臨床pcr檢驗(yàn)標(biāo)本的采集處理保存及核酸提取方法

臨床pcr檢驗(yàn)標(biāo)本的采集處理保存及核酸提取方法臨床pcr檢驗(yàn)標(biāo)本的采集處理保存及核酸提取方法第1頁(yè)檢驗(yàn)誤差發(fā)生率1997年，一位意大利著名檢驗(yàn)教授對(duì)急診檢驗(yàn)誤差發(fā)生種類和發(fā)生率進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)。結(jié)果顯示，約有68.2%檢驗(yàn)誤差發(fā)生在檢驗(yàn)前期，而來(lái)自檢驗(yàn)中期和檢驗(yàn)后期誤差率分別為13.3%和18.5%。年，這位教授又進(jìn)行了類似統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示，檢驗(yàn)前期誤差發(fā)生率仍高達(dá)61.9%臨床pcr檢驗(yàn)標(biāo)本的采集處理保存及核酸提取方法第2頁(yè)正確采集、運(yùn)輸、保留臨床標(biāo)本

主要性質(zhì)量確保關(guān)鍵性步驟處理包括試驗(yàn)室檢驗(yàn)醫(yī)患糾紛方法之一臨床pcr檢驗(yàn)標(biāo)本的采集處理保存及核酸提取方法第3頁(yè)核酸提取主要性核酸提取是臨床PCR檢驗(yàn)最為關(guān)鍵個(gè)別核酸提取成敗關(guān)系到臨床PCR檢驗(yàn)正確是否臨床PCR檢驗(yàn)操作中最易出問(wèn)題步驟臨床pcr檢驗(yàn)標(biāo)本的采集處理保存及核酸提取方法第4頁(yè)標(biāo)本采集標(biāo)本采集時(shí)間對(duì)擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果影響（過(guò)早或過(guò)晚都可能會(huì)出現(xiàn)假陰性結(jié)果）

標(biāo)本采集部位準(zhǔn)備（適度消毒）

標(biāo)本類型和采集量（衣原體上皮細(xì)胞）采樣質(zhì)量評(píng)價(jià)（評(píng)價(jià)方法：肉眼觀察、顯微鏡下觀察和化學(xué)分析）

采樣及運(yùn)輸容器（一次性無(wú)菌器材,防腐劑,抗凝劑）

標(biāo)本采集中防污染（一次性無(wú)菌容器，預(yù)防混入操作者頭發(fā)，表皮等，如玻璃容器要高壓滅菌）

臨床pcr檢驗(yàn)標(biāo)本的采集處理保存及核酸提取方法第5頁(yè)標(biāo)本運(yùn)輸

樣本一經(jīng)采集，則應(yīng)盡可能快送至檢測(cè)試驗(yàn)室。樣本中如加入了適當(dāng)穩(wěn)定劑,如用于RNA測(cè)定加入GITC血清(漿)樣本和用于DNA測(cè)定EDTA抗凝血等,則可在室溫下運(yùn)輸或郵寄。試驗(yàn)室應(yīng)依據(jù)待測(cè)靶核酸特征，對(duì)各種臨床樣本運(yùn)輸條件作出對(duì)應(yīng)要求。臨床pcr檢驗(yàn)標(biāo)本的采集處理保存及核酸提取方法第6頁(yè)臨床標(biāo)本處理和保留血清（漿）全血外周血單個(gè)核細(xì)胞痰棉拭子膿液體液乳汁組織臨床pcr檢驗(yàn)標(biāo)本的采集處理保存及核酸提取方法第7頁(yè)血清（漿）DNA測(cè)定，可按照普通血清標(biāo)本處理程序，對(duì)測(cè)定影響不大。RNA測(cè)定，標(biāo)本獲取和保留方式對(duì)測(cè)定結(jié)果，可能有決定性影響。最好是使用EDTA抗凝(禁止使用肝素，因其對(duì)PCR擴(kuò)增有抑制，且極難在核酸提取過(guò)程中完全去除)全血標(biāo)本，抗凝后6小時(shí)內(nèi)分離血漿，如使用血清標(biāo)本，則需盡快(2小時(shí)內(nèi))分離血清，標(biāo)本短期（1～2周）保留可在-20℃下，較長(zhǎng)久保留應(yīng)在-70℃下。臨床pcr檢驗(yàn)標(biāo)本的采集處理保存及核酸提取方法第8頁(yè)全血以全血作為待測(cè)標(biāo)本時(shí),必須注意抗凝劑選擇,普通使用EDTA-Na2或枸椽酸鈉,不可使用肝素。全血樣本如用于DNA提取檢測(cè),可4℃下短期保留,如用于RNA檢測(cè)，則應(yīng)在取血后，盡快提取RNA。臨床pcr檢驗(yàn)標(biāo)本的采集處理保存及核酸提取方法第9頁(yè)外周血單個(gè)核細(xì)胞

