免疫藥實(shí)驗(yàn)方法藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)研究生

免疫藥實(shí)驗(yàn)方法藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)研究生目前一頁\總數(shù)九十三頁\編于二點(diǎn)2●經(jīng)驗(yàn)免疫學(xué)時(shí)期

中國明代，正式記載接種“人痘”，預(yù)防天花

18世紀(jì)中葉，英國醫(yī)生EdwardJenner種牛痘預(yù)防天花目前，通過全球性大面積疫苗接種我們已經(jīng)消滅了天花病毒目前二頁\總數(shù)九十三頁\編于二點(diǎn)3目前三頁\總數(shù)九十三頁\編于二點(diǎn)4●科學(xué)免疫學(xué)時(shí)期

病原菌的發(fā)現(xiàn)與疫苗使用的推廣

19世紀(jì)中葉，顯微鏡的改進(jìn)使人們可在鏡下直接觀察到細(xì)菌，導(dǎo)致病原菌的發(fā)現(xiàn)。

1850年，首先在感染羊的血液中看到了炭疽桿菌。

Pasteur證明實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的炭疽桿菌能使動(dòng)物感染致病，并且發(fā)明了液體培養(yǎng)基，以培養(yǎng)細(xì)菌。

Koch發(fā)明固體培養(yǎng)基，分離培養(yǎng)結(jié)核桿菌成功，提出病原菌致病的概念。目前四頁\總數(shù)九十三頁\編于二點(diǎn)EmilvonBehring1854-1917,NobelPrizein1901fordemonstratingthatcirculatingantitoxinsagainstdiphtheria（白喉）andtetanus（破傷風(fēng)）toxinsconferredimmunity.LouisPasteur1822-1895,Fatherofimmunology,attenuatedbacteriaandvirusesasvaccineagainstanthrax（炭疽）…..目前五頁\總數(shù)九十三頁\編于二點(diǎn)EdwardJenner1749-1822Successfulvaccinationagainstsmallpox（天花）RobertKoch1843-1910,NobelPrizein1905forhisworkontuberculosis（肺結(jié)核）,Anthrax（炭疽）,Cholera（霍亂）,Tuberculebacillus（結(jié)核桿菌）目前六頁\總數(shù)九十三頁\編于二點(diǎn)7科學(xué)免疫學(xué)時(shí)期的重要成就

減毒疫苗的發(fā)明抗毒素的發(fā)現(xiàn)補(bǔ)體的發(fā)現(xiàn)血清學(xué)方法的建立免疫化學(xué)的研究目前七頁\總數(shù)九十三頁\編于二點(diǎn)●現(xiàn)代免疫學(xué)時(shí)期

免疫應(yīng)答細(xì)胞和T細(xì)胞亞類的發(fā)現(xiàn)免疫網(wǎng)絡(luò)學(xué)說的提出

抗體生成克隆選擇學(xué)說的提出細(xì)胞因子研究進(jìn)展免疫學(xué)技術(shù)的發(fā)展（免疫標(biāo)記技術(shù)）免疫耐受現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)目前八頁\總數(shù)九十三頁\編于二點(diǎn)ClonalSelectionTheory（Burnet學(xué)說,

1960年諾貝爾獎(jiǎng)）體內(nèi)存有能識別各種抗原的細(xì)胞克隆(clone)，每一細(xì)胞表面均有對特定抗原的受體，能與相應(yīng)抗原結(jié)合而識別它們?？乖淖饔迷谟谶x擇與其相應(yīng)的細(xì)胞克隆與其受體結(jié)合后，引起細(xì)胞的增殖分化，產(chǎn)生免疫應(yīng)答。胎生期免疫細(xì)胞與自己抗原相接觸形成天然自身耐受狀態(tài)（禁忌細(xì)胞系）免疫細(xì)胞系可突變產(chǎn)生與自己抗原發(fā)生反應(yīng)的細(xì)胞系可形成自身免疫反應(yīng)此學(xué)說對免疫學(xué)中的根本問題——自我識別有了比較滿意的解釋，對免疫學(xué)中的其他重要問題，諸如免疫記憶、免疫耐受性、自身免疫性等現(xiàn)象也能作出恰當(dāng)?shù)恼f明，因此被人們廣為接受，成為現(xiàn)代免疫學(xué)的理論基礎(chǔ)。

目前九頁\總數(shù)九十三頁\編于二點(diǎn)10目前十頁\總數(shù)九十三頁\編于二點(diǎn)11●研究進(jìn)展1.抗原識別受體多樣性的產(chǎn)生2.信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的發(fā)現(xiàn)3.細(xì)胞程序性死亡途徑的發(fā)現(xiàn)4.造血與免疫細(xì)胞的發(fā)育5.應(yīng)用免疫學(xué)的發(fā)展

(1)DNA疫苗

(2)基因工程制備重組細(xì)胞因子

(3)免疫細(xì)胞治療

(4)完全人源抗體

(5)口服自身抗原,預(yù)防自身免疫病目前十一頁\總數(shù)九十三頁\編于二點(diǎn)12二、免疫功能的病理生理及免疫功能的調(diào)節(jié)

