【課件】基因工程的基本操作程序高二下學(xué)期生物人教版選擇性必修3

課前回顧1.重組DNA技術(shù)的基本工具？工具酶？2.限制酶的來源？作用？作用的化學(xué)鍵？結(jié)果？3.DNA連接酶的作用？作用的化學(xué)鍵？種類？4.載體的種類？作為載體需要的條件？5.什么是質(zhì)粒？6.DNA粗提取的原理？鑒定的原理？方法步驟？1994年郭三堆培育出轉(zhuǎn)基因棉花植株，使中國成為繼美國之后，世界第二個(gè)擁有自主知識產(chǎn)權(quán)轉(zhuǎn)基因抗蟲棉國家。這不僅打破了美國的壟斷，保護(hù)了民族利益，而且為我國農(nóng)業(yè)高新技術(shù)在國際競爭中爭得了一席之地。郭三堆

1997年，我國政府首次批準(zhǔn)商業(yè)化種植轉(zhuǎn)基因抗蟲棉。到2015年，我國已育成轉(zhuǎn)基因抗蟲棉新品種100多個(gè)，減少農(nóng)藥用量40萬噸，增收節(jié)支社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益450億元。第三章

基因工程第2節(jié)

基因工程的基本操作程序目的基因的篩選與獲取基因表達(dá)載體的構(gòu)建將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞目的基因的檢測與鑒定有了目的基因，我們才能賦予一種生物以另一種生物的遺傳特性。使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并可進(jìn)行遺傳、表達(dá)和發(fā)揮作用。載體進(jìn)入受體細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)，才能實(shí)現(xiàn)一種生物的基因在另一種生物中的轉(zhuǎn)化。才能確定目的基因是否真正在受體細(xì)胞中穩(wěn)定遺傳和正確表達(dá)。基因工程的基本操作程序（4個(gè)步驟）第一步：目的基因的篩選與獲取1.目的基因的定義：

用于__________________或___________________等的基因。改變受體細(xì)胞性狀獲得預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物編碼蛋白質(zhì)的基因2.目的基因的類型：主要是指___________________。與生物抗逆性相關(guān)的基因與優(yōu)良品質(zhì)相關(guān)的基因與生物藥物和保健品相關(guān)的基因與毒物降解相關(guān)的基因與工業(yè)用酶相關(guān)的基因等資料：

通過產(chǎn)生蘇云金桿菌伴胞晶體蛋白（

），破壞鱗翅目昆蟲的消化系統(tǒng)來殺死棉鈴蟲。科學(xué)家將“殺蟲基因”（Bt抗蟲蛋白基因，簡稱

）轉(zhuǎn)入棉花中，使棉花產(chǎn)生Bt抗蟲蛋白抵抗蟲害。Bt抗蟲蛋白蘇云金桿菌Bt基因3.目的基因的篩選：從相關(guān)的

和

中進(jìn)行篩選是較為有效的方法之一。已知結(jié)構(gòu)功能清晰的基因蘇云金桿菌的殺蟲作用于Bt基因有關(guān)掌握了Bt基因的序列信息對Bt基因的表達(dá)產(chǎn)物-Bt抗蟲蛋白有較為深入的了解蘇云金桿菌制劑可防治棉花蟲害Bt基因是培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的目的基因3.目的基因的篩選：測序技術(shù)序列數(shù)據(jù)庫(如GenBank)序列比對工具(如BLAST)測定核酸和蛋白質(zhì)序列以堿基順序或氨基酸殘基順序?yàn)榛緝?nèi)容的分子生物信息數(shù)據(jù)庫把感興趣的序列跟已經(jīng)存在的序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較的工具。通過比對識別相關(guān)的序列，從而能獲得目的基因和蛋白質(zhì)的功能。為找到合適的目的基因提供了更多的機(jī)會(huì)和可能越來越多的基因的結(jié)構(gòu)和功能為人們所知，4.目的基因的獲取：（1）從生物組織中直接獲取“鳥槍法”，又叫“散彈射擊法”（2）化學(xué)方法直接人工合成化學(xué)合成法：在明確目的基因堿基序列的基礎(chǔ)上，利用DNA合成儀自動(dòng)化合成所需的DNA片段?僅適用于較短的DNADNA合成儀【思考】若不明確基因堿基序列呢？蛋白質(zhì)氨基酸序列mRNA序列基因序列

