口腔細(xì)菌的培養(yǎng)及應(yīng)用

第一節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)一、細(xì)胞培養(yǎng)的基本原理目前一頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)細(xì)胞培養(yǎng)：模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，在適當(dāng)?shù)臈l件下，使活體組織細(xì)胞在體外環(huán)境存活、生長(zhǎng)增殖，并維持其結(jié)構(gòu)功能。目前二頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)特點(diǎn)目前三頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)

貼壁型細(xì)胞：必須貼附于支持物表面才能生長(zhǎng)。大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞貼附生長(zhǎng)，屬于貼壁依賴性細(xì)胞目前四頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)按照培養(yǎng)細(xì)胞的主要形態(tài)，可分為幾大類型目前五頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)

成纖維細(xì)胞型胞體呈梭型或不規(guī)則三角形，中央有卵圓形核，胞質(zhì)突起，生長(zhǎng)時(shí)呈放射狀、火焰狀、漩渦狀。除真正的成纖維細(xì)胞外，凡由中胚層間充質(zhì)起源的組織，如心肌、平滑肌細(xì)胞等等常呈本型狀態(tài)。另外，凡培養(yǎng)中細(xì)胞的形態(tài)與成纖維類似時(shí)皆可稱之為成纖維細(xì)胞。目前六頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)目前七頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)目前八頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)

上皮型細(xì)胞細(xì)胞呈扁平不規(guī)則多角形，中央有圓形核，細(xì)胞彼此緊密相連成單層膜，生長(zhǎng)時(shí)呈膜狀移動(dòng)，起源于內(nèi)、外胚層的細(xì)胞如皮膚表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形態(tài)。目前九頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)目前十頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)目前十一頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)目前十二頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)游走細(xì)胞型在支持物上呈散在生長(zhǎng)，一般不連成片，胞質(zhì)常突起，呈活躍游走或變形運(yùn)動(dòng)，方向不規(guī)則。此型細(xì)胞不穩(wěn)定，有時(shí)難以和其他細(xì)胞相區(qū)別。多型細(xì)胞型有一些細(xì)胞，如神經(jīng)細(xì)胞難以確定其規(guī)律和穩(wěn)定的形態(tài)，可統(tǒng)歸于此類。目前十三頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)目前十四頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)懸浮型細(xì)胞：于懸浮狀態(tài)下即可生長(zhǎng)，不需要貼附于支持物表面，見于某些癌細(xì)胞和血液淋巴細(xì)胞目前十五頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)培養(yǎng)時(shí)不貼附于底物而呈懸浮狀態(tài)生長(zhǎng)

或以機(jī)械方法使保持懸浮狀態(tài)下生長(zhǎng)

來自血，脾或骨髓在懸浮中生長(zhǎng)良好細(xì)胞圓形，單個(gè)或小細(xì)胞團(tuán)生存空間大，提供數(shù)量大，傳代方便(不需消化)，易于收獲，可獲得穩(wěn)定狀態(tài)觀察不方便目前十六頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)目前十七頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖過程

目前十八頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)

培養(yǎng)細(xì)胞生命期

所謂培養(yǎng)細(xì)胞生命期，是指細(xì)胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長(zhǎng)的時(shí)間。目前十九頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)目前二十頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)原代培養(yǎng)期：

也稱初代培養(yǎng)，即從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代階段，一般持續(xù)1一4周。此期細(xì)胞呈活躍的移動(dòng)，可見細(xì)胞分裂，但不旺盛。初代培養(yǎng)細(xì)胞與體內(nèi)原組織在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能活動(dòng)上相似性大。細(xì)胞群是異質(zhì)的，也即各細(xì)胞的遺傳性狀互不相同，細(xì)胞相互依存性強(qiáng)。細(xì)胞獨(dú)立生存性差。初代培養(yǎng)細(xì)胞多呈二倍體核型；由于原代培養(yǎng)細(xì)胞和體內(nèi)細(xì)胞性狀相似性大，是檢測(cè)藥物很好的實(shí)驗(yàn)對(duì)象。目前二十一頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)傳代期：