●免疫應(yīng)答：是機(jī)體借助理化屏障及神經(jīng)體液調(diào)節(jié)控制，通過免疫細(xì)胞及有關(guān)的體液因子（抗體or淋巴因子等）發(fā)揮識別自己、排除異己，以維持機(jī)體內(nèi)外環(huán)境統(tǒng)一的一種功能。●非特異性免疫應(yīng)答：是機(jī)體防御異物進(jìn)入機(jī)體以及對進(jìn)入體內(nèi)異物的清除作用，是機(jī)體與生俱來的免疫功能?！裉禺愋悦庖邞?yīng)答：是機(jī)體發(fā)育過程中接觸抗原后發(fā)展而成的免疫力，包括體液免疫和細(xì)胞免疫。目前十二頁\總數(shù)九十三頁\編于二點(diǎn)13免疫應(yīng)答的3個(gè)階段：

（1）感應(yīng)期抗原進(jìn)入機(jī)體后，多數(shù)由單核－巨噬細(xì)胞攝取與加工，再將抗原信息傳遞給T、B淋巴細(xì)胞，使之能特異性地識別抗原。（2）增殖分化期抗原激活――淋巴細(xì)胞――T、B淋巴細(xì)胞――致敏淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞。（3）效應(yīng)期再次遇到抗原――致敏淋巴細(xì)胞、抗體――細(xì)胞免疫、體液免疫。目前十三頁\總數(shù)九十三頁\編于二點(diǎn)14目前十四頁\總數(shù)九十三頁\編于二點(diǎn)15目前十五頁\總數(shù)九十三頁\編于二點(diǎn)目前十六頁\總數(shù)九十三頁\編于二點(diǎn)17目前十七頁\總數(shù)九十三頁\編于二點(diǎn)18免疫病理與免疫性疾病按發(fā)病機(jī)制不同,免疫性疾病分為：

超敏反應(yīng)性疾病

免疫缺陷?。合忍煨约袄^發(fā)型免疫缺陷病

自身免疫?。侯愶L(fēng)濕性關(guān)節(jié)，系統(tǒng)性紅斑狼瘡,干燥綜合征,多發(fā)性硬化

移植排斥和移植物抗宿主反應(yīng)速發(fā)型：由抗體介導(dǎo)，發(fā)作快如：哮喘、蕁麻疹等遲發(fā)型：由細(xì)胞免疫介導(dǎo)，發(fā)作慢見于結(jié)核病、接觸性皮炎目前十八頁\總數(shù)九十三頁\編于二點(diǎn)19目前臨床所用的影響免疫功能的藥物有：

●免疫增強(qiáng)藥：胸腺素、卡介苗、干擾素（免疫調(diào)節(jié)）、左旋咪唑等。

●免疫抑制藥：環(huán)孢素A、他克莫司、糖皮質(zhì)激素、環(huán)磷酰胺、抗淋巴細(xì)胞球蛋白?！裰兴庮悾弘p向免疫調(diào)節(jié)，如：人參、黃芪、靈芝、豬苓、枸杞、銀耳、鹿茸、云芝等植物多糖。免疫抑制，如：川烏總堿、氧化苦參堿、雷公藤多苷、生物堿等。目前十九頁\總數(shù)九十三頁\編于二點(diǎn)20中國醫(yī)院用藥評價(jià)與分析,2009;9(10):726-729目前二十頁\總數(shù)九十三頁\編于二點(diǎn)21三、研究的基本要求（一）動(dòng)物的選擇

由于免疫反應(yīng)和基因類型有關(guān)，盡可能用純系動(dòng)物。如純系小鼠和大鼠，并控制鼠齡、性別和體重，以減少個(gè)體差異。若用雜種動(dòng)物，最好用同窩動(dòng)物。目前二十一頁\總數(shù)九十三頁\編于二點(diǎn)22（二）動(dòng)物模型

1、模型特點(diǎn)和要求（1）正常實(shí)驗(yàn)動(dòng)物（2）免疫功能低下的動(dòng)物模型（腫瘤、衰老、慢性病均可造成免疫功能低下）

①免疫抑制劑造模（如環(huán)磷酰胺、氫化可的松、環(huán)孢霉素A）②輻射引起免疫功能低下動(dòng)物模型

目前二十二頁\總數(shù)九十三頁\編于二點(diǎn)23常用的免疫抑制劑

1.環(huán)磷酰胺：80～100mg/kg，Sc，5天后免疫功能顯著降低。

2.氫化可的松：50～100mg/kg，Sc，6～8天后免疫功能顯著降低。

3.抗淋巴細(xì)胞血清（ALS）:ip0.2ml，5～6天后免疫功能顯著降低。

4.60Co或X射線600～800拉德照射1次，4日后免疫功能顯著降低，動(dòng)物存活時(shí)間顯著縮短。目前二十三頁\總數(shù)九十三頁\編于二點(diǎn)24（3）免疫缺陷動(dòng)物

Nude小鼠：該小鼠先天性無胸腺，細(xì)胞免疫力低下，失去正常T細(xì)胞功能。但其B淋巴細(xì)胞功能基本正常。BALB/c–nu、NC-nu、C3H-nu、Swiss-nu

