實(shí)驗(yàn)大腸桿菌的培養(yǎng)與分離

實(shí)驗(yàn)大腸桿菌的培養(yǎng)與分離實(shí)驗(yàn)大腸桿菌的培養(yǎng)與分離第1頁試驗(yàn)?zāi)繕?biāo):1.進(jìn)行大腸桿菌擴(kuò)增，利用液體培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)操作2.進(jìn)行大腸桿菌分離,用固體平板培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌劃線培養(yǎng)3.說明大腸桿菌培養(yǎng)條件和操作要求原理實(shí)驗(yàn)大腸桿菌的培養(yǎng)與分離第2頁特點(diǎn)：結(jié)構(gòu)都相當(dāng)簡(jiǎn)單,個(gè)體多數(shù)十分微小.通常要用光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡才能看到，有甚至沒有細(xì)胞結(jié)構(gòu).且體內(nèi)普通不含有葉綠素.不能進(jìn)行光合作用.微生物包含哪五類：病毒細(xì)菌放線菌真菌原生動(dòng)物原核生物界原生生物界真菌界病毒界一、基礎(chǔ)知識(shí)：

(一)微生物：是一切肉眼看不見或看不清楚微小生物總稱．實(shí)驗(yàn)大腸桿菌的培養(yǎng)與分離第3頁(二)細(xì)菌常識(shí)1、結(jié)構(gòu)2、分裂3、生殖4、變異類型5、在基因工程中應(yīng)用實(shí)驗(yàn)大腸桿菌的培養(yǎng)與分離第4頁大腸桿菌實(shí)驗(yàn)大腸桿菌的培養(yǎng)與分離第5頁細(xì)菌外形與大小大腸桿菌屬于桿狀菌圖1-1常見三種細(xì)菌經(jīng)典形態(tài)A.球菌B.桿菌C.弧菌實(shí)驗(yàn)大腸桿菌的培養(yǎng)與分離第6頁細(xì)菌營養(yǎng)類型依據(jù)細(xì)菌所利用能源和碳源不一樣將細(xì)菌分為兩大營養(yǎng)類型。自養(yǎng)菌:異養(yǎng)菌:腐生菌寄生菌大個(gè)別病原菌光能自養(yǎng)型:光合細(xì)菌化能自養(yǎng)型:硝化細(xì)菌,鐵細(xì)菌,硫細(xì)菌大腸桿菌屬于異養(yǎng)兼性厭氧菌實(shí)驗(yàn)大腸桿菌的培養(yǎng)與分離第7頁細(xì)菌革蘭氏染色革蘭氏染色法是一個(gè)用于細(xì)菌染色法。此法將細(xì)菌分為兩類，即革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌。所謂革蘭氏陽性菌就是用革蘭氏染液染色后，再用脫色液處理，細(xì)菌仍保留染色液顏色；革蘭氏陰性菌則相反。這兩種菌差異在于細(xì)胞壁成份不一樣。大腸桿菌屬于革蘭氏陰性菌實(shí)驗(yàn)大腸桿菌的培養(yǎng)與分離第8頁☆

培養(yǎng)基

培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是由人工方法配制而成，專供微生物生長(zhǎng)繁殖使用混合營養(yǎng)液。固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基。1.培養(yǎng)基類型(三)細(xì)菌培養(yǎng)成份區(qū)分：瓊脂實(shí)驗(yàn)大腸桿菌的培養(yǎng)與分離第9頁2.不一樣微生物往往需要采取不一樣培養(yǎng)基配方3.不論哪種培養(yǎng)基，普通都含有水、碳源、和氮源、無機(jī)鹽、生長(zhǎng)因子等營養(yǎng)物質(zhì)，另外還需要滿足微生物生長(zhǎng)對(duì)pH、氧氣、滲透壓要求．細(xì)菌喜葷，霉菌喜素大腸桿菌配方：酵母提取物

0.5g蛋白胨

0.5gNacl

0.5g瓊脂

1g水:50ml實(shí)驗(yàn)大腸桿菌的培養(yǎng)與分離第10頁4.培養(yǎng)基用途液體培養(yǎng)基：擴(kuò)增細(xì)菌、工業(yè)生產(chǎn)固體培養(yǎng)基：純化（分離），判定、保藏菌種實(shí)驗(yàn)大腸桿菌的培養(yǎng)與分離第11頁單個(gè)或少數(shù)細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上大量繁殖時(shí)，就會(huì)形成一個(gè)肉眼可見，含有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)子細(xì)胞群體，叫做菌落。菌落是判定菌種主要依據(jù)?！罹?/p>