初代培養(yǎng)細(xì)胞一經(jīng)傳代后便改稱做細(xì)胞系。在全生命期中此期的持續(xù)時(shí)間最長(zhǎng)。在培養(yǎng)條件較好情況下，細(xì)胞增殖旺盛，并能維持二倍體核型，呈二倍體核型的細(xì)胞稱二倍體細(xì)胞系。為保持二倍體細(xì)胞性質(zhì)，細(xì)胞應(yīng)在初代培養(yǎng)期或傳代后早期凍存。反復(fù)傳代就有可能導(dǎo)致細(xì)胞失掉二倍體性質(zhì)或發(fā)生轉(zhuǎn)化。一般情況下當(dāng)傳代10～50次左右，細(xì)胞增殖逐漸緩慢，以至完全停止，細(xì)胞進(jìn)入第三期。目前二十二頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)衰退期：

此期細(xì)胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；細(xì)胞形態(tài)輪廓增強(qiáng)，最后衰退凋亡。在細(xì)胞生命期階段，少數(shù)情況下，在以上三期任何一點(diǎn)（多發(fā)生在傳代末或衰退期），由于某種因素的影響，細(xì)胞可能發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化的標(biāo)志之一是細(xì)胞可能獲得永生性或惡性性。細(xì)胞永生性也稱不死性，即細(xì)胞獲持久性增殖能力，這樣的細(xì)胞群體稱無限細(xì)胞系，也稱連續(xù)細(xì)胞系。無限細(xì)胞系的形成主要發(fā)生在第二期末，或第三期初階段。細(xì)胞獲不死性后，核型大多變成異倍體。細(xì)胞轉(zhuǎn)化亦可用人工方法誘發(fā)，轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞也可能具有惡性性質(zhì)。細(xì)胞永生性和惡性性非同一性狀。目前二十三頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)

培養(yǎng)細(xì)胞一代生存期

所謂細(xì)胞“一代”一詞，系僅指從細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)時(shí)的一段時(shí)間，這已成為培養(yǎng)工作中的一種習(xí)慣說法，它與細(xì)胞倍增一代非同一含義。如某一細(xì)胞系為第n代細(xì)胞，即指該細(xì)胞系已傳代n次。在細(xì)胞一代中，細(xì)胞能倍增3～6次。細(xì)胞傳一代后，一般要經(jīng)過以下三個(gè)階段：目前二十四頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)潛伏期（游離期，貼壁期）對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期停止期（平臺(tái)期）目前二十五頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)潛伏期：

細(xì)胞接種培養(yǎng)后，先經(jīng)過一個(gè)在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)的懸浮期。此時(shí)細(xì)胞胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。接著是細(xì)胞附著或貼附于底物表面上，稱貼壁，懸浮期結(jié)束。各種細(xì)胞貼附速度不同，這與細(xì)胞的種類、培養(yǎng)基成分和底物的理化性質(zhì)等密切相關(guān)。目前二十六頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)初代培養(yǎng)細(xì)胞貼附慢，可長(zhǎng)達(dá)10～24小時(shí)或更多；連續(xù)細(xì)胞系和惡性細(xì)胞系快，10～30分鐘即可貼附。細(xì)胞貼附現(xiàn)象是一個(gè)非常復(fù)雜和與多種因素相關(guān)的過程。支持物能影響細(xì)胞的貼附；底物表面不潔不利貼附，底物表面帶有陽性電荷利于貼附。另外在貼附過程中，有一些特殊物質(zhì)如纖維連接素，細(xì)胞表面蛋白等也參與貼附過程。這些物質(zhì)都是蛋白類成分，它們有的存在于細(xì)胞膜的表面，有的則來自培養(yǎng)基中的血清。貼附是貼附類細(xì)胞生長(zhǎng)增殖條件之一。

目前二十七頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)初代培養(yǎng)細(xì)胞潛伏期長(zhǎng)，約24～96小時(shí)或更長(zhǎng)，連續(xù)細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞潛伏期短，僅6～24小時(shí)；細(xì)胞接種密度大時(shí)潛伏期短。當(dāng)細(xì)胞分裂相開始出現(xiàn)并逐漸增多時(shí)，標(biāo)志細(xì)胞已進(jìn)入指數(shù)增生期。

