rRNA前體中有內(nèi)含子,tRNA和mRNA前體中都有內(nèi)含子的存在,這些內(nèi)含子都要通過加工被切除,才能得到成熟的rRNA、tRNA或mRNA。雖然這些RNA中內(nèi)含子切除的機(jī)理各不相同,但都涉及到核酶的作用。核剪接(nuclearsplicing)

真核生物的結(jié)構(gòu)基因中一般都含有內(nèi)含子，轉(zhuǎn)錄后，從pre-mRNA中將內(nèi)含子切除，然后將外顯子重新連接成一個成熟的mRNA的過程稱為RNA剪接(RNAsplicing)。

雞的卵清蛋白基因中有7個內(nèi)含子，轉(zhuǎn)錄后需要被切除，8個外顯子連接起來形成有功能的mRNA。雞的卵清蛋白基因初始RNA轉(zhuǎn)錄物的剪接

核酶種類:發(fā)卡狀核酶錘頭狀核酶I型內(nèi)含子核酶RnaseP核酶丁型肝炎病毒核酶RibozymedesignandgeneactivationNucleicAcidsRes.2002;30(24):e141

Ribozyme-mediatedphenotypealterationonindicatormedia.NucleicAcidsRes.2002;30(24):e141

Testfortarget-independentgrowthonselectivemedia.NucleicAcidsRes.2002;30(24):e141RelativegrowthrateofstrainsexpressingribozymeswithDTAsequencesasthe3′exonNucleicAcidsRes.2002;30(24):e141二、核糖核酸靶標(biāo)2、反義寡核苷酸

反義寡核苷酸(antisenseoligonucleotide,asON)人工合成的，與靶基因或mRNA某一區(qū)段互補(bǔ)的核酸片斷，可以通過堿基互補(bǔ)原則結(jié)合于靶基因/mRNA上,從而封閉基因的表達(dá)。包括：反義DNA，反義RNA，其來源可有人工合成和體內(nèi)表達(dá)兩類。

反義寡核苷酸可用于基因沉默，所以是一種研究基因功能的重要工具。大多數(shù)藥物屬于靶標(biāo)基因（或疾病基因）的抑制劑，因此反義寡核苷酸模擬了藥物的作用，這功能丟失（LOF)的研究方法比傳統(tǒng)的功能獲得（GOF)方法更具優(yōu)勢。同時，那些在靶標(biāo)實(shí)驗(yàn)中證明有效的反義寡核苷酸本身還可以被進(jìn)一步開發(fā)成為反義寡核苷酸藥物。

Table1.

PS-ODNstargetingtheM.tuberculosis30,32A,and32Bprotein(分枝?；D(zhuǎn)移酶)genetranscripts

mRNAtarget5'

3'PS-ODN5'