反轉(zhuǎn)錄法4.目的基因的獲?。海?）從生物組織中直接獲取“鳥槍法”，又叫“散彈射擊法”（2）化學(xué)方法直接人工合成（3）從基因文庫中獲取目的基因

將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，結(jié)合質(zhì)粒導(dǎo)入受體菌群體中儲存，這個(gè)受體菌群就是該生物的基因文庫。（4）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因1.PCR的中文全稱：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)2.原理：DNA半保留復(fù)制3.操作環(huán)境：體外（PCR擴(kuò)增儀/PCR儀）PCR反應(yīng)需要在一定的緩沖溶液中進(jìn)行。4.條件：資料：真核生物和細(xì)菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。

因此，PCR反應(yīng)緩沖溶液中一般要添加

。Mg2+參與的組分在DNA復(fù)制中的作用【回顧】DNA復(fù)制所需要的條件打開DNA雙鏈提供DNA復(fù)制的模板合成DNA子鏈的原料催化合成DNA子鏈解旋酶DNA兩條母鏈4種脫氧核苷酸DNA聚合酶引物使DNA聚合酶能夠從引物3′端連接脫氧核苷酸【思考】什么是引物？引物是一小段能與DNA母鏈的一小段堿基序列互補(bǔ)配對的

。短單鏈核酸解旋酶DNA的合成方向總是從子鏈的5＇端向3＇端延伸。5＇端3＇端5＇端3＇端由于DNA雙鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械?，所以需?/p>

引物。2種4.基本條件：利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因DNA模板4種脫氧核苷酸與兩條模板鏈結(jié)合的2種引物耐高溫的DNA聚合酶用于PCR的引物長度通常為20~30個(gè)核苷酸實(shí)際加入的是dATPdGTPdCTPdTTP（既可作為合成DNA子鏈的原料，又可為DNA的合成提供能量）（TaqDNA聚合酶）PPP堿基脫氧核糖~~（A、G、C、T）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因5.PCR過程：利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因5.PCR過程：3’5’3’5’3’5’3’5’A.變性當(dāng)溫度上升到

時(shí)，雙鏈DNA解聚為單鏈B.復(fù)性當(dāng)溫度下降到

時(shí)，兩種引物通過堿基互補(bǔ)配對與兩條單鏈DNA結(jié)合C.延伸當(dāng)溫度上升到

時(shí)，溶液中的4種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則合成新的DNA鏈3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’90℃以上50℃左右72℃左右【思考】復(fù)性的過程一定是引物與DNA模板鏈結(jié)合嗎？復(fù)性時(shí)引物與DNA模板的結(jié)合是隨機(jī)的，也存在解開的兩條DNA單鏈的結(jié)合，但兩條模板鏈重新結(jié)合的概率較低，原因:①模板鏈一般比較長，比引物復(fù)雜得多，重新結(jié)合的概率較低。②加入引物的量足夠多，而模板鏈數(shù)量少，引物與模板之間的

碰撞結(jié)合機(jī)會(huì)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補(bǔ)鏈之間的碰撞機(jī)會(huì)。PCR小結(jié)(1)過程：變性復(fù)性延伸溫度：90℃以上溫度：50℃左右過程：兩種引物通過堿基互補(bǔ)配對與

兩條單鏈DNA結(jié)合溫度：72℃左右過程：4種脫氧核苷酸在耐高溫DNA聚合酶的催化下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則，添加在引物的3’端，合成新的DNA鏈。反復(fù)循環(huán)過程：目的基因DNA雙鏈?zhǔn)軣嶙冃院蠼饩蹫閱捂淧CR小結(jié)（2）結(jié)果：1個(gè)模板DNA分子經(jīng)過n輪PCR，以_____方式擴(kuò)增，可以擴(kuò)增出