外周血單個(gè)核細(xì)胞可從抗凝全血制備，主要有兩條路徑，一是使用淋巴細(xì)胞分離液分離制備；二是使用紅細(xì)胞裂解液,裂解全血中紅細(xì)胞,經(jīng)生理鹽水?dāng)?shù)次洗滌,即可得到單個(gè)核細(xì)胞。外周血單個(gè)核細(xì)胞如暫不提取核酸,可保留于-70℃下.臨床pcr檢驗(yàn)標(biāo)本的采集處理保存及核酸提取方法第10頁(yè)痰痰屬于分泌物,臨床上常見(jiàn)作為結(jié)核桿菌DNA測(cè)定標(biāo)本。痰標(biāo)本中含有大量粘蛋白和雜質(zhì),故在核酸提取時(shí),需對(duì)樣本進(jìn)行初步處理，即用1mol/LNaOH或變性劑液化。如用于非結(jié)核桿菌如肺炎支原體PCR檢測(cè)，痰標(biāo)本只能室溫懸浮于生理鹽水中，充分振蕩混勻，促使大塊粘狀物下沉，取上清離心，所得到沉淀物即可用于核酸提取。液化標(biāo)本如不馬上用于核酸提取,可保留于-70℃下。臨床pcr檢驗(yàn)標(biāo)本的采集處理保存及核酸提取方法第11頁(yè)痰標(biāo)本處理基礎(chǔ)模式通用模式簡(jiǎn)單模式臨床pcr檢驗(yàn)標(biāo)本的采集處理保存及核酸提取方法第12頁(yè)痰標(biāo)本處理通用模式（1）通用標(biāo)本處理（Universalsampleprocessing,USP）溶液：

4-6mol/L鹽酸胍（GuHCl）

50mmol/LTris-HCl,pH7.525mmol/LEDTA0.5%十二烷基肌酸鈉（Sarkosyl

）

0.1~0.2mol/Lβ-巰基乙醇。（2）0.05%Tween80。（3）10%Chelex-100(含0.03%TritonX-100和0.3%Tween20)臨床pcr檢驗(yàn)標(biāo)本的采集處理保存及核酸提取方法第13頁(yè)一定體積痰1.5倍體積USP溶液,震蕩30-40s10-15ml蒸餾水，室溫放置5-10min5000g室溫離心10-15min，棄上清500ul無(wú)菌0.05%Tween80溶解或重懸0g室溫離心10-15min，棄上清加入5倍10%chelex-100，混勻，90℃溫育40min0g室溫離心5min取5ul用于PCR擴(kuò)增臨床pcr檢驗(yàn)標(biāo)本的采集處理保存及核酸提取方法第14頁(yè)痰標(biāo)本處理簡(jiǎn)單模式