3'30-kDaprotein

30:1–24AATCTTTCGGCTCACGTCTGTCAT

30:HP2/HP1GCGCATATGCGCAATCTTTCGGCTCACGTCTGTCATGCGCGCGC

30:1–24-MMAtTCaTTtGGtTCtCGaCTcTCtT

30:HP2/HP1-MMGCGCATATGCGCAtTCaTTtGGtTCcCGaCTcTCtTGCGCGCGC32A-kDaprotein

32A:1–24ACGAACCCTGTCAACAAGCTGCAT

32A:HP2/HP1GCGCATATGCGCACGAACCCTGTCAACAAGCTGCATGCGCGCGC

32A:1–24-MMAgGAtCCtTGaCAtCAtGCaGCtT

32A:HP2/HP1-MMGCGCATATGCGCAtGAtCCaTGcCAgCAtGCaGCtTGCGCGCGC32B-kDaprotein

32B:1–24TCGCACCTGTTCGAAGAACGTCAT

32B:HP2/HP1GCGCATATGCGCTCGCACCTGTTCGAAGAACGTCATGCGCGCGC

32B:1–24-MMTgGCtCCaGTaCGtAGtACcTCtT

32B:HP2/HP1-MMGCGCATATGCGCTgGCtCCaGTaCGtAGtACcTCtTGCGCGCGCPS-ODNs:antisensephosphorothioateoligodeoxyribonucleotides;MM:錯配的核苷酸HPS-ODNs:5`-,3`-hairpin-modifiedPS-ODNs發(fā)夾修飾的反義寡核苷酸InhibitionofM.tuberculosisgrowthbyantisenseHPS-ODNsspecificforthe30/32-kDaproteingenecomplex.ProcNatlAcadSciUSA.2007;104(17):7199-7204SpecificinhibitionofproteinsynthesisbyantisenseHPS-ODNs.ProcNatlAcadSciUSA.2007;104(17):7199-7204Inhibitionof30,32A,and32BproteingenetranscriptsynthesisProcNatlAcadSciUSA.2007;104(17):7199-7204HPS-ODNinhibitionofM.tuberculosismultiplicationinhumanmacrophagesProcNatlAcadSciUSA.2007;104(17):7199-7204二、核糖核酸靶標(biāo)3、RNA干擾技術(shù)

轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)抑制現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)＋CHSGene矮牽?；?Jorgensen,R,1990)CHS:與色素合成相關(guān)的酶,以加深花的顏色RNAi現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)線蟲（C.elegans)(AndrewFire,1998)+Par-1GeneDisruptionExpressionDownDoubleStrandRNA線蟲，果蠅微生物，植物

失敗的原因:在合成反義RNA時存在技術(shù)問題,用于注射的正義和反義RNA中都混有少量雙鏈RNAdsRNADicercleavageofdsRNAsiRNARNAi抑制基因表達(dá)的機(jī)理siRNAassociatedWithRISCcomplexCellMembrane5’POH3’TargetmRNADicer:是一種核酸酶,將雙鏈RNA降解成21-23bp的小干擾RNARISC:RNA誘導(dǎo)的沉默小體,他是由單鏈siRNA與一些蛋白形成的復(fù)合體RNA干擾(RNAinterference,RNAi)RNAi是將一段雙鏈的RNA序列導(dǎo)入機(jī)體或細(xì)胞中,機(jī)體或細(xì)胞中與之有同源序列的基因的表達(dá)將會受到抑制,甚至表達(dá)受到完全抑制DecreasedhumanMKexpressioninPC-3cellstransfectedwithvarioussiRNAsCancer.2006;107(4):864-873

MK:肝素結(jié)合細(xì)胞因子EffectoftreatmentwithMKsiRNAcombinedwithPTX(紫杉醇)onPC-3cellviabilityandanchorage-independentgrowthCancer.2006;107(4):864-873

PTX:siRNA-SCR:亂序siRNSDeterminationofasuitabledoseandthedurationofthesiRNAtodownregulateMKinPC-3xenograftsCancer.2006;107(4):864-873

AntitumoreffectofMKsiRNAinPC-3xenografts.Cancer.2006;107(4):864-873

三、蛋白質(zhì)靶標(biāo)1、抗體和胞內(nèi)抗體

抗體除對組織和細(xì)胞中特異性抗原進(jìn)行定位外，尚有強(qiáng)大的中和能力阻斷蛋白質(zhì)功能。對于細(xì)胞內(nèi)的靶分子，需要以合適的方式將抗體導(dǎo)入細(xì)胞。顯微注射是一種將抗體注入細(xì)胞的方式，但是這種方式難以做到高通量，影響了藥物靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)驗(yàn)證的速度。為了滿足高通量研究的需要，Moris創(chuàng)建了一套化學(xué)試劑方法將抗體導(dǎo)入細(xì)胞，而抗體的功能和細(xì)胞的活性不受影響。另一種將抗體導(dǎo)入細(xì)胞的方式是讓抗體在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)(intrabodies)，其中包括使用滅活病毒的方法。Abispecific,tetravalentintradiabodyJBiolChem.2003;278(48):47812-47819IntrabodyandTie-2/VEGF-R2colocalizationonHUVECJBiolChem.2003;278(48):47812-47819A,kineticsofsurfaceexpressionofTie-2andVEGF-R2aftergenetransferoftheintradiabodyandconventionalscFvintrabodiesonHUVECusingrecombinantadenoviruseswithanMOIof10B,genetransferofintrabodiesdirectedtohumanTie-2,VEGF-R2,orTie-2/VEGF-R2byrecombinantadenovirusesonday6afterinfectionJBiolChem.2003;278(48):47812-47819Inhibitionofcapillarytubeformationinvitro