Scid小鼠：即重度聯(lián)合免疫缺陷小鼠。Scid小鼠外觀與普通小鼠差別不大，有毛，被毛白色，體重發(fā)育正常。但胸腺、脾、淋巴結(jié)的重量不及正常的30%，組織學(xué)上表現(xiàn)為淋巴細(xì)胞顯著缺陷。BALB/c-Scid目前二十四頁\總數(shù)九十三頁\編于二點(diǎn)25（4）自身免疫性疾病模型：

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、干燥綜合征、多發(fā)性硬化癥

（5）過敏性疾病模型：

哮喘，過敏性鼻炎，接觸性皮炎等目前二十五頁\總數(shù)九十三頁\編于二點(diǎn)26

佐劑性關(guān)節(jié)炎模型是免疫性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型的基本方法。造模多采用大鼠,足跖部皮下注射法,原發(fā)病變主要表現(xiàn)為致炎局部的炎癥反應(yīng),續(xù)發(fā)病變一般于致炎后10-20天左右出現(xiàn),20天左右達(dá)到高峰,病理改變?yōu)榛は陆M織炎癥,滑膜增生,血管翳形成,軟骨破壞,4周后,關(guān)節(jié)紅腫減退,骨質(zhì)減少,新骨形成,關(guān)節(jié)間隙變窄,形成不可逆的關(guān)節(jié)改變。AA大鼠的關(guān)節(jié)組織病理學(xué)及血中變化與人相似,同時(shí),對其免疫學(xué)機(jī)制研究發(fā)現(xiàn),此模型存在明顯的細(xì)胞免疫異常。目前二十六頁\總數(shù)九十三頁\編于二點(diǎn)27II型膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型II型膠原+完全弗氏佐劑,乳化制成乳劑,將該乳劑于小鼠的尾根部皮內(nèi)注射致炎,腹腔注射乳劑作為激發(fā)注射。表現(xiàn)為多發(fā)性外周關(guān)節(jié)炎,關(guān)節(jié)局部紅腫,嚴(yán)重致關(guān)節(jié)畸形,病理變化為增生性滑膜炎,關(guān)節(jié)軟骨破壞,骨侵蝕,關(guān)節(jié)腔內(nèi)有炎性細(xì)胞浸潤,體內(nèi)可檢出針對自身型膠原的高滴度的IgG抗體,這些臨床表現(xiàn)及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)與人密切相關(guān)。不出現(xiàn)病情的波動(dòng)和復(fù)發(fā)情況,也沒有的皮下結(jié)節(jié),漿膜炎,血管炎等表現(xiàn),不出現(xiàn)類風(fēng)濕因子及抗核抗體目前二十七頁\總數(shù)九十三頁\編于二點(diǎn)28卵蛋白誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型卵蛋白+福氏佐劑混勻,注入動(dòng)物背部皮下,致敏,末次注射后一周于關(guān)節(jié)內(nèi)注入溶解的卵蛋白,24小時(shí)內(nèi)此關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅腫熱痛等急性炎癥的表現(xiàn),發(fā)病率達(dá)100%。卵蛋白誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型的病理改變有滑膜增生、血管翳形成和軟骨及骨破壞。第一階段為關(guān)節(jié)內(nèi)注入抗原后,24小時(shí)出現(xiàn)關(guān)節(jié)腫脹,關(guān)節(jié)直徑增加,病理表現(xiàn)為急性滑膜炎。第二階段為1-4周,關(guān)節(jié)滑膜明顯增生,血管翳形成。滑膜細(xì)胞以單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞為主,其次為淋巴細(xì)胞,以CD4+淋巴細(xì)胞多見,這一階段部分動(dòng)物可出現(xiàn)早期軟骨破壞。第三階段在4周后,不可逆的關(guān)節(jié)軟骨及骨破壞出現(xiàn),最后可出現(xiàn)骨變形。最長的觀察到6個(gè)月,慢性炎癥仍存在,證明卵蛋白誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型與在發(fā)病機(jī)理上的某些類似。目前二十八頁\總數(shù)九十三頁\編于二點(diǎn)292、觀察指標(biāo)（1）非特異性免疫功能的測定指標(biāo)（2）體液免疫功能的測定指標(biāo)（3）細(xì)胞免疫功能的測定指標(biāo)3、給藥途徑和劑量4、對照實(shí)驗(yàn)?zāi)壳岸彭揬總數(shù)九十三頁\編于二點(diǎn)30（1）組間對照標(biāo)準(zhǔn)品對照組弱陽性對照組（2）自身對照（3）配對對照對照組陰性對照組空白對照組假處理對照組陽性對照組目前三十頁\總數(shù)九十三頁\編于二點(diǎn)31第二節(jié)實(shí)驗(yàn)方法一、影響非特異性免疫功能實(shí)驗(yàn)（一）碳粒廓清法【基本原理】

網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)（RES）是機(jī)體最主要的防御系統(tǒng)，具有強(qiáng)大而迅速的吞噬廓清異體顆?；蚰承┛扇苄援愇锏哪芰Γ⒛苎杆偾宄w內(nèi)自身產(chǎn)生的某些有害物質(zhì)。當(dāng)靜脈注入特定大小的惰性顆粒后，它即可被RES細(xì)胞迅速吞噬而從血流中廓清，因此，可借助測定血流中炭粒的消失速度來反映RES吞噬異物的能力。目前三十一頁\總數(shù)九十三頁\編于二點(diǎn)32【實(shí)驗(yàn)步驟】（1）取小鼠，隨機(jī)分組，給藥。（2）末次給藥后30min，每鼠iv印度墨汁0.05～0.1ml/10g體重。（3）于1min（t1）和5min（t5）后，每鼠眼眶靜脈取血20ml，加到2ml0.1%NaCO3溶液中搖勻。（4）測OD680nm，計(jì)算廓清指數(shù)（K）、吞噬指數(shù)。目前三十二頁\總數(shù)九十三頁\編于二點(diǎn)33

