細(xì)胞凋亡與疾病高級(jí)病生

細(xì)胞凋亡與疾病高級(jí)病生細(xì)胞凋亡與疾病高級(jí)病生第1頁●

概述●

凋亡時(shí)細(xì)胞主要改變●

細(xì)胞凋亡過程與調(diào)控●細(xì)胞凋亡發(fā)生機(jī)制●

細(xì)胞凋亡常見研究方法●

細(xì)胞凋亡與疾病細(xì)胞凋亡與疾病高級(jí)病生第2頁一.概述(一)凋亡概念提出

1965年澳大利亞科學(xué)家發(fā)覺，結(jié)扎鼠門靜脈后，電鏡觀察到肝實(shí)質(zhì)組織中有一些散在死亡細(xì)胞，顯然不一樣于細(xì)胞壞死。這些細(xì)胞體積收縮、染色質(zhì)凝集從其周圍組織中脫落并被吞噬，機(jī)體無炎癥反應(yīng)。1972年Kerr等三位科學(xué)家首次提出了細(xì)胞凋亡概念。細(xì)胞凋亡與疾病高級(jí)病生第3頁

apoptosis(細(xì)胞凋亡)：由體內(nèi)外原因觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)預(yù)存死亡程序而造成細(xì)胞死亡過程稱為細(xì)胞凋亡，又稱programmedcelldeath,PCD(程序性細(xì)胞死亡)細(xì)胞凋亡與疾病高級(jí)病生第4頁(二)細(xì)胞凋亡研究歷史

1.1972-1987：細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)及生物化學(xué)研究階段：

1）利用光鏡和電鏡對(duì)形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行了詳細(xì)研究。

2）染色體DNA降解。3）RNA/蛋白質(zhì)大分子合成。

4）鈣離子改變。

5）內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶。細(xì)胞凋亡與疾病高級(jí)病生第5頁2.細(xì)胞凋亡分子生物學(xué)研究階段:

1）細(xì)胞凋亡相關(guān)基因及調(diào)控

2）細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

3）細(xì)胞凋亡各種分子及其相互作用

3.細(xì)胞凋亡臨床應(yīng)用基礎(chǔ)研究階段

細(xì)胞凋亡與疾病高級(jí)病生第6頁(三)細(xì)胞凋亡生物學(xué)意義確保正常發(fā)育、生長(zhǎng)。維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。發(fā)揮主動(dòng)防御功效。細(xì)胞凋亡與疾病高級(jí)病生第7頁二.凋亡時(shí)細(xì)胞主要改變

(一)形態(tài)學(xué)改變

細(xì)胞凋亡與疾病高級(jí)病生第8頁正常細(xì)胞凋亡小體吞噬細(xì)胞壞死凋亡細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死比較細(xì)胞凋亡與疾病高級(jí)病生第9頁細(xì)胞間連接喪失；2）胞體固縮；3）細(xì)胞器完整；4）核固縮；5）染色質(zhì)邊集；6）凋亡小體形成1、凋亡主要形態(tài)學(xué)改變細(xì)胞凋亡與疾病高級(jí)病生第10頁

表面微絨毛消失，并逐步脫離與周圍細(xì)胞接觸。細(xì)胞體積逐步縮小，出現(xiàn)固縮(condensation)。胞漿脫水，胞膜快速發(fā)生空泡化(blebbing)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張并與胞膜融合，形成出芽(buding)現(xiàn)象。晚期出現(xiàn)染色質(zhì)邊集(margination)。線粒體和溶酶體形態(tài)結(jié)構(gòu)改變不大。

形成凋亡小體(apoptosisbody),這是凋亡細(xì)胞特征形態(tài)學(xué)改變。*******細(xì)胞凋亡與疾病高級(jí)病生第11頁2、細(xì)胞凋亡與壞死比較

壞死凋亡

誘導(dǎo)原因強(qiáng)烈刺激，隨機(jī)發(fā)生較弱刺激，非隨機(jī)發(fā)生生化性質(zhì)病理性，非特異性生理性或病理性，特異性特點(diǎn)被動(dòng)過程，無新蛋白主動(dòng)過程，有新蛋白合成，合成,不耗能，耗能形態(tài)改變細(xì)胞結(jié)構(gòu)全方面溶解、胞膜及細(xì)胞器相對(duì)完整，細(xì)破壞、細(xì)胞腫脹胞皺縮，核固縮