實(shí)驗(yàn)大腸桿菌的培養(yǎng)與分離第12頁液體培養(yǎng)基：表面生長(zhǎng)均勻混濁生長(zhǎng)沉淀生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)大腸桿菌的培養(yǎng)與分離第13頁☆無菌技術(shù)1.無菌技術(shù)概念

無菌操作泛指在培養(yǎng)微生物操作中，全部預(yù)防雜菌污染方法。成功地培養(yǎng)微生物關(guān)鍵。實(shí)驗(yàn)大腸桿菌的培養(yǎng)與分離第14頁（１）消毒定義：2.消毒與滅菌概念及二者區(qū)分

（2）滅菌定義：3.常見消毒與滅菌方法是指殺滅病原微生物方法。是指殺滅或去除環(huán)境中一切微生物（包含芽胞、孢子）方法實(shí)驗(yàn)大腸桿菌的培養(yǎng)與分離第15頁1、灼燒滅菌滅菌方法：實(shí)驗(yàn)大腸桿菌的培養(yǎng)與分離第16頁2、干熱滅菌：160-170℃下加熱1-2h。3、高壓蒸氣滅菌：100kPa、121℃下維持15-30min.實(shí)驗(yàn)大腸桿菌的培養(yǎng)與分離第17頁1.無菌技術(shù)除了用來預(yù)防試驗(yàn)室培養(yǎng)物被其它外來微生物污染外，還有什么目標(biāo)？2.請(qǐng)你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。假如需要，請(qǐng)選擇適當(dāng)方法。（1）培養(yǎng)細(xì)菌用培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿（2）玻棒、試管、燒瓶和吸管（3）試驗(yàn)操作者雙手答：無菌技術(shù)還能有效防止操作者本身被微生物感染。答：（1）、（2）需要滅菌；（3）需要消毒。思索1實(shí)驗(yàn)大腸桿菌的培養(yǎng)與分離第18頁二、大腸桿菌培養(yǎng)和分離試驗(yàn)操作（一）培養(yǎng)基配置與滅菌取2個(gè)250ml三角瓶中分別裝入50mlLB液體培養(yǎng)基和50mlLB固體培養(yǎng)基（剛配好，還未凝固），加上封口膜，牛皮紙包裝后高壓鍋滅菌15min。LB液體培養(yǎng)基——細(xì)菌擴(kuò)充培養(yǎng)LB固體培養(yǎng)基——細(xì)菌劃線分離封口膜：既通氣又不使菌進(jìn)入實(shí)驗(yàn)大腸桿菌的培養(yǎng)與分離第19頁（二）倒平板滅菌后培養(yǎng)基在無菌操作臺(tái)上倒入4個(gè)培養(yǎng)皿中，倒后馬上置于水平位置上，輕輕晃動(dòng)，使培養(yǎng)基鋪滿平皿底部，待凝，使之形成平面實(shí)驗(yàn)大腸桿菌的培養(yǎng)與分離第20頁注意事項(xiàng)：1.培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到60℃左右時(shí)，才能用來倒平板2.滅菌及消毒：無菌操作臺(tái)用超凈紫外燈和過濾風(fēng)滅菌；桌面及人手用酒精棉球消毒