廓清指數(shù)K＝＝吞噬指數(shù)α＝×

即校正廓清指數(shù)目前三十三頁\總數(shù)九十三頁\編于二點(diǎn)34【注意事項(xiàng)】

（1）印度墨汁應(yīng)用NS稀釋1～5倍左右，最好經(jīng)超聲處理后離心，棄去沉淀物，以免凝集的炭粒阻塞肺毛細(xì)血管，引起動(dòng)物猝死。印度墨汁的質(zhì)量可影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確性，墨汁顆粒大小有嚴(yán)格要求，過大則不被吞噬，過小則被其他吞噬細(xì)胞吞噬，如小吞噬細(xì)胞。印度墨汁因顆粒大小均勻，能特異性地被單核巨噬細(xì)胞所吞噬，因而適用于本實(shí)驗(yàn)。（2）iv要熟練，印度墨汁的劑量、取血時(shí)間必須準(zhǔn)確無誤。另外，取血的時(shí)間間隔也可延長至10分鐘。目前三十四頁\總數(shù)九十三頁\編于二點(diǎn)35【評價(jià)】

印度墨汁法測定RES吞噬活性是最經(jīng)典的一種免疫學(xué)研究方法，實(shí)驗(yàn)條件要求不高，方法簡便，結(jié)果可靠，重現(xiàn)性好。若再配合小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬消化雞紅血球?qū)嶒?yàn)及白細(xì)胞游走實(shí)驗(yàn)，則可較全面地反映單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)清除異物功能狀態(tài)。目前三十五頁\總數(shù)九十三頁\編于二點(diǎn)36（二）小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞法【基本原理】

Mφ具有強(qiáng)大的吞噬能力，雞紅細(xì)胞對鼠類是一種較強(qiáng)的抗原性異物，當(dāng)其被注入小鼠腹腔后，可引起腹腔Mφ聚集并吞噬，注入定量雞紅細(xì)胞（CRBC），隔一定時(shí)間后，吸取腹腔Mφ，鏡檢其吞噬活性，并以吞噬百分率及吞噬指數(shù)的高低表示Mφ吞噬能力的大小。目前三十六頁\總數(shù)九十三頁\編于二點(diǎn)37【實(shí)驗(yàn)步驟】

（1）取18～22g小鼠，雌雄各半，隨機(jī)分組。（2）若篩選免疫抑制藥，預(yù)先用Mφ誘導(dǎo)劑，可在實(shí)驗(yàn)前3～4天，ip0.5％淀粉生理鹽水溶液，每鼠0.5ml。（3）4天后，ip，5％CRBC0.5ml。8～12h后脫頸椎處死小鼠，ip2mlNS，輕揉腹部1min，然后吸出洗液1ml，分滴于兩片載玻片上，放入墊有濕紗布的搪瓷盒內(nèi)，移置37℃孵箱溫育30min。（4）用NS漂洗，除去未粘片的細(xì)胞。晾干，1∶1丙酮－甲醇溶液固定5min。4％（V/V）Giemsa－磷酸緩沖液染色3min，用流水沖洗、晾干，鏡檢。目前三十七頁\總數(shù)九十三頁\編于二點(diǎn)38【結(jié)果判定】

油鏡下計(jì)每片200個(gè)Mφ，計(jì)算吞噬百分率、吞噬指數(shù)。吞噬百分率＝×100％吞噬指數(shù)＝÷2目前三十八頁\總數(shù)九十三頁\編于二點(diǎn)39CRBC被消化的程度，通常分4級：

Ⅰ級：未消化。CRBC完整，胞質(zhì)淺紅或淺黃帶綠色，胞核呈淺紫紅色。

Ⅱ級：輕度消化。胞質(zhì)淺黃綠色，胞核固縮呈紫藍(lán)色。

Ⅲ級：重度消化。胞質(zhì)淡染，胞核呈淺灰黃色。

Ⅳ級：完全消化。Mφ內(nèi)僅見形態(tài)類似CRBC大小的空泡，邊緣整齊，胞核隱約可見。目前三十九頁\總數(shù)九十三頁\編于二點(diǎn)40【注意事項(xiàng)】

（1）實(shí)驗(yàn)各步驟均需保持無菌操作。Mφ誘導(dǎo)劑僅用于免疫抑制藥研究。（2）若滴片染色過深，可用1%HCl脫色，過淺則可復(fù)染。（3）每鼠兩片的計(jì)數(shù)應(yīng)基本一致，若差距過大，應(yīng)予淘汰。腹腔吸出的液體若有血性滲出時(shí)，則不宜使用。目前四十頁\總數(shù)九十三頁\編于二點(diǎn)41（4）掌握好實(shí)驗(yàn)時(shí)間，時(shí)間太短，吞噬雞紅細(xì)胞較少，過長則雞紅細(xì)胞已被消化。（5）避免腹腔注射受試藥物，以免干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果?！驹u價(jià)】