DNA電泳彌散性降解，電泳呈DNA片段化(180-200bp)，電均一DNA片狀泳呈“梯”狀條帶炎癥反應(yīng)溶酶體破裂，局部炎溶酶體相對(duì)完整，局部無炎癥癥反應(yīng)反應(yīng)

凋亡小體無有

基因調(diào)控?zé)o有

細(xì)胞凋亡與疾病高級(jí)病生第12頁3、

細(xì)胞凋亡、PCD區(qū)分

特征PCD細(xì)胞凋亡

形態(tài)學(xué)細(xì)胞固縮，裂成小體同左膜完整性保持到晚期同左線粒體常有陣發(fā)自噬作用無改變?nèi)旧|(zhì)凝聚，電子致密度加大著邊自噬作用常有，但并非一定發(fā)生無潛伏期幾小時(shí)幾分鐘到幾小時(shí)蛋白質(zhì)合成放線菌素D及放線菌酮放線菌素D及放線阻斷死亡有時(shí)阻斷死亡胞漿生化改變?nèi)苊阁w酶活性有時(shí)增加，溶酶體增加，c-myc,

偶有熱休克蛋白、c-myc，c-fos?c-fos↑

核DNA電泳無梯狀DNA梯狀DNA圖譜首先表現(xiàn)蛋白質(zhì)合成下降，方式改變內(nèi)源性核酸酶活化細(xì)胞凋亡與疾病高級(jí)病生第13頁4、細(xì)胞凋亡與脹亡比較

脹亡凋亡

早期細(xì)胞腫脹涉及胞內(nèi)結(jié)構(gòu)細(xì)胞皺縮、體積縮小、胞漿濃縮胞漿疏松化而且有空泡形及出芽改變成體積增大形態(tài)改變胞膜完整性破壞、胞膜及細(xì)胞器相對(duì)完整

細(xì)胞器崩解

DNA電泳非特異性DNA片段化(180-200bp)，電

DNA片段泳呈“梯”狀條帶炎癥反應(yīng)周圍顯著炎溶酶體相對(duì)完整，局部無炎癥癥反應(yīng)反應(yīng)

凋亡小體無有1997年美國毒理病理學(xué)會(huì)細(xì)胞死亡命名委員會(huì)將細(xì)胞死亡路徑分為凋亡和脹亡（Oncosis）細(xì)胞凋亡與疾病高級(jí)病生第14頁(二)細(xì)胞凋亡生化改變1.DNA片段化：判斷凋亡發(fā)生客觀指標(biāo)之一內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶作用引發(fā)DNA斷裂產(chǎn)生單鏈缺口優(yōu)先發(fā)生于核小體連接區(qū)，使DNA斷裂成核小體倍數(shù)大小片段,即180-200bp倍數(shù)大小片段,在瓊脂糖凝膠電泳上出現(xiàn)經(jīng)典階梯狀DNA區(qū)帶。

細(xì)胞凋亡與疾病高級(jí)病生第15頁凋亡早期即發(fā)生；核小體間連接部位斷裂成180～200bp整倍數(shù)片段；染色質(zhì)DNA單鏈斷裂。細(xì)胞凋亡與疾病高級(jí)病生第16頁細(xì)胞凋亡與疾病高級(jí)病生第17頁2.內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶激活及其作用(Ca2+/Mg2+)DNaseⅠ、DNaseⅡ(pH=6.2左右）

,TopoⅠ、TopoⅡ（解旋）

細(xì)胞凋亡與疾病高級(jí)病生第18頁（1）caspases結(jié)構(gòu)

結(jié)構(gòu):caspase組員都含有相同氨基酸序列、結(jié)構(gòu)和底物特異性，正常時(shí)它們都以酶原（30-50KD）形式存在，包含三個(gè)結(jié)構(gòu)域：一個(gè)N末端原結(jié)構(gòu)域，一個(gè)大亞基（20Kd），一個(gè)小亞基（10kd）。3.caspases激活細(xì)胞凋亡與疾病高級(jí)病生第19頁（2）caspases特點(diǎn)：⊙活性中心半胱氨酸⊙在催化底物時(shí)，總是在天冬氨酸殘基C端裂解底物⊙caspases酶原活性很低，需要切除氨基端一段序列才能被激活⊙活化caspases能夠特異水解一套蛋白底物,從而造成細(xì)胞凋亡