個(gè)DNA片段，共需要引物數(shù)量為

個(gè)。指數(shù)2n2n＋1－2注意：用于PCR擴(kuò)增的DNA片段往往為了保證目的基因的完整，經(jīng)切割后目的基因的兩端會(huì)有一小段非基因序列，其也可能隨目的基因一起擴(kuò)增。AACGGCTTAATT【思考】PCR技術(shù)獲取目的基因時(shí)至少要經(jīng)過幾次循環(huán)才能

從DNA分子中分離出目的基因？第一次循環(huán)90℃以上，DNA雙鏈解開50℃左右，引物與DNA結(jié)合72℃左右，新DNA合成3’5’5’3’5’5’3’5’5’5’第二次循環(huán)5’3’5’5’3’5’高溫變性、低溫復(fù)性中溫延伸第二次循環(huán)3’5’高溫變性、低溫復(fù)性第三次循環(huán)3’5’中溫延伸第三次循環(huán)3’5’目的基因目的基因【思考】用PCR可以擴(kuò)增mRNA嗎？不可以直接擴(kuò)增mRNA，需要將它逆轉(zhuǎn)錄成cDNA（complementaryDNA）再進(jìn)行擴(kuò)增?！舅伎肌縋CR技術(shù)獲取目的基因時(shí)至少要經(jīng)過幾次循環(huán)才能

從DNA分子中分離出目的基因？3次【思考】怎么鑒定PCR的產(chǎn)物？瓊脂糖凝膠電泳PCR技術(shù)與體內(nèi)DNA復(fù)制過程比較項(xiàng)目PCR技術(shù)體內(nèi)DNA復(fù)制相同點(diǎn)原理原料條件不同點(diǎn)場所解旋方式酶引物特點(diǎn)是否需要ATP溫度條件結(jié)果堿基互補(bǔ)配對原則四種脫氧核苷酸均需要模板、引物、酶等細(xì)胞外（主要在PCR儀內(nèi)）（主要在細(xì)胞核內(nèi)）細(xì)胞內(nèi)DNA在高溫下變性解旋解旋酶催化耐高溫的TaqDNA聚合酶解旋酶、普通的DNA聚合酶一小段RNA或單鏈DNA分子片段一小段RNA體外迅速擴(kuò)增邊解旋邊復(fù)制不需要需要需控制溫度，在較高溫度下進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)溫和的條件短時(shí)間內(nèi)可形成大量的DNA片段形成完整的DNA分子第二步：基因表達(dá)載體的構(gòu)建1.作用：①使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代。②同時(shí)使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。?基因表達(dá)載體的構(gòu)建是基因工程的核心2.組成：目的基因標(biāo)記基因啟動(dòng)子終止子復(fù)制原點(diǎn)（載體DNA復(fù)制的起始點(diǎn)）啟動(dòng)子一段有特殊序列的DNA片段，位于基因的

，是

識別和結(jié)合的部位。RNA聚合酶上游終止子驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出

，最終表達(dá)出人類需要的

。mRNA蛋白質(zhì)有時(shí)為了滿足應(yīng)用需要，會(huì)在載體中人工構(gòu)建

，但誘導(dǎo)物存在時(shí)，可以

或

目的基因的表達(dá)。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子激活抑制一段有特殊序列的DNA片段，位于基因的

。下游終止轉(zhuǎn)錄。目的基因要插入啟動(dòng)子和終止子之間啟動(dòng)子和起始密碼子、終止子和終止密碼子的區(qū)別項(xiàng)目啟動(dòng)子終止子起始密碼子終止密碼子化學(xué)成分位置作用DNA片段DNA片段mRNA上三個(gè)相鄰堿基mRNA上三個(gè)相鄰堿基目的基因首端目的基因尾端mRNA首端mRNA尾端RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA決定轉(zhuǎn)錄的結(jié)束翻譯的起始信號決定翻譯過程的結(jié)束AAGUGUUAUmRNA第二步：基因表達(dá)載體的構(gòu)建3.過程：先用

或

的限制酶切割載體和含有目的基因的片段，再用

將目的基因片段拼接到載體上，形成重組DNA分子。目的基因限制酶切割位點(diǎn)標(biāo)記基因啟動(dòng)子限制酶切割位點(diǎn)終止子復(fù)制原點(diǎn)限制酶限制酶DNA連接酶同種限制酶能產(chǎn)生相同末端（同尾酶）DNA連接酶【思考】使用一種DNA限制酶進(jìn)行切割，共有幾種連接情況？選擇