試劑：（1）裂解液:含終濃度0.1mol/LNaOH、50μg蛋白酶K和0.05%TritonX-10050ul痰6000g離心10分鐘，棄上清加入裂解液50ul，60℃溫育30min90℃溫育30min加入Tris-HCl中和以上反應(yīng)混合物取5ul用于PCR檢測(cè)臨床pcr檢驗(yàn)標(biāo)本的采集處理保存及核酸提取方法第15頁(yè)痰標(biāo)本處理中要注意問(wèn)題痰標(biāo)本在沒(méi)有加入內(nèi)標(biāo)以控制假陰性情況下，不能采取異硫氰酸胍鹽（GuSCN）方法提取。采取這種方法提取，有可能會(huì)在提取過(guò)程中，出現(xiàn)一個(gè)可修飾DNA酶，在最終一步提取中，與核酸一起洗提出來(lái)，從而抑制其后擴(kuò)增。在PCR主反應(yīng)混合液中，加入α-酪蛋白（alpha-casein）、白蛋白等，有預(yù)防這類抑制物產(chǎn)生效果。臨床pcr檢驗(yàn)標(biāo)本的采集處理保存及核酸提取方法第16頁(yè)棉拭子在使用PCR方法檢測(cè)性病病原體時(shí),臨床標(biāo)本普通為棉拭子,可將棉拭子置于適量生理鹽水中,充分震蕩洗滌后,室溫靜置5～10分鐘,待大塊狀物下沉后,取上清馬上離心,其后沉淀即可用于DNA提取。如不馬上用于核酸提取,則需保留于-70℃下.臨床pcr檢驗(yàn)標(biāo)本的采集處理保存及核酸提取方法第17頁(yè)膿液膿液處理依情況而定,如用于分枝桿菌(如結(jié)核桿菌)核酸測(cè)定標(biāo)本,粘稠膿液可采取痰標(biāo)本處理模式，先進(jìn)行液化，再離心取沉淀提取DNA；水樣膿液則直接離心,沉淀用生理鹽水洗2～3次后,即可用于DNA提取。對(duì)于用于非分枝桿菌測(cè)定膿液標(biāo)本,如過(guò)于粘稠,則加入適量生理鹽水,充分振蕩后,靜置,取上清馬上離心,沉淀用于DNA提取;如為水樣,則按上述直接離心取沉淀即可。沉淀標(biāo)本保留條件一樣為-70℃。臨床pcr檢驗(yàn)標(biāo)本的采集處理保存及核酸提取方法第18頁(yè)體液臨床體液標(biāo)本包含胸水,腹水,腦脊液,尿液等,可按水樣標(biāo)本方式離心取沉淀后,提取核酸。沉淀樣本保留同上。臨床pcr檢驗(yàn)標(biāo)本的采集處理保存及核酸提取方法第19頁(yè)乳汁

乳汁有時(shí)也可作為標(biāo)本，如乳汁中HBVDNA、HCVRNA、結(jié)核分枝桿菌和布魯氏菌等PCR檢測(cè)。

臨床pcr檢驗(yàn)標(biāo)本的采集處理保存及核酸提取方法第20頁(yè)乳汁中分枝桿菌DNA提取試劑準(zhǔn)備①裂解液：50mmol/LTris-HCl，10mmol/LEDTA,2%TritonX-100,4mol/L異硫氰酸胍鹽（GITC）,0.3mol/L醋酸鈉。②玻璃珠：（直徑：425-600um）臨床pcr檢驗(yàn)標(biāo)本的采集處理保存及核酸提取方法第21頁(yè)乳汁標(biāo)本離心6000rpm，5min，棄上清脂質(zhì)和沉淀用750ul裂解液重懸重懸液移入含100mg玻璃珠離心管攪拌煮沸5min，離心14000rpm，3min650ul上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中，等體積異丙醇沉淀70%乙醇洗滌沉淀，干燥50ulTris-EDTA溶解沉淀即可用于PCR擴(kuò)增臨床pcr檢驗(yàn)標(biāo)本的采集處理保存及核酸提取方法第22頁(yè)組織