本法簡便，但操作慢而欠精確，可配合其他方法進(jìn)行綜合分析。目前四十一頁\總數(shù)九十三頁\編于二點(diǎn)42（三）巨噬細(xì)胞吞噬作用的化學(xué)發(fā)光測定法【基本原理】

化學(xué)反應(yīng)中電子激發(fā)態(tài)產(chǎn)物，在其回到基態(tài)過程中，以光的形式釋放能量or將能量轉(zhuǎn)移到另一分子而發(fā)射光子，利用發(fā)光檢測儀測定發(fā)射光的強(qiáng)度or速度，即可計(jì)算發(fā)光物質(zhì)or發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記的抗原or抗體的含量。測定發(fā)光強(qiáng)度的方法，即光子計(jì)數(shù)法，可用液體閃爍儀進(jìn)行測定。

目前四十二頁\總數(shù)九十三頁\編于二點(diǎn)43

Mφ吞噬顆粒or受其他生物與化學(xué)因子刺激后，細(xì)胞代謝猛增，其特征是耗氧量增加，產(chǎn)生大量自由基（氧負(fù)離子、過氧化氫、羥自由基、單線態(tài)氧），同時(shí)，往往伴有化學(xué)發(fā)光現(xiàn)象，但十分微弱，難以檢測。若在體系中加入魯米諾等發(fā)光增強(qiáng)劑，就能增強(qiáng)發(fā)光強(qiáng)度，因?yàn)檠趸瘎┘ぐl(fā)魯米諾，可發(fā)出425nm的光，易被檢測到。目前四十三頁\總數(shù)九十三頁\編于二點(diǎn)44【操作步驟】

（1）用HBSS將Mφ調(diào)整至2×106個(gè)/ml的細(xì)胞懸液備用。（2）取細(xì)胞懸液1ml，置聚乙烯小管中，加入10-4M魯米諾200ml，將小管放入液閃測量瓶中，測定發(fā)光6秒鐘，作為本底。（3）加入調(diào)理的酵母多糖200ml，搖勻，即刻測發(fā)光6秒鐘，以后每隔3～5min測一次發(fā)光，直至加酵母多糖1h。（4）以發(fā)光強(qiáng)度（cpm）為縱坐標(biāo)，加酵母多糖后的時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制Mφ吞噬發(fā)光的動(dòng)力曲線。比較各組的峰高、峰時(shí)（峰高的時(shí)間）、發(fā)光積分值及早期曲線斜率的變化。目前四十四頁\總數(shù)九十三頁\編于二點(diǎn)45【注意事項(xiàng)】

（1）注意無菌操作。所用試管、滴管、緩沖液等均需高壓滅菌，應(yīng)在超凈臺(tái)內(nèi)操作，避免污染。（2）用臺(tái)盼藍(lán)染色，Mφ活力應(yīng)在90％以上。（3）所用藥物應(yīng)能完全溶解，懸浮的微粒將會(huì)影響Mφ的反應(yīng)性。（4）小試管與測量瓶先置暗室24h，整個(gè)操作系統(tǒng)均在暗室進(jìn)行。目前四十五頁\總數(shù)九十三頁\編于二點(diǎn)46【方法評價(jià)】

（1）本法也可檢測Mφ氧代謝功能與血清調(diào)理作用，故作為檢測吞噬功能的指標(biāo)的專一性不夠。（2）因液閃儀無溫控裝置，不能使反應(yīng)系統(tǒng)達(dá)到37℃，只能通過恒定的室溫（25±1℃）與水浴37℃進(jìn)行間接控制。目前四十六頁\總數(shù)九十三頁\編于二點(diǎn)47（四）溶菌酶測定法【基本原理】

溶菌酶是一種小分子蛋白質(zhì)，存在于機(jī)體的淚液、痰、鼻涕、WBC、血清等。測定它在體液or分泌物中的含量及其變動(dòng)情況，可作為側(cè)面了解機(jī)體防御功能的一個(gè)指標(biāo)。體液和分泌物中的溶菌酶活性，可通過檢查其對指定敏感菌株的裂解作用來進(jìn)行測定。目前四十七頁\總數(shù)九十三頁\編于二點(diǎn)482種測定法：（1）光學(xué)測定法：將檢品與菌液混合，用分光光度計(jì)觀察指定時(shí)間內(nèi)透光度改變的百分?jǐn)?shù)。（2）平板打孔測定法：在混有菌液的瓊脂凝膠上打孔，檢品放在孔內(nèi)，一定時(shí)間后測定溶菌環(huán)直徑。目前四十八頁\總數(shù)九十三頁\編于二點(diǎn)49二、影響特異性體液免疫功能的實(shí)驗(yàn)方法（一）血清溶血素測定法【基本原理】