不同的限制酶同時(shí)對目的基因和質(zhì)粒切割，減少自連情況（自身環(huán)化）出現(xiàn)自連目的基因自連質(zhì)粒自連片段間的連接目的基因與質(zhì)粒連接目的基因與目的基因連接質(zhì)粒與質(zhì)粒連接目的基因11’載體22’正向連接122’1’2種21’12’反向連接第三步：將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞一、將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞1.花粉管通道法①用

將

直接注入

中；（我國獨(dú)創(chuàng)）②在植物受粉后的一定時(shí)間內(nèi)，

，將DNA溶液滴加在

上，使目的基因借助

進(jìn)入

。微量注射器含目的基因的DNA溶液子房剪去柱頭花柱切面花粉管通道胚囊花粉外源DNA花粉管子房胚珠一、將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞2.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法(1)轉(zhuǎn)化：目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)

和

的過程。維持穩(wěn)定表達(dá)此處“轉(zhuǎn)化”與肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中的“轉(zhuǎn)化”含義相同，實(shí)質(zhì)都是

?；蛑亟M(2)特點(diǎn)：a.能在自然條件下侵染

.和

，而對大多數(shù)單子葉植物沒有侵染能力。b.農(nóng)桿菌細(xì)胞內(nèi)含有

，當(dāng)它侵染植物細(xì)胞后，能將Ti質(zhì)粒上的

.（

）轉(zhuǎn)移到被侵染的細(xì)胞，并且將其整合到該細(xì)胞的

上。雙子葉植物裸子植物Ti質(zhì)粒T-DNA可轉(zhuǎn)移的DNA染色體DNA2.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法(3)思路：將目的基因插入Ti質(zhì)粒的

中，通過農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化作用，就可以使目的基因進(jìn)入植物細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞的染色體DNA上，使目的基因能夠維持穩(wěn)定和表達(dá)。(4)具體轉(zhuǎn)化方法：①將新鮮的從葉片上取下的圓形小片與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，

然后篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞，并再生成植株。②將花序直接浸沒在含有農(nóng)桿菌的溶液中一段時(shí)間，

然后培養(yǎng)植株并獲得種子，再進(jìn)行篩選、鑒定等。T-DNA2.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法示意圖Ti質(zhì)粒目的基因構(gòu)建基因表達(dá)載體含目的基因的重組Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌導(dǎo)入植物細(xì)胞目的基因插入染色體DNA中植物細(xì)胞表現(xiàn)出新性狀的植株植物組織培養(yǎng)（5）過程第三步：將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞二、將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞1.導(dǎo)入方法：顯微注射法2.受體細(xì)胞:受精卵【思考】為什么常選用受精卵作為受體細(xì)胞呢？①體積大，易操作;②易表現(xiàn)出全能性。二、將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞3.過程：基因表達(dá)載體提純受精卵胚胎雌性動(dòng)物的輸卵管或子宮內(nèi)顯微注射新性狀的動(dòng)物早期胚胎培養(yǎng)胚胎移植發(fā)育第三步：將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞三、將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞1.常用方法：Ca2+處理（思考：目的？）可使細(xì)胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)。（感受態(tài)）2.受體細(xì)胞:原核細(xì)胞（常選擇大腸桿菌）（思考：優(yōu)點(diǎn)？）遺傳物質(zhì)相對較少，易于培養(yǎng)，繁殖快。3.過程:Ca2+處理細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合感受態(tài)細(xì)胞吸收重組DNA增加細(xì)胞壁的通透性一般利用溫度變化導(dǎo)入將基因表達(dá)載體導(dǎo)入受體細(xì)胞后，如何判斷導(dǎo)入是否成功？即使導(dǎo)入成功，如何判斷目的基因是否可以正常表達(dá)？第四步：目的基因的檢測與鑒定一、檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體DNA上是否插入了目的基因(1)方法:DNA分子雜交基因探針簡稱