組織有新鮮組織塊和石蠟切片。新鮮組織塊處理步聚首先用生理鹽水洗兩次,然后將其搗碎或切碎，加入生理鹽水后猛烈震蕩混勻,離心，棄上清，再用蛋白酶K消化后提取核酸。新鮮組織最好是保留于50%乙醇中,詳細(xì)作法是，先用生理鹽水將組織洗一次,切成寬度小于1cm小片,加入適量生理鹽水,然后,邊搖邊加入無(wú)水乙醇至終濃度為50%.這么固定組織標(biāo)本室溫下可保留數(shù)日,4℃可保留6年。石蠟切片用于核酸提取,需先用辛烷或二甲苯脫蠟,再用蛋白酶K消化后即可進(jìn)行DNA提取。臨床pcr檢驗(yàn)標(biāo)本的采集處理保存及核酸提取方法第23頁(yè)臨床標(biāo)本濾紙上保留臨床標(biāo)本置于經(jīng)過(guò)處理濾紙片上，如靶核酸為DNA，可室溫保留數(shù)月至數(shù)年，如靶核酸為RNA，則可穩(wěn)定數(shù)周。保留在濾紙上標(biāo)本，保留時(shí)間長(zhǎng)，還可因?yàn)闃?biāo)本中PCR抑制物如血紅蛋白、酶、免疫球蛋白等吸附于濾紙上，而不對(duì)后面擴(kuò)增檢測(cè)造成影響。不論是全血、血清（漿）。還是尿液、糞便、分泌物等均可此種方法。臨床pcr檢驗(yàn)標(biāo)本的采集處理保存及核酸提取方法第24頁(yè)臨床標(biāo)本中PCR反應(yīng)抑制物內(nèi)源性

:免疫球蛋白、蛋白酶、血紅素及其代謝產(chǎn)物、白細(xì)胞內(nèi)乳鐵蛋白、肌紅蛋白、脂類、粘蛋白、尿素、離子、膽鹽、多糖等。

外源性

:如肝素抗凝劑、纖維素和硝酸纖維素、過(guò)分UV照射后礦物油、手套滑石粉、標(biāo)本容器或采樣器材上含有抑制物。臨床pcr檢驗(yàn)標(biāo)本的采集處理保存及核酸提取方法第25頁(yè)肝素作用機(jī)理

肝素對(duì)MLV逆轉(zhuǎn)錄酶和TAQDNA聚合酶均很強(qiáng)抑制作用，假如臨床標(biāo)本為肝素抗凝，則在核酸純化過(guò)程中，標(biāo)本中肝素可結(jié)合于DNA和RNA上，盡管肝素和核酸本身都帶正電荷。對(duì)標(biāo)本進(jìn)行煮沸、凝膠過(guò)濾、酸堿處理后凝膠過(guò)濾、重復(fù)乙醇沉淀等均不能去除肝素這種干擾作用。臨床pcr檢驗(yàn)標(biāo)本的采集處理保存及核酸提取方法第26頁(yè)肝素作用機(jī)理每μg核酸標(biāo)本中加入0.1U肝素,即可100%抑制酶活性。在標(biāo)本中加入肝素酶I或Ⅱ1~3U/μg核酸(于5mMTrispH7.5,1mMCaCl2,40URNase25℃2小時(shí))可去除肝素抑制作用。臨床pcr檢驗(yàn)標(biāo)本的采集處理保存及核酸提取方法第27頁(yè)血紅蛋白、乳鐵蛋白血紅蛋白和乳鐵蛋白分別是紅細(xì)胞和白細(xì)胞內(nèi)主要PCR抑制物,它們均含有鐵。抑制機(jī)制可能是：（1）與這些蛋白釋放鐵離子至PCR混合物中相關(guān)。研究鐵抑制效應(yīng)時(shí)，發(fā)覺(jué)其干擾DNA合成，而且膽紅素、膽鹽和氯化高鐵血紅素（Hemin）等血紅蛋白衍生物，也是PCR抑制物。（2）1%(V/V)血液可完全抑制Taq酶活性臨床pcr檢驗(yàn)標(biāo)本的采集處理保存及核酸提取方法第28頁(yè)IgG