目前二十八頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)目前二十九頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)目前三十頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)指數(shù)增生期：

這是細(xì)胞增值最旺盛的階段，細(xì)胞分裂相增多。指數(shù)增生期細(xì)胞分裂相數(shù)量可作為判定細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛與否的一個(gè)重要標(biāo)志。一般以細(xì)胞分裂指數(shù)表示，即細(xì)胞群中每1000個(gè)細(xì)胞中的分裂相數(shù)。一般細(xì)胞的分裂指數(shù)介于0.1%～0.5%，初代細(xì)胞分裂指數(shù)低，連續(xù)細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞分裂指數(shù)可高達(dá)3%～5%。目前三十一頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)特點(diǎn)：是細(xì)胞增生最活躍、活力最旺盛的階段培養(yǎng)物中細(xì)胞數(shù)量呈指數(shù)增長(zhǎng),細(xì)胞群體均一是理想的實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞

目前三十二頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)

在接種細(xì)胞數(shù)量適宜情況下，指數(shù)增生期持續(xù)3～5天后，隨細(xì)胞數(shù)量不斷增多、生長(zhǎng)空間漸趨減少、最后細(xì)胞相互接觸匯合成片。細(xì)胞相互接觸后，如培養(yǎng)的是正常細(xì)胞，由于細(xì)胞的相互接觸能抑制細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)，這種現(xiàn)象稱接觸抑制。

目前三十三頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)細(xì)胞接觸匯合成片后，雖發(fā)生接觸抑制，只要營(yíng)養(yǎng)充分，細(xì)胞仍然能夠進(jìn)行增殖分裂，因此細(xì)胞數(shù)量仍在增多。但當(dāng)細(xì)胞密度進(jìn)一步增大，培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)成分減少，代謝產(chǎn)物增多時(shí)，細(xì)胞因營(yíng)養(yǎng)的枯竭和代謝物的影響，則發(fā)生密度抑制，導(dǎo)致細(xì)胞分裂停止。目前三十四頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)停滯期：

細(xì)胞數(shù)量達(dá)飽和密度后，細(xì)胞遂停止增殖，進(jìn)入停滯期。此時(shí)細(xì)胞數(shù)量不再增加，故也稱平臺(tái)期。停滯期細(xì)胞雖不增殖，但仍有代謝活動(dòng)，繼而培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)漸趨耗盡，代謝產(chǎn)物積累、pH降低。此時(shí)需做分離培養(yǎng)即傳代，否則細(xì)胞會(huì)中毒，發(fā)生形態(tài)改變，重則從底物脫落死亡，故傳代應(yīng)越早越好。目前三十五頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)目前三十六頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)培養(yǎng)細(xì)胞的體外生長(zhǎng)環(huán)境目前三十七頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)無污染環(huán)境目前三十八頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)超凈臺(tái)超凈工作臺(tái)的工作原理是利用鼓風(fēng)機(jī)驅(qū)動(dòng)空氣遁過高效濾器除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到凈化。凈化空氣徐徐通過工作臺(tái)面，使工作臺(tái)內(nèi)構(gòu)成無菌環(huán)境。

目前三十九頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)濾器目前四十頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)壓力蒸汽消毒器：濕熱消毒，用途廣電熱干燥箱：干熱消毒（160℃，2小時(shí)）。主要用干玻璃器皿消毒濾器：過濾除菌：大多數(shù)培養(yǎng)用液，如人工合成培養(yǎng)基、血清、酶液等均采用濾過法除菌超凈工作臺(tái)：為細(xì)胞操作提供無菌環(huán)境紫外燈：紫外線消毒。主要用于培養(yǎng)室空氣、操作臺(tái)、塑料培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板等表面消毒

目前四十一頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)基質(zhì)玻璃基質(zhì)塑料飼養(yǎng)細(xì)胞生物性基質(zhì)處理培養(yǎng)表面金屬目前四十二頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)目前四十三頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)氣體環(huán)境和氫離子濃度Hepers緩沖液CO2+H2O←→H2CO3←→H++HCO3-CO2:5%目前四十四頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)液相環(huán)境目前四十五頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)水：新鮮配置的三蒸水或去離子水平衡鹽溶液：無Ca2+、Mg2+的緩沖液