，是一段帶有

（同位素、熒光分子或化學(xué)發(fā)光催化劑），且

已知的，與

互補(bǔ)核酸序列(DNA或RNA)。探針順序目的基因檢測標(biāo)記(2)過程:①首先取出轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNA；............TACGGTCATGTCGCATGCTAG........................ATGCCAGTACAGCGTACGATC............目的基因片段基因探針............GTACAGCGTA...........放射性標(biāo)記雜交DNA分子②將含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作標(biāo)記,以此做探針；③使探針和轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交,若顯示出

,表明目的基因已插入染色體DNA中。雜交帶............TACGGTCATGTCGCATGCTAG............目的基因片段............GTACAGCGTA...........基因探針(3)技術(shù):PCR等技術(shù)DNA變性、復(fù)性與分子雜交(4)檢測原理:堿基互補(bǔ)配對原則第四步：目的基因的檢測與鑒定二、檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA(1)方法:分子雜交(2)過程:用上述探針和轉(zhuǎn)基因生物的mRNA雜交,若出現(xiàn)雜交帶,表明目的基因轉(zhuǎn)錄出了mRNA。三、檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)(1)方法:抗原-抗體雜交(2)過程:蘇云金桿菌Bt毒素蛋白抗體脫分化提取蛋白質(zhì)

出現(xiàn)雜交帶轉(zhuǎn)基因生物鑒定方法成功標(biāo)志抗蟲植物抗病毒（菌）植物抗鹽植物抗除草劑植物獲取目的基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因生物飼喂害蟲（抗蟲接種實(shí)驗(yàn)）害蟲死亡病毒（菌）感染（抗病接種實(shí)驗(yàn)）未出現(xiàn)病斑鹽水澆灌正常生長噴灑除草劑正常生長提取細(xì)胞產(chǎn)物與天然產(chǎn)品進(jìn)行功能活性比較功能、活性正常二、個(gè)體水平的檢測【到社會(huì)中去】1.在實(shí)際種植過程中，棉鈴蟲是否對轉(zhuǎn)Bt基因的抗蟲棉產(chǎn)生了嚴(yán)重

的抗性？證據(jù)是什么？

科研人員對長江流域種植的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉進(jìn)行了監(jiān)測，2011年的數(shù)據(jù)顯示，大部分轉(zhuǎn)基因抗蟲棉品種的抗蟲性屬于中抗及高抗水平；2013年的數(shù)據(jù)表明，如果棉田周圍存在大量天然庇護(hù)所，靶標(biāo)害蟲棉鈴蟲、紅鈴蟲等并未對轉(zhuǎn)Bt基因的抗蟲棉產(chǎn)生明顯抗性。

在我國、澳大利亞、印度等國的多個(gè)實(shí)驗(yàn)室中，通過毒素的連續(xù)抗性篩選，已經(jīng)培育出多個(gè)高抗水平的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉品種。【到社會(huì)中去】2.科研工作者在沒有發(fā)現(xiàn)棉鈴蟲出現(xiàn)抗性之前，就應(yīng)該想辦法應(yīng)對。他們想出的延緩棉鈴蟲對Bt抗蟲蛋白產(chǎn)生抗性的措施有哪些？這些措施的原理是什么？有效嗎？

科研人員想出的延緩棉鈴蟲對Bt抗蟲蛋白產(chǎn)生抗性的措施有很多，主要可以分為以下幾個(gè)方面。(1)基因策略:

該策略是在分子水平上提高轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的抗蟲性和抗蟲持久性。包括在棉花中轉(zhuǎn)入多個(gè)殺蟲基因、構(gòu)建組織特異性表達(dá)的啟動(dòng)子、提高殺蟲基因的表達(dá)量等。例如，最早種植的抗蟲棉中只轉(zhuǎn)入了一種Bt基因，抗性比較單一；現(xiàn)在經(jīng)常將兩種或兩種以上的Bt基因(如CrylAa和CrylAc基因)同時(shí)轉(zhuǎn)入棉花細(xì)胞，這樣既可以提高殺蟲活性，又可以延緩害蟲抗性的產(chǎn)生和發(fā)展，還可以通過不同基因間的互補(bǔ)作用擴(kuò)大抗蟲范圍。(2)田間策略:這是在種植時(shí)采取的措施，如提供庇護(hù)所、與其他作物輪作或套種等。