⊙細(xì)胞內(nèi)caspases與其抑制劑總是共存，以免Caspases酶原被意外激活，對(duì)正常細(xì)胞造成損傷細(xì)胞凋亡與疾病高級(jí)病生第20頁（3）caspases分類：依據(jù)大小亞單位序列同源性以及功效:細(xì)胞因子處理組：1，4，5，11，12，13，14凋亡起始組：2，8，9，10凋亡效應(yīng)組：3，6，7，細(xì)胞凋亡與疾病高級(jí)病生第21頁(4)caspase活化:前體N-端前肽和大亞基之間特定位點(diǎn)被水解去除N-端前肽，然后再在大小亞基之間切割釋放大小亞基，由大亞基和小亞基組成異源二聚體，再由兩個(gè)二聚體形成有活性四聚體。細(xì)胞凋亡與疾病高級(jí)病生第22頁（5）激活方式：⊙自活化（autoactivation）:長(zhǎng)原結(jié)構(gòu)域(caspases-8,10)⊙轉(zhuǎn)活化（transactivation）:短原結(jié)構(gòu)域(caspases-3,6,7)⊙連接調(diào)整亞單位激活:(caspases-9)⊙非caspase蛋白酶活化（activationbynon-caspaseproteinases）:細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞顆粒酶B(caspase-3,7,8,910）

，組織蛋白酶G(caspase-7）

細(xì)胞凋亡與疾病高級(jí)病生第23頁Apaf-1細(xì)胞凋亡與疾病高級(jí)病生第24頁（5）激活方式：⊙自活化（autoactivation）:長(zhǎng)原結(jié)構(gòu)域(caspases-8,10)⊙轉(zhuǎn)活化（transactivation）:短原結(jié)構(gòu)域(caspases-3,6,7)⊙連接調(diào)整亞單位激活:(caspases-9)⊙非caspase蛋白酶活化（activationbynon-caspaseproteinases）:細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞顆粒酶B(caspase-3,7,8,910）

，組織蛋白酶G(caspase-7）

細(xì)胞凋亡與疾病高級(jí)病生第25頁（6）當(dāng)前已知Caspase功效有：①滅活凋亡抑制蛋白。②直接作用于細(xì)胞結(jié)構(gòu)，裂解核纖層，使核纖層蛋白崩解，造成細(xì)胞染色質(zhì)固縮。

③分解與細(xì)胞骨架組成相關(guān)蛋白其中包含凝膠原蛋白（gelsin）、聚合粘附激酶（focaladhesionkinase,FAK）、P21活化激酶α（PAKα）等，引發(fā)細(xì)胞結(jié)構(gòu)重組、凋亡。④caspase可使一些與DNA修復(fù)、復(fù)制和mRNA縫結(jié)相關(guān)蛋白調(diào)整區(qū)和催化區(qū)解離，瓦解核結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞降解為凋亡小體。細(xì)胞凋亡與疾病高級(jí)病生第26頁(7)Caspase抑制劑：①病毒性抑制劑：1)牛痘病毒蛋白CrmA（cytokineresponsemodifierA）：直接作用于成熟Caspase活性位點(diǎn)有效抑制Caspase1，4，6，8，對(duì)Caspase2，3，7，10效果差2)P35:以競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合方式與靶分子形成穩(wěn)定含有空間位阻效應(yīng)復(fù)合體細(xì)胞凋亡與疾病高級(jí)病生第27頁②肽類抑制劑：Ac-DEVD.CHO,AcYVAD.CHO,z-VAD.fmk③Bcl-2蛋白家族：④其它:NO及其相關(guān)分子，鋅3)桿狀病毒蛋白IAP（inhibitorofapoptosisfamilyprotein，7種），不是活性位點(diǎn)特異性抑制劑4)V-FLIP：包含兩個(gè)DED，與Caspase競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合死亡受體復(fù)合物5)蛋白HBx（乙肝病毒編碼）：Caspase-3細(xì)胞凋亡與疾病高級(jí)病生第28頁

4、大分子合成

(1)細(xì)胞凋亡需要RNA和（或）蛋白質(zhì)合成，大分子合成抑制劑可阻斷細(xì)胞凋亡；(2)細(xì)胞凋亡發(fā)生前所需生物大分子已存在于細(xì)胞內(nèi)，只是被分割開來或以無活性狀態(tài)存在，其活化需要磷酸化、去磷酸化或一些離子存在,除非有活化信號(hào)傳入，它們對(duì)細(xì)胞并不造成損害，這種情況下細(xì)胞凋亡不受蛋白質(zhì)或RNA合成抑制劑影響；