目前四十六頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)天然培養(yǎng)基：天然培養(yǎng)基有血清、血漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。優(yōu)點(diǎn)：營(yíng)養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好缺點(diǎn)：來源受限。成分復(fù)雜，影響對(duì)某些實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物的提取和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析。易發(fā)生支原體污染目前四十七頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)合成培養(yǎng)基

合成培養(yǎng)基是根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。目前已設(shè)計(jì)出許多種培養(yǎng)基，如TC199、MEM、RPMI-1640、DMEM等。合成培養(yǎng)基主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機(jī)鹽和其它一些輔助物質(zhì)。優(yōu)點(diǎn)：標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，組分和含量相對(duì)固定。成本低缺點(diǎn)：缺少某些成分，不能完全滿足體外細(xì)胞生長(zhǎng)需要。目前四十八頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)人工合成培養(yǎng)基只能維持細(xì)胞生存，要想使細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖，還需補(bǔ)充一定量的天然培養(yǎng)基（如血清）。

目前四十九頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)血清中含有：①多種蛋白質(zhì)（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等）②多種金屬離子；③激素；④促貼附物質(zhì)，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等。⑤各種生長(zhǎng)因子⑥轉(zhuǎn)移蛋白⑦不明成分目前五十頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)無血清培養(yǎng)基的主要研制策略：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中補(bǔ)充各種必需因子，如激素、生長(zhǎng)因子、結(jié)合蛋白、貼壁和擴(kuò)展因子等。無血清培養(yǎng)基由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和替代血清的補(bǔ)充成分組成。無血清細(xì)胞培養(yǎng)基的使用保證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性、可重復(fù)性和穩(wěn)定性，，減少了細(xì)胞污染，簡(jiǎn)化了提純和鑒定各種細(xì)胞產(chǎn)物的程序。目前五十一頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)溫度滲透壓目前五十二頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)二、細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法目前五十三頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)無菌操作技術(shù)

目前五十四頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)體外培養(yǎng)細(xì)胞缺乏抗感染能力，所以防止污染是決定培養(yǎng)成功或失敗的首要條件。即便使用設(shè)備完善的實(shí)驗(yàn)室，若實(shí)驗(yàn)者粗心大意，技術(shù)操作不規(guī)范,也會(huì)導(dǎo)致污染。因而,為在一切操作中最大可能地保證無菌，每一項(xiàng)工作都必須做到有條不紊和完全可靠。目前五十五頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)培養(yǎng)前準(zhǔn)備在開始實(shí)驗(yàn)前要制定好實(shí)驗(yàn)計(jì)劃和操作程序。有關(guān)數(shù)據(jù)的計(jì)算要事先做好。根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，準(zhǔn)備各種所需器材和物品放置操作場(chǎng)所(培養(yǎng)室、超凈臺(tái))內(nèi)消毒。這可以避免開始實(shí)驗(yàn)后，因物品不全往返拿取而增加污染機(jī)會(huì)。

目前五十六頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)培養(yǎng)室的消毒無菌培養(yǎng)室每天都要用0.2%的新潔爾滅拖洗地面—次(拖布要專用)，紫外線照射消毒30-50min，超凈工作臺(tái)臺(tái)面每次實(shí)驗(yàn)前要用75％酒精擦洗。然后紫外線消毒30min?！┎僮饔镁呷缫埔浩?、廢液缸、污物盒、試管架等用75%酒精擦洗后置于臺(tái)內(nèi)同時(shí)紫外線消毒。