例如，在澳大利亞和美國等地普遍采取的措施是在轉(zhuǎn)基因棉田中，總面積的4%種植不使用任何殺蟲劑的非轉(zhuǎn)基因棉花，或在轉(zhuǎn)基因棉田周圍種植20%～30%面積的可使用化學(xué)殺蟲劑的非轉(zhuǎn)基因棉花；

在印度，一些地區(qū)要求，在轉(zhuǎn)基因棉田周圍至少種植5行或者20%面積的非轉(zhuǎn)基因棉花。

我國除新疆棉區(qū)及大型農(nóng)場需設(shè)計(jì)專門的庇護(hù)所外，其他棉區(qū)如長江、黃河流域棉區(qū)多采用多種作物混作的耕作制度(如將轉(zhuǎn)基因抗蟲棉與番茄、向日葵、高梁、玉米、辣椒等棉鈴蟲寄主作物混作)，這些作物可以構(gòu)成天然的庇護(hù)所，一般無須種植非轉(zhuǎn)基因棉花作為庇護(hù)所。

這樣做的原理是為少部分害蟲提供一個(gè)正常的取食環(huán)境，始終保持一定的敏感目標(biāo)害蟲種群。

這樣，即使目標(biāo)害蟲對轉(zhuǎn)基因抗蟲棉產(chǎn)生了抗性，但是因?yàn)槠渑c敏感目標(biāo)害蟲交配，后代抗性基因會(huì)發(fā)生分離，所以抗性目標(biāo)害蟲的種群也不至于迅速增加。(3)國家宏觀調(diào)控策略:該策略包括實(shí)施分區(qū)種植管理、加強(qiáng)抗性監(jiān)測、進(jìn)行嚴(yán)格的安全生評價(jià)等?！咎骄颗c實(shí)踐】DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定一.實(shí)驗(yàn)原理1.利用PCR在體外進(jìn)行DNA片段擴(kuò)增的原理①PCR利用了DNA的_______原理，通過_________來控制DNA雙鏈的

與

，PCR儀實(shí)質(zhì)上就是一臺能夠_______________的儀器，一次PCR一般要經(jīng)歷___次循環(huán)；②PCR擴(kuò)增DNA片段還利用了_________________的原理；熱變性調(diào)節(jié)溫度解聚結(jié)合自動(dòng)調(diào)控溫度30DNA半保留復(fù)制一.實(shí)驗(yàn)原理2.DNA片段電泳鑒定的原理①DNA分子具有_______________，在一定的___下，這些基團(tuán)可以帶上

或

，在______的作用下，這些_________會(huì)向著__________________的電極移動(dòng)，這個(gè)過程就是_____；可解離的基團(tuán)pH正電荷負(fù)電荷電場帶電分子與它所帶電荷相反電泳②PCR的產(chǎn)物一般通過_________________來鑒定；瓊脂糖凝膠電泳③在凝膠中DNA分子的遷移速率與____________、________________和_____等有關(guān)凝膠的濃度DNA分子的大小構(gòu)象④凝膠中的DNA分子通過_____，可以在波長為_______的_______下被檢測出來。染色300nm紫外燈二.材料用具①PCR儀（自動(dòng)控溫，實(shí)現(xiàn)DNA的擴(kuò)增）②微量離心管（實(shí)際上是進(jìn)行PCR反應(yīng)的場所）③微量移液器（用于向微量離心管轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體）④一次性吸液槍頭（微量移液器吸取一種試劑更換一次槍頭）⑤電泳裝置（包括電泳儀、電泳槽等）10倍濃縮的擴(kuò)增緩沖液（含Mg2+）5μL20mmol/L的4種脫氧核苷酸的等量混合液（實(shí)為dNTP）1μL20μmol/L的引物Ⅰ2.5μL20μmol/L的引物Ⅱ2.5μLH2O28～33μL1-5U/μL的TaqDNA聚合酶（即耐高溫的DNA聚合酶）1～2U模板DNA（用量為1pg-1μg）5～10μL總體積50μL⑧PCR反應(yīng)體系的配方⑥4種脫氧核苷酸等量混合液、2種引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、擴(kuò)增緩沖液、無菌水。⑦電泳緩沖液、凝膠載樣緩沖液、瓊脂糖和核酸染料等三.方法步驟(一）DNA片段的擴(kuò)增