細(xì)胞凋亡與疾病高級(jí)病生第29頁(3)細(xì)胞內(nèi)已經(jīng)有凋亡所需大分子物質(zhì)，只是其功效被其它生物大分子（如bcl-2）連續(xù)合成所抑制，此時(shí)蛋白質(zhì)或RNA合成抑制劑能促進(jìn)細(xì)胞凋亡發(fā)生。5、鈣離子動(dòng)員細(xì)胞凋亡與疾病高級(jí)病生第30頁內(nèi)鈣釋放外鈣內(nèi)流

[Ca2+]i增加

內(nèi)鈣釋放和外鈣內(nèi)流路徑鈣池細(xì)胞凋亡與疾病高級(jí)病生第31頁Ca2+↑引發(fā)細(xì)胞凋亡機(jī)制線粒體肌漿網(wǎng)損傷刺激肌漿Ca2+↑鈣蛋白酶染色質(zhì)凝集磷脂酶磷脂分解谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶骨架蛋白破壞核酶染色體損傷細(xì)胞凋亡與疾病高級(jí)病生第32頁似秋葉凋零，離別生命之輝煌；那難以計(jì)數(shù)攻擊、誘導(dǎo)，輕啟著道道程序，逼細(xì)胞步步走向生命末端；啊，活性氧處處肆虐，鈣波濤驚石裂岸，線粒體把生命之光一點(diǎn)一點(diǎn)擰淡;細(xì)胞凋亡與疾病高級(jí)病生第33頁危難中細(xì)胞啊，你沉穩(wěn)不亂，DNA片片切割，化云梯直通天堂；細(xì)胞體分團(tuán)相聚，把生命凝重濃集在小體上；分別了朝夕相處搭檔，再見了高興美好時(shí)光；這一切一切又融入臨近胞體，騰出空間再寫生命篇章。

細(xì)胞凋亡與疾病高級(jí)病生第34頁三.細(xì)胞凋亡過程與調(diào)控細(xì)胞凋亡與疾病高級(jí)病生第35頁凋亡誘導(dǎo)原因受體cAMPCa2+神經(jīng)酰胺凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)+DNase激活Caspases激活細(xì)胞凋亡執(zhí)行死亡信號(hào)凋亡相關(guān)基因激活凋亡基因激活巨噬細(xì)胞吞噬分解凋亡細(xì)胞凋亡細(xì)胞去除(一)細(xì)胞凋亡過程細(xì)胞凋亡與疾病高級(jí)病生第36頁凋亡過程受體cAMPCa2+神經(jīng)酰胺凋亡相關(guān)基因激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞膜細(xì)胞核凋亡誘導(dǎo)原因+Dnase激活Caspases激活死亡信號(hào)細(xì)胞凋亡與疾病高級(jí)病生第37頁apoptosis凋亡過程與調(diào)控凋亡過程執(zhí)行凋亡凋亡細(xì)胞去除Dnase激活Caspases激活細(xì)胞凋亡與疾病高級(jí)病生第38頁(二)細(xì)胞凋亡調(diào)控1.細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)與抑制

細(xì)胞凋亡與疾病高級(jí)病生第39頁細(xì)胞凋亡與疾病高級(jí)病生第40頁2.細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)

◎多樣性◎偶聯(lián)性◎同一性◎多途性

細(xì)胞凋亡與疾病高級(jí)病生第41頁

死亡受體是一組TNF受體基因超家族組員，包含F(xiàn)as(CD95,Apo1)，TNFR1(P55,CD120a)，死亡受體DR3、DR4、DR5等。其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)為胞外區(qū)有二分之一胱氨酸富集結(jié)構(gòu)域(cystein-richdomain)，胞內(nèi)區(qū)有一死亡結(jié)構(gòu)域(deathdomain,DD)。它們是一組膜蛋白，與FADD結(jié)合，而FADD聚集則經(jīng)過其死亡效應(yīng)區(qū)(deatheffectdomain,DED)激活caspase-8。(1)

死亡受體路徑

細(xì)胞凋亡與疾病高級(jí)病生第42頁

Fas配體(凋亡信號(hào))

Fas(DR)