經(jīng)SRBC免疫動(dòng)物的淋巴細(xì)胞可產(chǎn)生抗SRBC抗體（溶血素），并釋放至外周血。這種抗體在試管內(nèi)與SRBC溫育，在補(bǔ)體（正常血清中的一組酶蛋白，具有溶解和殺傷細(xì)胞，增強(qiáng)吞噬等作用）參與下可產(chǎn)生溶血反應(yīng)，通過測定血紅蛋白的釋放量多少來間接測出血清中溶血素的含量。血紅蛋白與都氏試劑反應(yīng)形成氰化血紅蛋白后比色測定。目前四十九頁\總數(shù)九十三頁\編于二點(diǎn)50【操作步驟】

（1）免疫：小鼠，ip20％SRBC0.2ml/天，第4天取血、分離血清，將血清稀釋后供測定（一般500倍以上）。（2）溶血反應(yīng)：在試管內(nèi)依次加入血清1ml、5％SRBC0.5ml、10％補(bǔ)體1ml，置37℃水浴30min，然后移至冰浴中終止反應(yīng)，1500rpm離心5min，取上清1ml，加都氏液3ml，搖勻放置10min，測OD540nm。目前五十頁\總數(shù)九十三頁\編于二點(diǎn)51（3）SRBC半數(shù)溶血值：取5％SRBC0.25ml加都氏液4ml，測OD540nm。（4）計(jì)算：樣品管半數(shù)溶血值HC50：每只鼠的血清HC50＝

×稀釋倍數(shù)目前五十一頁\總數(shù)九十三頁\編于二點(diǎn)52【評價(jià)】

（1）簡單易行，快速，重復(fù)性好。測定HC50較準(zhǔn)確，客觀，可克服溶血空斑法用肉眼計(jì)數(shù)的錯(cuò)誤。（2）本實(shí)驗(yàn)用615純種小鼠測出的數(shù)據(jù)比較穩(wěn)定，重現(xiàn)性好。目前五十二頁\總數(shù)九十三頁\編于二點(diǎn)53（二）抗體形成細(xì)胞測定法（PFC）1溶血空斑試驗(yàn)（haemolyticplaqueassay，HPA）【基本原理】

PFC是一種體外檢測單個(gè)抗體形成細(xì)胞（漿細(xì)胞）的方法。將SRBC免疫的小鼠脾細(xì)胞、SRBC、補(bǔ)體混合于瓊脂內(nèi)，抗體形成細(xì)胞分泌的抗體在補(bǔ)體的參與下，使其周圍的SRBC的溶解形成肉眼可見的溶血空斑，這種溶血空斑大體上可以反映抗體形成細(xì)胞數(shù)。方法：瓊脂固相法（平皿法）：常用。

液相單層細(xì)胞法（玻片法）：很少使用。目前五十三頁\總數(shù)九十三頁\編于二點(diǎn)目前五十四頁\總數(shù)九十三頁\編于二點(diǎn)55直接溶血空斑試驗(yàn):測定產(chǎn)生IgM型抗體的細(xì)胞。因?yàn)榛罨a(bǔ)體的能力強(qiáng)，只加細(xì)胞和補(bǔ)體即可出現(xiàn)空斑，故稱直接溶血空斑測定。間接溶血空斑試驗(yàn):產(chǎn)生其他類型抗體的（如IgG或IgA等）細(xì)胞檢測，需要加靶細(xì)胞和抗各類Ig的抗血清,再加補(bǔ)體才能出現(xiàn)可見的空斑，故稱間接溶血空斑測定。目前五十五頁\總數(shù)九十三頁\編于二點(diǎn)56【操作步驟】（1）瓊脂固相法――直接法

1）免疫動(dòng)物：選用純系小鼠，隨機(jī)分組，每鼠腹腔注射5％的SRBC0.2ml致敏。

2）制備補(bǔ)體，同前。

3）制備底層瓊脂：稱取1.4g瓊脂糖加入100mlGey’s液中，煮沸，溶化后分裝若干只預(yù)溫的試管，每管5ml，置45℃恒溫水浴保溫。然后傾入水平放置的平皿（直徑9cm）中，凝固后打開平皿蓋，將平皿反扣放入37℃溫箱1h，備用。目前五十六頁\總數(shù)九十三頁\編于二點(diǎn)574）制備脾細(xì)胞懸液：免疫后第4天，用冷Gey’s制備107/ml脾細(xì)胞懸液，置4℃冰箱備用。5）上層瓊脂的制備：稱取0.7瓊脂糖加入100mlGey’s液中煮沸，溶化后分裝若干只預(yù)溫的試管，每管1.5ml，置45℃恒溫水浴保溫。逐個(gè)取出，依次加入SRBC懸液（2×109/ml）0.1ml、107/ml脾細(xì)胞懸液0.1ml，充分混勻，立即傾入上述制備好的底層瓊脂平皿中，均勻鋪平，凝固后靜止10min。目前五十七頁\總數(shù)九十三頁\編于二點(diǎn)586）將平皿置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2h，每皿中加入1∶10稀釋的豚鼠血清1.0ml，均勻覆蓋于表面，繼續(xù)溫育40～50min，取出后置室溫1h，4℃冰箱過夜，次日傾去補(bǔ)體，or加入0.25%的戊二醛（NS配置），使細(xì)胞固定后計(jì)數(shù)空斑。目前五十八頁\總數(shù)九十三頁\編于二點(diǎn)59