JBiolChem.2003;278(48):47812-47819

三、蛋白質(zhì)靶標(biāo)2、生色團(tuán)輔助激光滅活(chromophore-assistedlaserinactivation,CALI)

CALl能夠直接對蛋白質(zhì)進(jìn)行操作，而不是通過對蛋白質(zhì)量的變化進(jìn)行檢測。將標(biāo)記有孔雀綠染料的非功能滅活抗體與特異性蛋白質(zhì)結(jié)合，然后對蛋白質(zhì)復(fù)合物進(jìn)行激光照射。染料受激光激發(fā)短暫的產(chǎn)生活性分子，對結(jié)合的蛋白質(zhì)造成破壞而起到滅活作用，但不影響其他蛋白質(zhì)組分。AlentiviralsystemforsimultaneousknockdownandrescuewithafunctionalEGFP-fusioncomplement.ProcNatlAcadSciUSA.2007;104(16):6702-6707CALIofEGFP-CPinducestheformationofdorsalrufflesandfilopodiaonlyintheknockdown/rescuebackground.ProcNatlAcadSciUSA.2007;104(16):6702-6707CALIofEGFP-CPinKDRcellsgeneratesalocalincreaseinbarbedendsofactinfilamentsanddorsalF-actin.

ProcNatlAcadSciUSA.2007;104(16):6702-6707CALIofEGFP-MenainMena/VASP-deficientcellsinducesmorestablelamellipodialprotrusionsProcNatlAcadSciUSA.2007;104(16):6702-6707三、蛋白質(zhì)靶標(biāo)3、蛋白質(zhì)組技術(shù)

基因基因是一段DNA（脫氧核糖核酸分子）雙鏈。－堿基成對出現(xiàn):ATCGGCCTAGCCGG基因表達(dá)中的信息流中心法則（TheCentralDogma）蛋白質(zhì)翻譯蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的層次一級結(jié)構(gòu)

-氨基酸序列二級結(jié)構(gòu)

-主要由氫鍵穩(wěn)固的局部構(gòu)象，如-helix,-sheet等三級結(jié)構(gòu)

-三維構(gòu)象四級結(jié)構(gòu)

-多個多肽鏈的組合蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的圖形描述分子表面

-分子可視化

-分子對接

-基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)