目前五十七頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)洗手和著裝原則上和外科手術(shù)相同。并于開始操作前要用75％酒精消毒手和前臂。如果實(shí)驗(yàn)過程中手觸及可能污染的物品和出入培養(yǎng)室都要重新用消毒液洗手。進(jìn)入原代培養(yǎng)室需徹底洗手還要戴口罩、著消毒衣帽。目前五十八頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)培養(yǎng)過程中的無菌操作在無菌環(huán)境進(jìn)行培養(yǎng)或做其它無菌工作時(shí)，首先要點(diǎn)燃酒精燈。以后一切操作，如按裝吸管帽、打開或封閉瓶口等，都需在火焰近處并經(jīng)過燒灼進(jìn)行。進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，動(dòng)作要準(zhǔn)確敏捷，但又不必太快，以防空氣流動(dòng)，增加污染機(jī)會(huì)。不能用手觸及已消毒器皿，如已接觸，要用火焰燒灼消毒或取備品更換。

目前五十九頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)基本培養(yǎng)操作技術(shù)

目前六十頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)培養(yǎng)細(xì)胞的取材與分離取材部位準(zhǔn)確嚴(yán)格無菌操作盡快培養(yǎng)減小損傷制備標(biāo)本目前六十一頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)分散組織機(jī)械分離法消化分離法目前六十二頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)培養(yǎng)細(xì)胞的純化人工純化（酶消化法，機(jī)械刮除法，反復(fù)貼壁法，克隆法等）自然純化目前六十三頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇所謂冷凍保存，就是將體外培養(yǎng)物或生物活性材料懸浮在加有或不加冷凍保護(hù)劑的溶液中，以一定的冷凍速率降至零下某一溫度，并在此溫度下對(duì)其長(zhǎng)期保存的過程。而復(fù)蘇就是以一定的復(fù)溫速率將凍存的體外培養(yǎng)物或生物活性材料恢復(fù)到常溫的過程。不論是微生物、動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞還是體外培養(yǎng)的器官都可以進(jìn)行凍存，并在適當(dāng)條件下復(fù)蘇。

目前六十四頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)低溫保護(hù)劑的應(yīng)用在細(xì)胞凍存時(shí)加入溫保護(hù)劑，能大大提高凍存效果。常用的低溫保護(hù)劑是DMSO，它是一種滲透性保護(hù)劑，可迅速透入細(xì)胞，提高胞膜對(duì)水的通透性，降低冰點(diǎn)，延緩凍結(jié)過程，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對(duì)細(xì)胞的損傷。目前六十五頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)

凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融

當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細(xì)胞器脫水，細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶。

如果緩慢冷凍，可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶；相反．結(jié)晶就大，大結(jié)晶會(huì)造成細(xì)胞膜、綱胞器的損傷和破裂。復(fù)蘇過程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。目前六十六頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)法

目前六十七頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)原代培養(yǎng)取自體內(nèi)新鮮組織并置于體外條件下生長(zhǎng)的細(xì)胞在傳代之前稱為原代培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)細(xì)胞在培養(yǎng)器皿中生長(zhǎng)一定時(shí)間后，被分開接種到新的培養(yǎng)器皿中。

目前六十八頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)細(xì)胞培養(yǎng)的污染、檢測(cè)與控制

目前六十九頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)微生物污染空氣、器材、操作、試劑、組織標(biāo)本目前七十頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)微生物污染的檢測(cè)細(xì)菌和真菌的污染和檢測(cè)肉眼直接觀察法培養(yǎng)檢查法顯微鏡觀察法目前七十一頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)目前七十二頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)目前七十三頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)支原體的污染和檢測(cè)造成支原體高污染率的原因：1.支原體大小0.1－0.8um，無細(xì)胞壁，可透過一般過濾膜（0.22-0.45um）；

2.支原體污染時(shí)，沒有明顯的肉眼或一般光學(xué)顯微鏡可觀察到的特征變化；

3.過去缺乏簡(jiǎn)單、快速且可靠的檢測(cè)方式；

4.細(xì)胞流通間缺乏物品管理，造成實(shí)驗(yàn)室間的相互污染；

5.研究或操作人員忽略污染問題；6.已受污染的細(xì)胞；

7.已受污染的培養(yǎng)基、血清。目前七十四頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)支原體之檢測(cè)：