使DNA充分變性，以利于引物更好地和模板結(jié)合。1.移液：用

按照PCR反應(yīng)體系配方或PCR試劑盒的說明書，在

中依次加入各組分2.離心：待所有組分都加入后，

離心管的蓋子，將微量離心管放入

里，離心約10s，使反應(yīng)液集中在離心管的

（提高反應(yīng)速率）3.反應(yīng)：參照下表的參數(shù)，設(shè)置好PCR儀的循環(huán)程序。將裝有反應(yīng)液的微量離心管放入PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。循環(huán)程序變性復(fù)性延伸預(yù)變性94℃,5min//30次94℃,30s55℃,30s72℃,1min最后一次94℃,1min55℃,30s72℃,1min預(yù)變性：微量移液器微量離心管蓋嚴(yán)離心機(jī)底部(二）DNA片段的電泳鑒定(二）DNA片段的電泳鑒定1.配制瓊脂糖溶液

根據(jù)待分離DNA片段的大小，用電泳緩沖液配制瓊脂糖溶液，一般配制質(zhì)量體積比0.8%-1.2%的瓊脂糖溶液。在沸水浴或微波爐內(nèi)加熱至瓊脂糖熔化。稍冷卻后，加入適量的核酸染料混勻。2.制備凝膠①將溫?zé)岬沫傊侨芤貉杆俚谷肽＞?，并插入合適大小的梳子，以形成加樣孔。③將電泳緩沖液加入電泳槽中，電泳緩沖液沒過凝膠1mm為宜。②待凝膠溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝膠放入電泳槽內(nèi)。3.加樣

將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物與凝膠載樣緩沖液（內(nèi)含指示劑）混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入凝膠的加樣孔內(nèi)。留一個(gè)加樣孔加入指示分子大小的標(biāo)準(zhǔn)參照物。4.電泳

接通電源，根據(jù)電泳槽陽極至陰極之間的距離來設(shè)定電壓，一般為1～5V/cm。待指示劑前沿遷移接近凝膠邊緣時(shí)，停止電泳。5.觀察記錄取出凝膠置于紫外燈下觀察和照相。注意1.為避免外源DNA等因素的污染，PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行

處理。2.該實(shí)驗(yàn)所需材料可以直接從公司購買，緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，并在

儲存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化。3.在向微量離心管中添加反應(yīng)組分時(shí)，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須

。4.在進(jìn)行操作時(shí)，一定要

。5.PCR擴(kuò)增不能隨意加大試劑用量。高壓滅菌-20℃更換戴好一次性手套結(jié)果分析與評價(jià)1.你是否成功擴(kuò)增出DNA片段？判斷的依據(jù)是什么？

可以在紫外燈下直接觀察到DNA條帶的分布及粗細(xì)程度來評價(jià)擴(kuò)增的結(jié)果。進(jìn)行電泳鑒定的結(jié)果應(yīng)該是一條條帶，該片段大小約為750bp。2.你進(jìn)行電泳鑒定的結(jié)果是幾條條帶？

如果不止一條條帶，請分析產(chǎn)生這個(gè)結(jié)果的可能原因。

如果擴(kuò)增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反應(yīng)成分，各反應(yīng)成分的用量不當(dāng)，PCR程序設(shè)置不當(dāng)?shù)?。如果擴(kuò)增結(jié)果不止一條條帶，可能的原因有：引物設(shè)計(jì)不合理，它們與非目的序列有同源性或容易形成二聚體；退火溫度過低；DNA聚合酶的質(zhì)量不好等?！玖?xí)題訓(xùn)練】用PCR方法檢測轉(zhuǎn)基因植株是否成功導(dǎo)入目的基因時(shí)，得到以下電泳圖譜，其中1號為DNA標(biāo)準(zhǔn)樣液(Marker)，10號為蒸餾水。PCR時(shí)加入的模板DNA如圖所示。據(jù)此做出分析不合理的是(

)A.PCR產(chǎn)物的分子大小在250至500bp之間B.3號樣品為不含目