-…蛋白質(zhì)組分析的首要要求將來自于全細(xì)胞、組織或生物體中所包含的多達(dá)幾千種混合蛋白質(zhì)進(jìn)行分離、檢測和分析。2-DE技術(shù)依然是大多數(shù)蛋白質(zhì)組研究中分離復(fù)雜蛋白質(zhì)混合物的首選技術(shù)。生物學(xué)問題的提出實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷脑O(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)組和對照組樣品的制備蛋白樣品的IEF和PAGE電泳分離圖像掃描和初步分析感興趣蛋白點(diǎn)的切取胰酶對脫色后蛋白質(zhì)的消化質(zhì)譜的多肽指紋圖、微測序分析質(zhì)譜結(jié)果的生物信息學(xué)分析和比對新蛋白質(zhì)的發(fā)現(xiàn)其它實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步驗(yàn)證蛋白信息的初步獲得蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)路線蛋白質(zhì)樣品的制備雙向電泳圖像分析轉(zhuǎn)印至膜上的蛋白凝膠中的蛋白溶液中的蛋白混合肽蛋白質(zhì)質(zhì)量N端測序肽序列質(zhì)譜數(shù)據(jù)肽指紋圖數(shù)據(jù)搜索新的或已知蛋白蛋白轉(zhuǎn)錄后修飾的鑒定蛋白質(zhì)二維電泳：蛋白質(zhì)提取樣品前處理一向等電聚焦二向SDS—PAGE凝膠銀染及掃描雙向電泳分析軟件分析差異蛋白質(zhì)點(diǎn)的質(zhì)普分析生物信息數(shù)據(jù)查詢、建立蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫雙向電泳分析中的樣品制備制備原則：應(yīng)使所有待分析的蛋白樣品全部處于溶解狀態(tài)（包括多數(shù)疏水性蛋白），且制備方法應(yīng)具有可重現(xiàn)性。防止樣品在聚焦時發(fā)生蛋白的聚集和沉淀。防止在樣品制備過程中發(fā)生樣品的抽提后化學(xué)修飾（如酶性或化學(xué)性降解等）。完全去除樣品中的核酸和某些干擾蛋白。盡量去除起干擾作用的高豐度或無關(guān)蛋白，從而保證待研究蛋白的可檢測性?？扇苄詷悠?/p>

固體組織樣品

細(xì)胞不同樣品的基本處理方法樣品的分級處理通過采用亞細(xì)胞分級、液相電泳和選擇性沉淀等方法對蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行分級處理，可降低樣品的復(fù)雜性并富集低豐度蛋白質(zhì)。當(dāng)前最簡單有效的處理是采用分級抽提，按樣品溶解度不同進(jìn)行分離。樣品的溶解是2-DE成功分離蛋白質(zhì)的最關(guān)鍵因素之一。溶解的目標(biāo)：1、樣品中非共價結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合物和聚積體完全破壞，從而形成各個多肽的溶解液（否則樣品中結(jié)合牢固的蛋白復(fù)合物可能使2-DE中出現(xiàn)新的蛋白點(diǎn)，相應(yīng)的表示單個多肽的點(diǎn)的強(qiáng)度會下降）；2、溶解方法必須允許可能干擾2-DE分離的鹽、脂類、多糖和核酸等物質(zhì)的去除；3、溶解方法要保證樣品在電泳過程中保持溶解狀態(tài)。增加樣品溶解性的手段變性劑：通過改變?nèi)芤褐械臍滏I結(jié)構(gòu)使蛋白質(zhì)充分伸展，將其疏水中心完全暴露，降低接近疏水殘基的能量域。其典型代表是尿素和硫尿。表面活性劑：經(jīng)過變性劑處理而暴露蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)后，還常需至少一種表面活性劑來溶解疏水基團(tuán)。常用的表面活性劑有離子去污劑SDS、非離子去污劑TritonX-100和NP-40、兩性離子去污劑CHAPS、OBG等。其中CHAPS和SB3-10最好。還原劑：在變性劑和表面活性劑聯(lián)用條件下，加用還原劑可使已變性的蛋白質(zhì)展開更完全，溶解更徹底。常用含自由巰基的DTT或-巰基乙醇，以及不帶電荷的三丁基膦（TBP）進(jìn)行還原。起載體作用的兩性電解質(zhì)：即便在變性劑和表面活性劑存在的情況下，某些蛋白質(zhì)也需要在鹽離子的作用下才能保持其處于溶解狀態(tài)，否則這些蛋白質(zhì)在其處于PI點(diǎn)時會發(fā)生沉淀。Carrierampholytes的作用在于捕獲樣品中的少量鹽分，從而保證蛋白質(zhì)的溶解性。應(yīng)用時，兩性電解質(zhì)的濃度應(yīng)小于0.2％（w/v)。濃度過高會使IEF的速度降低。另外，為了保證實(shí)驗(yàn)的精確性，在選擇不同pH范圍的IPG膠條時，也應(yīng)使兩性電解質(zhì)的pH值與之相符合。樣品中核酸的去除對電泳的影響：增加樣品粘度、與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物后會出現(xiàn)假象遷移和條紋。解決方法：用適量純的不含蛋白酶的核酸內(nèi)切酶進(jìn)行降解，或是利用合成載體兩性電解質(zhì)（SCA）同核酸結(jié)合形成復(fù)合物的能力，再通過超速離心來去除復(fù)合物。亞蛋白質(zhì)組樣品的制備用超離心技術(shù)分離出細(xì)胞器、質(zhì)膜和細(xì)胞核等成分，再用適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)溶解液進(jìn)行溶解。其優(yōu)點(diǎn)是不僅大大減少樣品的復(fù)雜性，而且可對分離的蛋白質(zhì)進(jìn)行亞細(xì)胞定位。但該法需要專業(yè)儀器，有時會出現(xiàn)假陽性。順序抽提法：根據(jù)細(xì)胞蛋白溶解性的差異，用具有不同溶解能力的蛋白溶解液進(jìn)行抽提的方法。第一步：用Tris堿溶液裂解細(xì)胞提取高溶解性蛋白；第二步：把未溶解的pellet用標(biāo)準(zhǔn)IEF樣品液溶解提取高疏水性蛋白；第三步：用含復(fù)合表面活性劑的蛋白溶解液，最后抽提前兩次抽提后不能溶解的膜蛋白約占整個樣品的11%（W/W）。特殊樣品的制備