細(xì)胞膜

Fas(deathdomain)FADD(Fas-associateddeathdomain)Caspase-8細(xì)胞凋亡與疾病高級(jí)病生第43頁細(xì)胞凋亡與疾病高級(jí)病生第44頁細(xì)胞凋亡與疾病高級(jí)病生第45頁細(xì)胞凋亡與疾病高級(jí)病生第46頁(2)線立體路徑:細(xì)胞凋亡與疾病高級(jí)病生第47頁SMase鞘磷脂神經(jīng)酰胺(ceramide)磷酸膽堿(phosphocholine)TNFα、糖皮質(zhì)激素、電離輻射、紫外線(3)以神經(jīng)酰胺為第二信使介導(dǎo)細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡與疾病高級(jí)病生第48頁(4)DAG/PKC系統(tǒng)細(xì)胞凋亡與疾病高級(jí)病生第49頁(5)cAMP/PKA信號(hào)系統(tǒng)

PKA使關(guān)鍵蛋白質(zhì)分子發(fā)生不一樣程度磷酸化，進(jìn)而影響內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶活性，在研究糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)胸腺細(xì)胞凋亡時(shí)，即發(fā)覺cAMP和內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶與細(xì)胞凋亡呈正相關(guān)現(xiàn)象。

細(xì)胞凋亡與疾病高級(jí)病生第50頁(6)胞內(nèi)Ca2+信號(hào)系統(tǒng)細(xì)胞凋亡與疾病高級(jí)病生第51頁3.凋亡相關(guān)基因(1)bcl-2及其相關(guān)基因：

B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（Bcelllymphoma/leukemia-2），1984年從濾泡性淋巴瘤發(fā)覺，存在于核膜和線粒體。1988年首次證實(shí)bcl-2基因高表示可引發(fā)腫瘤，bcl-2家族最少有15個(gè)組員。1)抑制凋亡bcl-2亞族：bcl-2、Mcl-1、bcl-w等,存在于線粒體膜上?？沟蛲鲋饕獧C(jī)制是：

細(xì)胞凋亡與疾病高級(jí)病生第52頁

◎直接抗氧化◎抑制線粒體釋放促凋亡蛋白質(zhì)◎抑制促凋亡調(diào)整蛋白Bax、Bak細(xì)胞毒作用◎抑制凋亡蛋白酶(caspases)激活◎維持細(xì)胞鈣穩(wěn)定細(xì)胞凋亡與疾病高級(jí)病生第53頁

2)促進(jìn)凋亡bax亞族：bax、bak、bad、bik、bid等，存在于線粒體膜上和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上。Bax與bcl-2相關(guān)蛋白很高同源性，編碼三個(gè)蛋白：Bax-α、Bax-β和Bax-γ。bcl-2與Bax比率不一樣也可影響細(xì)胞凋亡。3)Bcl-X：

Bcl-XL(241氨基酸):與bcl-2同源性74%Bcl-Xs(178,少63)

細(xì)胞凋亡與疾病高級(jí)病生第54頁BCL-2家族組員細(xì)胞凋亡與疾病高級(jí)病生第55頁P(yáng)53基因WtP53

修復(fù)受損DNA，如修復(fù)失敗則誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡突變P53失活P53喪失監(jiān)視DNA損傷功效射線，毒素P53蛋白+細(xì)胞凋亡分子警察促進(jìn)凋亡基因(Mtp53）細(xì)胞凋亡與疾病高級(jí)病生第56頁雙向調(diào)控基因

C-myc是一個(gè)癌基因，是調(diào)控細(xì)胞周期主要基因。編碼蛋白是DNA結(jié)合蛋白，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，在GF充分時(shí)主要激活介導(dǎo)細(xì)胞增殖基因；反之激活凋亡基因。

C-myc細(xì)胞凋亡與疾病高級(jí)病生第57頁促進(jìn)凋亡基因抑制凋亡基因

雙向調(diào)控基因FasBaxICEp53c-mycBcl-x

EIB、IAP、Bcl-2

凋亡相關(guān)基因細(xì)胞凋亡與疾病高級(jí)病生第58頁正常細(xì)胞

調(diào)控細(xì)胞凋亡一些基因間相互關(guān)系ICE、Wtp53

細(xì)胞凋亡

ICE促進(jìn)