3.操作時(shí)右手無名指和小指夾住封口膜,另外三指持三角瓶,左手拿培養(yǎng)皿并打開上蓋一邊,在酒精燈火焰旁操作.4.需要使錐形瓶瓶口經(jīng)過火焰，灼燒滅菌5.平板冷凝后，要將平板倒置,既能夠使培養(yǎng)基表面水分更加好地?fù)]發(fā)，又能夠預(yù)防皿蓋上水珠落入培養(yǎng)基，造成污染.實(shí)驗(yàn)大腸桿菌的培養(yǎng)與分離第21頁（三）大腸桿菌擴(kuò)充培養(yǎng)將斜面上培養(yǎng)大腸桿菌菌種接種到滅菌后液體培養(yǎng)基中,使其在37℃搖床培養(yǎng)12小時(shí)。注意事項(xiàng):1.火焰旁從斜面上用接種環(huán)取菌;2.取菌前接種環(huán)要用酒精燈灼燒滅菌,冷卻后方能取菌;3.取菌后封口膜和棉塞復(fù)原.實(shí)驗(yàn)大腸桿菌的培養(yǎng)與分離第22頁（四）大腸桿菌劃線分離分離方法:劃線分離法和涂布分離法實(shí)驗(yàn)大腸桿菌的培養(yǎng)與分離第23頁1、劃線分離法無菌操作臺(tái)上用接種環(huán)取菌后在固體培養(yǎng)基平板上連續(xù)劃線.實(shí)驗(yàn)大腸桿菌的培養(yǎng)與分離第24頁平板劃線操作實(shí)驗(yàn)大腸桿菌的培養(yǎng)與分離第25頁不能使用脫脂棉，不然輕易吸水，造成污染。實(shí)驗(yàn)大腸桿菌的培養(yǎng)與分離第26頁一旦劃破，會(huì)造成劃線不均勻，難以到達(dá)分離單菌落目標(biāo)；二是存留在劃破處單個(gè)細(xì)胞無法形成規(guī)矩菌落，菌落會(huì)沿著劃破處生長(zhǎng)，會(huì)形成一個(gè)條狀菌落。實(shí)驗(yàn)大腸桿菌的培養(yǎng)與分離第27頁實(shí)驗(yàn)大腸桿菌的培養(yǎng)與分離第28頁（四）大腸桿菌劃線分離注意事項(xiàng):1.接種環(huán)只蘸一次菌液,但要在培養(yǎng)基不一樣位置連續(xù)劃線屢次.2.劃線首尾不能相接3.劃線后,培養(yǎng)皿倒置培養(yǎng)12~24h1、劃線分離法實(shí)驗(yàn)大腸桿菌的培養(yǎng)與分離第29頁問題討論

1.為何在操作第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時(shí)，依然需要灼燒接種環(huán)嗎？為何？