低豐度蛋白的分離：盡管增加上樣量和提高總蛋白的溶解度能增加分離時的低豐度蛋白的量，但同時增加了高豐度蛋白的負(fù)荷，且造成蛋白的疊加效應(yīng)而影響分離?，F(xiàn)常用預(yù)分級＋窄pH膠的微制備技術(shù)進(jìn)行分離：即將總蛋白組分成蛋白質(zhì)組亞群，再用pH梯度小于2個pH單位的IPG膠進(jìn)行窄pH范圍的分離。

強(qiáng)堿性蛋白質(zhì)（如核糖體）的處理：先將蛋白預(yù)處理以富集，再用特殊pH梯度的IPG膠條（如pH3－12、4-12或10-12）進(jìn)行等電聚焦。其中窄范圍堿性IPG膠（如pH10-12）的挑戰(zhàn)是克服反向、陰極向陽極、電滲流和水平條紋模式，而寬范圍的堿性IPG膠（如pH3-12、4-12）等消除了窄范圍膠所需要的專門水化液。極端分子量的蛋白質(zhì)：小于8kD和大于200kD的蛋白在常規(guī)IPG-2D上不易看到，這可能是在Tris/glycine緩沖液中，樣品和游離的dodelcylsulfateions持續(xù)積累濃縮，與小分子量的蛋白質(zhì)發(fā)生對流混合，產(chǎn)生茸毛狀的或模糊的帶，從而降低小蛋白的分辨率；在膠底端，高濃度的十二磺酸使蛋白固定致染色困難。至于高分子量蛋白少的原因可能是在變性條件下，蛋白質(zhì)復(fù)合物變成了多肽，或者可能是大分子。垂直板凝膠電泳裝置加樣樣品遷移方向電泳過程中分子遷移的規(guī)律，小分子走在前頭，大分子滯后。電泳凝膠相當(dāng)于凝膠過濾中的一個帶孔膠粒?；旌蠘悠穾Э啄z

按分子大小分離電泳方向

電泳

小分子大分子夾在兩塊玻璃板之間的凝膠

電泳緩沖液

電泳緩沖液

加在槽中的經(jīng)SDS處理的樣品分子量小分子量大電源電泳后的凝膠經(jīng)考馬斯亮籃染色、脫色后的凝膠照片標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量未知蛋白在一定的凝膠濃度下，多肽鏈分子量的對數(shù)與多肽鏈的相對遷移率成線性關(guān)系，所以可以通過標(biāo)準(zhǔn)曲線求未知多肽鏈分子量。