相差顯微鏡觀察法、電鏡法Hayflick培養(yǎng)基直接培養(yǎng)法DNA熒光染色法

PCR方法目前七十五頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)目前七十六頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)目前七十七頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)微生物污染的控制抗生素除菌法加溫處理目前七十八頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)化學(xué)污染細(xì)胞交叉污染目前七十九頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)第二節(jié)口腔醫(yī)學(xué)中相關(guān)細(xì)胞培養(yǎng)及其特點(diǎn)一、牙齒相關(guān)細(xì)胞目前八十頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)牙髓細(xì)胞目前八十一頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)培養(yǎng)中的細(xì)胞成分：成纖維細(xì)胞未分化的間充質(zhì)細(xì)胞目前八十二頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)

培養(yǎng)方法取材浸泡修剪鋪瓶培養(yǎng)目前八十三頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)

細(xì)胞形態(tài)特點(diǎn)目前八十四頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)

免疫組織化學(xué)染色波形絲蛋白表達(dá)陽性角蛋白、神經(jīng)絲蛋白、結(jié)蛋白、膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白表達(dá)陰性目前八十五頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)

生長(zhǎng)增殖特點(diǎn)成功率快速增殖期死亡目前八十六頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)

功能特點(diǎn)堿性磷酸酶活性礦化現(xiàn)象對(duì)鈣調(diào)節(jié)因子的作用對(duì)細(xì)胞因子的反應(yīng)對(duì)氫氧化鈣、羥基磷灰石蓋髓劑的反應(yīng)目前八十七頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)牙周膜細(xì)胞目前八十八頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)

培養(yǎng)方法取材浸泡修剪鋪瓶培養(yǎng)目前八十九頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)培養(yǎng)中的細(xì)胞成分：成纖維細(xì)胞未分化的間充質(zhì)細(xì)胞目前九十頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)

細(xì)胞形態(tài)特點(diǎn)目前九十一頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)

免疫組織化學(xué)染色波形絲蛋白表達(dá)陽性角蛋白、神經(jīng)絲蛋白、結(jié)蛋白、膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白表達(dá)陰性目前九十二頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)

生長(zhǎng)增殖特點(diǎn)成功率快速增殖期死亡目前九十三頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)

功能特點(diǎn)分泌功能礦化功能收縮功能附著能力再生能力目前九十四頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)

增殖分化影響因素生長(zhǎng)因子胰島素纖維粘連蛋白抗壞血酸羥基磷灰石目前九十五頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)二、唾液腺細(xì)胞目前九十六頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)

細(xì)胞形態(tài)特點(diǎn)腺泡上皮細(xì)胞導(dǎo)管上皮細(xì)胞肌上皮細(xì)胞目前九十七頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)

免疫組織化學(xué)染色腺泡上皮細(xì)胞：角蛋白、淀粉酶、對(duì)氨基水楊酸、導(dǎo)管上皮膜、前角蛋白、單克隆角蛋白、分泌成分陽性反應(yīng)導(dǎo)管上皮細(xì)胞：角蛋白、上皮膜蛋白、磷酸酐酶抗體染色陽性反應(yīng)肌上皮細(xì)胞：肌動(dòng)蛋白、S－100蛋白、肌凝蛋白抗體染色陽性反應(yīng)目前九十八頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)

功能特點(diǎn)分泌功能腺泡細(xì)胞：淀粉酶、PRP、唾液過氧化物酶、特異蛋白等腺泡上皮細(xì)胞：頂端分泌、基底及側(cè)膜分泌導(dǎo)管細(xì)胞：膠原肌上皮細(xì)胞：膠原目前九十九頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)

唾液腺細(xì)胞的增殖分化基底潛能干細(xì)胞理論單細(xì)胞全能干細(xì)胞理論雙細(xì)胞亞全能干細(xì)胞理論目前一百頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)

增殖分化功能影響因素細(xì)胞因子激素細(xì)胞外基質(zhì)鈣離子目前一百零一頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)三、口腔粘膜細(xì)胞目前一百零二頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)

培養(yǎng)方法組織塊法酶消化法目前一百零三頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)

細(xì)胞形態(tài)特點(diǎn)目前一百零四頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)

免疫組織化學(xué)染色波形絲蛋白表達(dá)陰性多種角蛋白表達(dá)陽性目前一百零五頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)