答：操作第一步灼燒接種環(huán)是為了防止接種環(huán)上可能存在微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留菌種，使下一次劃線時(shí)，接種環(huán)上菌種直接起源于上次劃線末端，從而經(jīng)過劃線次數(shù)增加，使每次劃線時(shí)菌種數(shù)目逐步降低，方便得到菌落。劃線結(jié)束后灼燒接種環(huán)，能及時(shí)殺死接種環(huán)上殘留菌種，防止細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者。實(shí)驗(yàn)大腸桿菌的培養(yǎng)與分離第30頁2.在灼燒接種環(huán)之后，為何要等其冷卻后再進(jìn)行劃線？答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。3.在作第二次以及其后劃線操作時(shí)，為何總是從上一次劃線末端開始劃線？答：劃線后，線條末端細(xì)菌數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線末端開始，能使細(xì)菌數(shù)目伴隨劃線次數(shù)增加而逐步降低，最終能得到由單個(gè)細(xì)菌繁殖而來菌落。實(shí)驗(yàn)大腸桿菌的培養(yǎng)與分離第31頁2、涂布分離法:是指將培養(yǎng)菌液稀釋一定倍數(shù),然后取一定量稀釋液加在固體培養(yǎng)基上,用玻璃刮刀涂布在培養(yǎng)基平面上.實(shí)驗(yàn)大腸桿菌的培養(yǎng)與分離第32頁劃線分離法和涂布分離法哪個(gè)更加好呢？劃線分離：方法簡(jiǎn)單，但單菌落較難分開。涂布分離：?jiǎn)尉涓追珠_，但操作復(fù)雜。實(shí)驗(yàn)大腸桿菌的培養(yǎng)與分離第33頁分離后,一個(gè)菌體便會(huì)形成一個(gè)菌落,這是消除污染雜菌通用方法,也是用于篩選高表示量菌株最簡(jiǎn)便方法之一實(shí)驗(yàn)大腸桿菌的培養(yǎng)與分離第34頁（五）大腸桿菌分離后保留1、暫時(shí)保藏：接種到固體斜面培養(yǎng)基，菌落長(zhǎng)成后置于4℃冰箱保留。2、長(zhǎng)久保留：甘油冷凍管藏法實(shí)驗(yàn)大腸桿菌的培養(yǎng)與分離第35頁1.怎樣操作才能夠盡可能防止被雜菌污染?(1)膽大心細(xì)，操作快捷。（2）注意滅菌操作標(biāo)準(zhǔn)，滅菌徹底，降低環(huán)境污染概率。（3）注意微生物生長(zhǎng)條件，如PH、滲透壓、溫度等。細(xì)菌喜堿，喜蛋白質(zhì)，喜37度；霉菌喜酸，喜糖，喜25-30度實(shí)驗(yàn)大腸桿菌的培養(yǎng)與分離第36頁2.在培養(yǎng)后怎樣判斷是否有雜菌污染?（1）菌落形態(tài)看，是否濕潤(rùn)，透明，粘稠，顏色等。是區(qū)分細(xì)菌、酵母、放線菌和霉菌關(guān)鍵指標(biāo)。（2）顯微鏡觀察其形態(tài)、大小、看是否有菌絲、孢子、芽孢。是區(qū)分細(xì)菌、酵母、放線菌和霉菌關(guān)鍵指標(biāo)。（3）上述方法較難區(qū)分同類不一樣物種，需借助化學(xué)和深入形態(tài)觀察，如用革蘭氏染色法等。實(shí)驗(yàn)大腸桿菌的培養(yǎng)與分離第37頁3.進(jìn)行恒溫培養(yǎng)時(shí)為何要將培養(yǎng)皿倒置?恒溫培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)基中水分會(huì)以水蒸氣形式蒸發(fā)，倒放培養(yǎng)皿則會(huì)使水蒸氣凝結(jié)成水滴留在蓋上；假如正放，則水分形成水滴會(huì)落入培養(yǎng)基表面并擴(kuò)散開。假如培養(yǎng)皿中已形成菌落，則會(huì)造成菌隨水?dāng)U散，極難再分成單菌落，達(dá)不到分離目標(biāo)。實(shí)驗(yàn)大腸桿菌的培養(yǎng)與分離第38頁4.試驗(yàn)完成后,接種過細(xì)菌器皿應(yīng)怎樣處理?全部接觸過菌器皿都要先高壓滅菌后再洗滌（尤其是培養(yǎng)基）；使用后廢棄物也要高壓滅菌后再拋棄實(shí)驗(yàn)大腸桿菌的培養(yǎng)與分離第39頁5.假如分離是轉(zhuǎn)基因大腸桿菌,怎樣確保不被普通大腸桿菌所污染?轉(zhuǎn)基因用質(zhì)粒不是細(xì)菌中原有，而是經(jīng)過改造，通常加入了抗性基因DNA序列，所以可用含有對(duì)應(yīng)抗生素培養(yǎng)基對(duì)菌體進(jìn)行培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)大腸桿菌的培養(yǎng)與分離第40頁【課堂練習(xí)】例1．關(guān)微生物營養(yǎng)物質(zhì)敘述中，正確是（）

A.是碳源物質(zhì)不可能同時(shí)是氮源

B.凡碳源都提供能量

C.除水以外無機(jī)物只提供無機(jī)鹽

D.無機(jī)氮源也能提供能量D實(shí)驗(yàn)大腸桿菌的培養(yǎng)與分離第41頁例2．下面對(duì)發(fā)酵工程中滅菌了解不正確是（）A.預(yù)防雜菌污染B.接種前菌種要進(jìn)行滅菌C.培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)備都必須滅菌D.滅菌必須在接種前B實(shí)驗(yàn)大腸桿菌的培養(yǎng)與分離第42頁編號(hào)成份含量①粉狀硫10g②（NH4）2SO40.4g③K2HPO44.0g④MgSO49.25g⑤FeSO40.5g⑥CaCl20.5g⑦H2O100ml例3．右表是某微生物培養(yǎng)基成份，請(qǐng)據(jù)此回答：（1）右表培養(yǎng)基可培養(yǎng)微生物類型是

。（2）若不慎將過量NaCl加入培養(yǎng)基中。如不想浪費(fèi)此培養(yǎng)基，可再加入

.自養(yǎng)型微生物

含碳有機(jī)物

實(shí)驗(yàn)大腸桿菌的培養(yǎng)與分離第43頁（3）若除去成份②，加入