相對遷移率水平式電泳裝置電泳緩沖液凝膠B.等電聚焦電泳（IFE）

利用聚丙烯酰胺凝膠內(nèi)的緩沖液在電場作用下沿電場方向在凝膠內(nèi)制造一個pH梯度。每種蛋白質(zhì)都將遷移至與它的pI相一致的pH處。凝膠中加有兩性電解質(zhì)溶液（pH9-3）

加電場后在凝膠內(nèi)形成一個穩(wěn)定pH梯度

加樣品，然后繼續(xù)電泳凝膠染色表明樣品按照各自pI值沿著pH梯度分布等電聚焦電泳進(jìn)行過程中等電聚焦電泳結(jié)束后（＋）（＋）（－）（－）高pH高pH低pH低pHC.雙向電泳第一向：等電聚焦電泳第二向：SDS雙向電泳后的凝膠經(jīng)染色后蛋白呈現(xiàn)二維分布圖：水平方向反映出蛋白在pI上的差異，垂直方向反映出它們在分子量上的差別。第一向電泳：等電聚焦電泳聚焦后凝膠放置在SDS凝膠上，進(jìn)行第二向電泳第二向電泳：SDS分子量大分子量小pH9pH3pH9pH3大腸桿菌全蛋白提取液雙向電泳凝膠染色后照片蛋白質(zhì)的膠內(nèi)酶切包括感興趣蛋白點(diǎn)的挖取、含蛋白質(zhì)凝膠的脫色、膠內(nèi)蛋白質(zhì)的酶切等過程質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定的基本流程樣品制備與IPG膠條水化IPG電泳與上樣緩沖液浸潤SDS轉(zhuǎn)PVDF膜膠內(nèi)直接染色染色取出蛋白點(diǎn)胰酶等消化濃縮于多孔吸附柱上MALDI-MS肽指紋圖數(shù)據(jù)庫查詢蛋白質(zhì)鑒定已知反向HPLC分離MALDI-MS，PSD片段分析示知ESI-MS-MS、微測序?qū)嶒?yàn)方法完整蛋白質(zhì)（如凝膠分離或色譜純化蛋白質(zhì)）肽混合物質(zhì)譜測定肽質(zhì)量（MALDI-MS,ESI-MS)選擇肽段裂解PSD-MALDI-MS,ESI-MS/MS)計(jì)算方法蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫（＋核酸序列翻譯數(shù)據(jù)庫）肽質(zhì)量檢索：片1.ppt

未解析碎片離子檢索：片2.ppt酶切質(zhì)譜鑒定蛋白質(zhì)的策略體外pmol[32P]蛋白質(zhì)標(biāo)記蛋白質(zhì)分離蛋白酶切2D磷酸化做圖LC-ESI-MS或MALDI-MSLC-ESI-MSHPLCIMAC磷酸化氨基酸分析體內(nèi)[32P]細(xì)胞標(biāo)記蛋白酶切2D磷酸化做圖相關(guān)分析磷酸化位點(diǎn)分析策略非變性2D：兩向均在非變性條件下進(jìn)行，這樣分離的蛋白質(zhì)點(diǎn)的等電點(diǎn)和表觀分子量同生理?xiàng)l件下獲得的這些蛋白的值是一樣的；非變性/SDS-2D：第一向采用非變性IEF，之后在2%SDS溶液中平衡；第二向也在SDS存在的條件下進(jìn)行。適于分析非共價鍵連接的蛋白－蛋白間的相互作用。非變性/還原/SDS-2D：非變性條件下IEF聚焦，之后用8M尿素＋5%β-ME＋2%SDS進(jìn)行平衡，再進(jìn)行第二向SDS-PAG電泳。此時分離的蛋白質(zhì)點(diǎn)可進(jìn)行點(diǎn)的切取、蛋白酶消化、MALDI-TOF-MS分析鑒定，提供關(guān)