功能分泌：膠原蛋白和非膠原蛋白金屬蛋白酶目前一百零六頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)四、頜骨相關(guān)的硬組織細(xì)胞目前一百零七頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)破骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)特點(diǎn)組織化學(xué)染色特點(diǎn)功能目前一百零八頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)成骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)特點(diǎn)免疫組織化學(xué)染色特點(diǎn)功能：成骨作用對(duì)破骨細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用目前一百零九頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)軟骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)特點(diǎn)組織化學(xué)染色特點(diǎn)功能影響軟骨細(xì)胞功能分化的因素目前一百一十頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)五、口腔腫瘤細(xì)胞目前一百一十一頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性

腫瘤細(xì)胞與體內(nèi)正常細(xì)胞相比，不論在體內(nèi)或在體外，在形態(tài)、生長(zhǎng)增值、遺傳性狀等方面都有顯著的不同。生長(zhǎng)在體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞和在體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞，其差異較小，但也并非完全相同。目前一百一十二頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)形態(tài)和性狀

培養(yǎng)中癌細(xì)胞無光學(xué)顯微鏡下特異形態(tài)，大多數(shù)腫瘤細(xì)胞鏡下觀察比二倍體細(xì)胞清晰，核膜、核仁輪廓明顯，核糖體顆粒豐富。電鏡觀察癌細(xì)胞表面的微絨毛多而細(xì)密，微絲走行不如正常細(xì)胞規(guī)則，可能與腫瘤細(xì)胞具有不定向運(yùn)動(dòng)和錨著不依賴性有關(guān)。目前一百一十三頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)生長(zhǎng)增殖

腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)具有不受控增殖性，在體外培養(yǎng)中仍如此。正常二倍體細(xì)胞在體外培養(yǎng)中不加血清不能增殖，是因血清中含有很細(xì)胞增殖生長(zhǎng)的因子，而癌細(xì)胞在低血清中（2％～5％）仍能生長(zhǎng)。已證明腫瘤細(xì)胞有自泌或內(nèi)泌性產(chǎn)生促增殖因子能力。正常細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化后，出現(xiàn)能在低血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的現(xiàn)象，已成為檢測(cè)細(xì)胞惡變的一個(gè)指標(biāo)。癌細(xì)胞或培養(yǎng)中發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化后的單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，形成集落（克?。┑哪芰Ρ日＜?xì)胞強(qiáng)。另外癌細(xì)胞增殖數(shù)量增多擴(kuò)展時(shí)，接觸抑制消除，細(xì)胞能相互重疊向三維空間發(fā)展，形成堆積物。

目前一百一十四頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)永生性

永生性也稱不死性。在體外培養(yǎng)中表現(xiàn)為細(xì)胞可無限傳代而不凋亡。體外培養(yǎng)中的腫瘤細(xì)胞系或細(xì)胞株都表現(xiàn)有這種性狀。目前一百一十五頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)浸潤(rùn)性

浸潤(rùn)性是腫瘤細(xì)胞擴(kuò)張性增殖行為，培養(yǎng)癌細(xì)胞仍持有這種性狀。在與正常組織混合培養(yǎng)時(shí)，能浸潤(rùn)入其它組織細(xì)胞中，并有穿透人工隔膜生長(zhǎng)的能力。

目前一百一十六頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)異質(zhì)性

所有腫瘤都是由有增殖能力、遺傳性、起源、周期狀態(tài)等性狀不同的細(xì)胞組成。異質(zhì)性構(gòu)成同一腫瘤內(nèi)細(xì)胞的活力有差別的瘤組織；處于瘤體周邊區(qū)的細(xì)胞獲得血液供應(yīng)多，增殖旺盛，中心區(qū)有的細(xì)胞衰老退化，有的處于周期阻滯狀態(tài)，那些呈活躍增殖狀態(tài)的細(xì)胞稱干細(xì)胞（StemCells）、只有這些干細(xì)胞才是支持腫瘤生長(zhǎng)的成分。目前一百一十七頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)細(xì)胞遺傳