7）空斑計(jì)數(shù)與評定：用放大鏡or雙目解剖鏡可見每個(gè)空斑由抗體分泌細(xì)胞及其周圍的透明區(qū)域組成。計(jì)數(shù)每個(gè)平皿（106個(gè)細(xì)胞）的空斑數(shù)。（2）瓊脂固相法――間接法：在上述5）中再加入適當(dāng)濃度的抗-Ig血清0.1ml，其他步驟相同。目前五十九頁\總數(shù)九十三頁\編于二點(diǎn)60

【注意事項(xiàng)】（1）SRBC既是免疫細(xì)胞，又是靶細(xì)胞和指示細(xì)胞，故SRBC要新鮮，洗滌不得超過3次，每次離心5min。用Alsever’s液保存的SRBC可使用2周。（2）為了消除非特異性溶血，豚鼠血清在使用前必須經(jīng)SRBC吸收，補(bǔ)體的濃度以1∶10稀釋為宜。目前六十頁\總數(shù)九十三頁\編于二點(diǎn)61（3）制備脾細(xì)胞懸液：若將取出的脾立即放入0℃冰浴，可明顯降低空斑計(jì)數(shù)；在20℃以下操作，不超過15min，對空斑計(jì)數(shù)并無影響。（4）測定抗血清的顯斑常數(shù)（KD）和抑斑常數(shù)（KI），作為空斑計(jì)數(shù)的校正。目前六十一頁\總數(shù)九十三頁\編于二點(diǎn)62

（5）傾注底層瓊脂糖時(shí)，一定要將平皿放置水平位置，以便使底層瓊脂糖水平光滑。傾上層瓊脂糖時(shí)，各種細(xì)胞成分要充分混勻。不能劇烈震蕩，以免出現(xiàn)氣泡。水浴溫度應(yīng)控制在47～49℃之間，溫度過高使細(xì)胞變性；過低使瓊脂糖凝固，影響細(xì)胞分散。目前六十二頁\總數(shù)九十三頁\編于二點(diǎn)632分光光度法【基本原理】

又稱SRBC的定量溶血測定法，基本原理同溶血空斑法。但本法可定量測定抗體形成細(xì)胞所分泌的抗體，較溶血空斑法精確。同時(shí)操作比較簡便。目前六十三頁\總數(shù)九十三頁\編于二點(diǎn)64【操作步驟】

（1）免疫動(dòng)物：同前。（2）制備脾細(xì)胞懸液：基本同前，制成5×106/ml脾細(xì)胞懸液，或按15mg脾重/ml制成脾細(xì)胞懸液。（3）溶血反應(yīng)：取試管若干只，每管依次加入脾細(xì)胞懸液、0.2％SRBC、1∶10豚鼠血清各0.5ml，充分混勻，另設(shè)不加補(bǔ)體的空白組。置37℃水浴中溫育1h，離心3000rpm，5min。（4）測OD值：取上清測OD413nm。目前六十四頁\總數(shù)九十三頁\編于二點(diǎn)65【注意事項(xiàng)】

（1）若使用雜種鼠時(shí)，宜將每兩只小鼠的脾混合液制備脾細(xì)胞懸液，可減少實(shí)驗(yàn)誤差。（2）反應(yīng)系統(tǒng)中其他條件不變時(shí)，SRBC濃度可根據(jù)受試藥的免疫增強(qiáng)or抑制作用作適當(dāng)調(diào)整。目前六十五頁\總數(shù)九十三頁\編于二點(diǎn)66三、影響特異性細(xì)胞免疫功能的實(shí)驗(yàn)方法（一）淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)（3H-TdR摻入法）【基本原理】

淋巴細(xì)胞在有絲分裂原的刺激下，轉(zhuǎn)化為母細(xì)胞，并分化增殖，細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和核酸合成增加，并釋放多種淋巴因子。如在培養(yǎng)液中加入3H-TdR，使其摻入到新合成的DNA中，可以定量細(xì)胞內(nèi)的DNA合成強(qiáng)度。目前六十六頁\總數(shù)九十三頁\編于二點(diǎn)67有絲分裂原：

PHA（植物血凝素）――刺激T細(xì)胞

Con-A（刀豆球蛋白）――刺激T細(xì)胞

LPS（脂多糖）――刺激B細(xì)胞目前六十七頁\總數(shù)九十三頁\編于二點(diǎn)68【操作步驟】

（1）純系小鼠，2～3月齡，雌雄均可。處死小鼠，在無菌條件下迅速取出脾臟，放入盛有RPMI1640培養(yǎng)液的平皿中（冰浴），剪碎，用注射器針芯搗爛，過100目鋼篩，制成脾細(xì)胞懸液。（2）用培養(yǎng)液離心洗滌脾細(xì)胞3次，用臺(tái)盼藍(lán)檢查活細(xì)胞數(shù)在95％以上。將細(xì)胞用培養(yǎng)液稀釋成2×106個(gè)/ml。目前六十八頁\總數(shù)九十三頁\編于二點(diǎn)69

（3）將脾細(xì)胞加入96孔培養(yǎng)板，每孔200μl，3～4復(fù)孔（也可更多）。加入有絲分裂原，培養(yǎng)72h。（4）終止前6h，每孔加入3H-TdR