Bax、C-myc、fas抑制

BcL-2Mtp53

凋亡

Wtp53

BCL-2Bax㈠㈠

㈠

㈩㈩

誘導(dǎo)和抑制細(xì)胞凋亡基因細(xì)胞凋亡與疾病高級(jí)病生第59頁細(xì)胞凋亡與疾病高級(jí)病生第60頁細(xì)胞凋亡與疾病高級(jí)病生第61頁四.細(xì)胞凋亡發(fā)生機(jī)制(一)氧化損傷在細(xì)胞凋亡中作用(二)鈣穩(wěn)態(tài)失衡(calciumdyshomeostasis)(三)線粒體損傷在細(xì)胞凋亡中作用

細(xì)胞凋亡與疾病高級(jí)病生第62頁(一)氧化應(yīng)激引發(fā)細(xì)胞凋亡可能機(jī)制是：●氧自由基引發(fā)DNA損傷可激活p53基因。

●氧自由基引發(fā)DNA損傷可活化聚ADP核糖轉(zhuǎn)移酶，引發(fā)NAD快速耗竭，ATP大量消耗。

●氧自由基攻擊細(xì)胞膜上不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過氧化直接造成細(xì)胞膜損傷可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡與疾病高級(jí)病生第63頁

●

氧化應(yīng)激可激活Ca2+/Mg2+依賴核酸內(nèi)切酶，也可產(chǎn)生膜發(fā)泡現(xiàn)象。

●

氧化應(yīng)激引發(fā)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞，可改變細(xì)胞膜通透性使Ca2+內(nèi)流增加，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

自由基對(duì)線粒體膜損害造成其通透性和膜電位改變誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

●氧化應(yīng)激可活化核轉(zhuǎn)錄因子NF-kB和AP-1，可加速細(xì)胞凋亡相關(guān)一些基因表示，誘發(fā)細(xì)胞凋亡?！窦?xì)胞凋亡與疾病高級(jí)病生第64頁(二)鈣穩(wěn)態(tài)失衡引發(fā)細(xì)胞凋亡可能機(jī)制：

●激活Ca2+/Mg2+依賴核酸內(nèi)切酶，降解DNA鏈；●激活谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶，催化細(xì)胞內(nèi)肽鏈間?；D(zhuǎn)移，在肽鏈間形成共價(jià)鍵，使細(xì)胞骨架蛋白分子間發(fā)生廣泛交聯(lián)，有利于凋亡小體形成；

●激活核轉(zhuǎn)錄因子，加速細(xì)胞凋亡相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄；

●Ca2+在ATP配合下使DNA鏈?zhǔn)嬲?，暴露出核小體之間連接區(qū)內(nèi)酶切位點(diǎn)，有利于DNA內(nèi)切酶切割DNA。

細(xì)胞凋亡與疾病高級(jí)病生第65頁

Bcl-2

(－)(－)

線粒體PTP開放

Apaf+Cyt.C

Caspase-9酶原

Caspaes-9

△ψm下降

Caspase-3酶原

Caspase-3Caspase抑制劑

AIF蛋白質(zhì)水解

無活性核酸內(nèi)切酶

細(xì)胞凋亡

核酸內(nèi)切酶激活

DNA斷裂Ca2+NO缺血缺氧活性氧（+）(－)（+）（+）（+）(－)（三）線粒體損傷在細(xì)胞凋亡中作用細(xì)胞凋亡與疾病高級(jí)病生第66頁年10月7日英國人悉尼·布雷諾爾；美國人羅伯特·霍維茨和英國人約翰·蘇爾斯頓，因在器官發(fā)育遺傳調(diào)控和細(xì)胞程序性死亡方面研究獲諾貝爾諾貝爾生理與醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。年諾貝爾生理與醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)取得者（圖片來自http://www.nobel.se/）細(xì)胞凋亡與疾病高級(jí)病生第67頁細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法基于形態(tài)學(xué)觀察染色法基于DNA片斷化檢測(cè)法膜聯(lián)蛋白檢測(cè)法Caspase酶分析法流式細(xì)胞儀定量分析法五.細(xì)胞凋亡常見研究方法細(xì)胞凋亡與疾病高級(jí)病生第68頁（一）細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)研究方法1、光學(xué)顯微鏡和倒置顯微鏡

（1）未染色細(xì)胞：凋亡細(xì)胞體積變小、變形，細(xì)胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，細(xì)胞凋亡晚期可見凋亡小體。貼壁細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落。

（2）染色細(xì)胞：常見姬姆薩染色、瑞氏染色等。凋亡細(xì)胞染色質(zhì)濃縮、邊緣化，核膜裂解、染色質(zhì)分割成塊狀和凋亡小體等經(jīng)典凋亡形態(tài)。