大多數(shù)腫瘤細(xì)胞有遺傳學(xué)改變，如失去二倍體核型、呈異倍體或多倍體等。腫瘤細(xì)胞群常由多個(gè)細(xì)胞群組成，有干細(xì)胞系和數(shù)個(gè)亞系，并不斷進(jìn)行著適應(yīng)性演變。目前一百一十八頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)

培養(yǎng)方法

腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)成功關(guān)鍵在于：取材、成纖維細(xì)胞的排除、選用適宜的培養(yǎng)液和培養(yǎng)底物等幾個(gè)方面。在具體培養(yǎng)方法方面，腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)與正常組織細(xì)胞培養(yǎng)并無原則差別，初代培養(yǎng)應(yīng)用組織塊和消化培養(yǎng)法均可。目前一百一十九頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)口腔鱗癌細(xì)胞：舌鱗狀細(xì)胞癌系涎腺腫瘤細(xì)胞：人黏液表皮樣癌系腺樣囊性癌系來源生物學(xué)特性來源生物學(xué)特性來源生物學(xué)特性目前一百二十頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)第三節(jié)口腔組織工程與干細(xì)胞一、組織工程的基本原理目前一百二十一頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)目前一百二十二頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)修復(fù)缺損器官的方法自體移植異體移植組織代用品目前一百二十三頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)組織工程的基本原理和方法組織工程是應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和工程學(xué)原理,將人體某部分的組織細(xì)胞種植和吸附在一種生物材料的支架上進(jìn)行人工培養(yǎng)繁殖,擴(kuò)增,然后移植到人體內(nèi)所需要的部位,從而達(dá)到器官修復(fù)或再造的治療目的的一種技術(shù).目前一百二十四頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)目前一百二十五頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)組織工程的核心問題是：建立由細(xì)胞和生物材料構(gòu)成的三維空間復(fù)合體目前一百二十六頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：形成具有生命力的活體組織用最少量的組織細(xì)胞修復(fù)大塊組織缺損任意塑形目前一百二十七頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)組織工程的關(guān)鍵技術(shù):

組織構(gòu)成細(xì)胞的培養(yǎng)

生物組織是由實(shí)質(zhì)細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成。對(duì)于組織工程來說，首先要求獲取所要培養(yǎng)組織的細(xì)胞。細(xì)胞可來源于自體細(xì)胞，這是一種較常規(guī)的選擇，可以避免機(jī)體的免疫排斥反應(yīng)，但是受到種類、數(shù)量、時(shí)間等限制。因此必須考慮其它方式來獲取細(xì)胞，如應(yīng)用治療性克隆技術(shù)從胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化成組織特異干細(xì)胞或應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得工程細(xì)胞。獲取細(xì)胞后，還要研究細(xì)胞擴(kuò)增防老化技術(shù)及其機(jī)理，干細(xì)胞快速、規(guī)模擴(kuò)增等問題。目前一百二十八頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)生物材料及構(gòu)架制備

為了形成具有三維結(jié)構(gòu)的組織，必須提供一個(gè)構(gòu)架，構(gòu)架選擇的聚合體必須有足夠的彈性提供細(xì)胞一個(gè)類似生命體的力學(xué)環(huán)境，充分多的孔隙允許培養(yǎng)液浸潤(rùn)生長(zhǎng)的組織，傳輸營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和清除細(xì)胞代謝廢物，隨著組織的生長(zhǎng)能夠自我降解，但是降解速度不能太快，要有足夠的時(shí)間保證細(xì)胞長(zhǎng)進(jìn)去，及時(shí)填補(bǔ)聚合體溶解留下的空隙。所以必須用多分支的、多孔滲水的聚合物材料制作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)架，常用的有聚羥基乙酸、聚乳酸類等生物材料。其關(guān)鍵技術(shù)主要包括基體材料改性、表面修飾、表面活性組裝、降解速率調(diào)控、三維構(gòu)架設(shè)計(jì)和制備等等。目前一百二十九頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)良好的生物相容性生物降解性良好的表面活性具有多孔性組織工程支架材料的要求：目前一百三十頁\總數(shù)一百四十九頁\編于五點(diǎn)生物組織工程化培養(yǎng)系統(tǒng)的研究

力學(xué)環(huán)