1ml，使其終濃度為1～5μci/ml。（5）用微量多頭細(xì)胞收集儀，將細(xì)胞抽吸在49型玻璃纖維濾紙上，置80℃烘箱內(nèi)干燥30min。（6）將烘干的濾紙片放入盛有閃爍液的小瓶中，用液閃儀測定樣品中的放射強(qiáng)度（cpm）。目前六十九頁\總數(shù)九十三頁\編于二點(diǎn)目前七十頁\總數(shù)九十三頁\編于二點(diǎn)71【注意事項(xiàng)】

（1）無菌操作。（2）脾細(xì)胞制備要放在冰浴中，避免細(xì)胞死亡帶來誤差。（3）中藥粗制劑中影響因素較多，注意假陽性?！驹u價(jià)】（1）3H-TdR摻入法客觀準(zhǔn)確。經(jīng)典方法。（2）可直接觀察藥物本身對淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響，也可觀察與有絲分裂原的協(xié)同or拮抗作用。目前七十一頁\總數(shù)九十三頁\編于二點(diǎn)72MTT法：【基本原理】

Mosmann等根據(jù)細(xì)胞內(nèi)能量代謝水平與DNA合成水平平行相關(guān)，首創(chuàng)了四甲基偶氮唑鹽（MTT）比色法。MTT進(jìn)入細(xì)胞后作為反應(yīng)底物，被氧化成藍(lán)色的甲臜（formazan），存積于細(xì)胞內(nèi)及周圍，加入DMSO，使細(xì)胞破裂，并使細(xì)胞內(nèi)甲臜釋放出來，測定OD490nm。

目前七十二頁\總數(shù)九十三頁\編于二點(diǎn)73（二）二硝基氟苯誘導(dǎo)小鼠DTH反應(yīng)【基本原理】

DNFB是一種半抗原，將其溶液涂抹腹部皮膚后，與皮膚蛋白結(jié)合成完全抗原，由此刺激T淋巴細(xì)胞增殖成致敏淋巴細(xì)胞。4~7天后將其再次涂抹皮膚，可使局部產(chǎn)生DTH反應(yīng)，一般在抗原攻擊24~48h達(dá)高峰，故此時(shí)測定局部腫脹。目前七十三頁\總數(shù)九十三頁\編于二點(diǎn)74【操作步驟】

（1）致敏：小鼠，隨機(jī)分組，腹部去毛，范圍約3×3cm2，并將1％DNFB溶液均勻涂抹于腹部皮膚，必要時(shí)于次日再強(qiáng)化一次。（2）DTH反應(yīng)產(chǎn)生與測定：致敏后第5天，將1％DNFB溶液10μl均勻涂抹于小鼠右耳（兩面）進(jìn)行攻擊，對照組同樣涂耳但未致敏。目前七十四頁\總數(shù)九十三頁\編于二點(diǎn)75

攻擊24h后，脫頸處死小鼠，用直徑8mm的打孔器打下圓形耳片，稱重，以左右耳片總量之差為腫脹度；同時(shí)取小鼠胸腺及脾臟稱重，計(jì)算脾指數(shù)和胸腺指數(shù)（以每10g體重計(jì)）。【注意事項(xiàng)】

（1）DNFB溶液要臨用前新鮮配制。（2）在小鼠腹部應(yīng)盡量去毛，且應(yīng)避免剪破皮膚。（3）操作者避免DNFB與皮膚接觸。實(shí)驗(yàn)環(huán)境控制在20±2℃為宜。目前七十五頁\總數(shù)九十三頁\編于二點(diǎn)小結(jié)一、影響非特異性免疫功能實(shí)驗(yàn)（一）碳粒廓清法/吞噬雞紅細(xì)胞法/化學(xué)發(fā)光測定法(巨噬細(xì)胞)（二）溶菌酶測定法（三）硝類蘭四氮唑（NBT）還原試驗(yàn)(中性粒細(xì)胞)（四）NK細(xì)胞活性檢測,LDH法二、影響體液免疫功能的實(shí)驗(yàn)方法（一）血清溶血素測定法（二）抗體形成細(xì)胞測定法（PFC）（三）抗體水平的檢測三、影響細(xì)胞免疫功能的實(shí)驗(yàn)方法（一）淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)（二）DTH反應(yīng)（三）細(xì)胞因子測定（四）細(xì)胞亞群檢測目前七十六頁\總數(shù)九十三頁\編于二點(diǎn)77常用免疫學(xué)技術(shù)免疫沉淀

利用抗原抗體特異性反應(yīng)純化富集目的蛋白的一種方法?？贵w與細(xì)胞裂解液或表達(dá)上清中相應(yīng)的蛋白結(jié)合后，再與蛋白A／G（ProteinA／G）或二抗偶聯(lián)的agaose或Sepharose珠子孵育，通過離心得到珠子－蛋白A／G或二抗－抗體－目的蛋白復(fù)合物，沉淀經(jīng)洗滌后，在高溫及還原劑的作用下，抗原與抗體解離，離心收集上清，上清中包括抗體、目的蛋白和少量的雜蛋白。

目前七十七頁\總數(shù)九十三頁\編于二點(diǎn)78目前七十八頁\總數(shù)九十三頁\編于二點(diǎn)2.免疫轉(zhuǎn)印技術(shù)基本原理是將蛋白質(zhì)先行電泳分帶，然后將其轉(zhuǎn)印