細(xì)胞凋亡與疾病高級(jí)病生第69頁2、

熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡

常見DNA特異性染料有：HO33342(Hoechst33342)，HO33258(Hoechst33258),DAPI。三種種染料與DNA結(jié)合是非嵌入式，主要結(jié)合在DNAA-T堿基區(qū)。紫外光激發(fā)時(shí)發(fā)射明亮藍(lán)色熒光。

3、透射電子顯微鏡觀察

結(jié)果評(píng)判：凋亡細(xì)胞體積變小，細(xì)胞質(zhì)濃縮。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosisnuclei）細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)高度盤繞，出現(xiàn)許多稱為氣穴現(xiàn)象cavitations）空泡結(jié)構(gòu)(圖2)；Ⅱa期細(xì)胞核染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化；細(xì)胞凋亡晚期，細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體。

細(xì)胞凋亡與疾病高級(jí)病生第70頁細(xì)胞凋亡與疾病高級(jí)病生第71頁細(xì)胞凋亡與疾病高級(jí)病生第72頁細(xì)胞凋亡與疾病高級(jí)病生第73頁細(xì)胞凋亡與疾病高級(jí)病生第74頁凋亡細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變（掃描電鏡）細(xì)胞凋亡與疾病高級(jí)病生第75頁凋亡細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變（透射電鏡）核濃縮呈球形染色質(zhì)邊聚呈新月形細(xì)胞凋亡與疾病高級(jí)病生第76頁壞死細(xì)胞凋亡細(xì)胞細(xì)胞凋亡與疾病高級(jí)病生第77頁

判定細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)常見方法特征

推薦使用伎倆說明細(xì)胞表面改變

胞漿改變

染色質(zhì)凝聚核裂解

超微結(jié)構(gòu)

掃描電鏡

相差顯微鏡

相差顯微鏡熒光顯微鏡

流式細(xì)胞儀

透射電鏡

微絨毛消失，芽狀突起。見到凋亡小體細(xì)胞皺縮，質(zhì)膜變形，胞漿空泡適合用于組織切片用結(jié)合DNA染料(PI)

標(biāo)識(shí)。適合用于培養(yǎng)細(xì)胞定量測(cè)定DNA含量，測(cè)量細(xì)胞大小和蛋白。用于培養(yǎng)細(xì)胞完整細(xì)胞器，胞漿空泡，核染色質(zhì)凝聚核裂解，凋亡小體，適合用于組織切片或培養(yǎng)細(xì)胞細(xì)胞凋亡與疾病高級(jí)病生第78頁（二）DNA降解分析1、DNAladder:進(jìn)行DNA凝膠電泳和溴化乙啶染色（瓊脂糖凝膠電泳、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、DNA印跡、脈沖場(chǎng)電泳、單細(xì)胞電泳技術(shù)等）細(xì)胞凋亡與疾病高級(jí)病生第79頁細(xì)胞色素c誘導(dǎo)凋亡細(xì)胞DNA電泳圖1．細(xì)胞色素c誘導(dǎo)0h2．細(xì)胞色素c誘導(dǎo)1h3．細(xì)胞色素c誘導(dǎo)2h4．細(xì)胞色素c誘導(dǎo)3h5．細(xì)胞色素c誘導(dǎo)4h6．陰性對(duì)照7．Marker

細(xì)胞凋亡與疾病高級(jí)病生第80頁2、脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)缺口末端標(biāo)識(shí)法（terminal-deoxynucleotidyltransferasemediatednickendlabeling,TUNEL）原理：細(xì)胞凋亡中,染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產(chǎn)生大量粘性3'-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成衍生物標(biāo)識(shí)到DNA3'-末端，從而可進(jìn)行凋亡細(xì)胞檢測(cè).3、經(jīng)過FCM進(jìn)行檢測(cè)細(xì)胞凋亡與疾病高級(jí)病生第81頁細(xì)胞凋亡與疾病高級(jí)病生第82頁細(xì)胞凋亡與疾病高級(jí)病生第83頁（三）酶學(xué)分析研究方法1、Caspase3活性測(cè)定（1）Westernblot分析Procaspase-3活化Caspase-3正常以酶原（32KD）形式存在于胞漿中，在凋亡早期階段，它被激活，活化Caspase-3由兩個(gè)大亞基（17