IgG抑制作用是因?yàn)槠渑c單鏈DNA相互作用，使得靶DNA不能與DNA聚合酶相互作用使用煮沸作為標(biāo)本處理方法或使用PCR前熱開(kāi)啟,將增強(qiáng)IgG對(duì)PCR反應(yīng)抑制臨床pcr檢驗(yàn)標(biāo)本的采集處理保存及核酸提取方法第29頁(yè)去除或減輕抑制一些方法NaOH處理可中和臨床標(biāo)本中TaqDNA聚合酶抑制劑，但這種方法不適合用于DNA含量低標(biāo)本，因?yàn)镹aOH處理可使DNA大量丟失。臨床pcr檢驗(yàn)標(biāo)本的采集處理保存及核酸提取方法第30頁(yè)去除或減輕抑制一些方法加入0.6%(wt/vol)牛血清白蛋白（BSA）可降低血液對(duì)TaqDNA聚合酶抑制效應(yīng)，既使在2%（vol/vol）血液存在下亦可成功擴(kuò)增，而通常血液含量只能是0.2%。BSA也可增加TaqDNA聚合酶擴(kuò)增能力，使其對(duì)糞便和肉類標(biāo)本中抑制物抵抗能力分別提升10和20倍。單鏈DNA結(jié)合T4基因32蛋白（gp32）有類似BSA增強(qiáng)效應(yīng)。臨床pcr檢驗(yàn)標(biāo)本的采集處理保存及核酸提取方法第31頁(yè)核酸純化核酸分離純化技術(shù)起源于二十世紀(jì)五十年代，在七十年代和八十年代中傳統(tǒng)核酸沉淀溶解分離純化方法得到了普遍應(yīng)用和推廣。傳統(tǒng)核酸提取方法常包括去垢劑裂解、蛋白酶處理、有機(jī)溶劑提取及乙醇沉淀等步驟。臨床pcr檢驗(yàn)標(biāo)本的采集處理保存及核酸提取方法第32頁(yè)普通核酸提取試劑促使靶核酸從細(xì)胞內(nèi)釋出原理靶核酸能夠與宿主細(xì)胞整合，核內(nèi)游離及胞漿內(nèi)各種構(gòu)形存在于細(xì)胞內(nèi)，如測(cè)定是病原微生物,則靶核酸存在于細(xì)菌、病毒、原蟲(chóng)或真菌細(xì)胞內(nèi)，假如上述細(xì)胞破裂,則靶核酸亦可存在于細(xì)胞外。普通均使用去垢劑(如Triton-100)裂解細(xì)胞，用一個(gè)蛋白裂解酶(如蛋白酶K)消化結(jié)合于核酸蛋白質(zhì)，從而將靶核酸從細(xì)胞內(nèi)釋放出來(lái)。臨床pcr檢驗(yàn)標(biāo)本的采集處理保存及核酸提取方法第33頁(yè)核酸分離純化

核酸分離純化就是要將蛋白、脂類等干擾核酸擴(kuò)增物質(zhì)去除。經(jīng)典方法硅吸附法對(duì)于商品核酸提取試劑盒，臨床試驗(yàn)室在使用前，必須對(duì)其核酸提取純度和效率進(jìn)行評(píng)價(jià)。臨床pcr檢驗(yàn)標(biāo)本的采集處理保存及核酸提取方法第34頁(yè)DNA提取經(jīng)典方法即所謂”酚-氯仿提取法”

臨床pcr檢驗(yàn)標(biāo)本的采集處理保存及核酸提取方法第35頁(yè)臨床pcr檢驗(yàn)標(biāo)本的采集處理保存及核酸提取方法第36頁(yè)RNA提取獨(dú)特征臨床標(biāo)本及試驗(yàn)室環(huán)境中,存在大量對(duì)RNA含有強(qiáng)烈降解作用RNase，而RNase較耐高溫,不易失活。怎樣防止RNase對(duì)標(biāo)本污染及預(yù)防RNase對(duì)提取RNA降解,是確保RNA成功提取關(guān)鍵之所在。臨床pcr檢驗(yàn)標(biāo)本的采集處理保存及核酸提取方法第37頁(yè)

RNA提取所用器皿處理經(jīng)高壓滅菌一次性使用塑料制品如試管,離心管等基礎(chǔ)上無(wú)RNase,能夠不經(jīng)預(yù)處理直接用于制備和貯存RNA.試驗(yàn)室用普通玻璃器皿經(jīng)常有RNase污染,使用前必須于180℃干烤8小時(shí)以上,或用0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液浸泡用于制備RNA燒杯,試管和其它用具。DEPC是RNase強(qiáng)烈抑制劑。灌滿DEPC器皿于37℃下放置2小時(shí)，然后用滅菌水淋洗數(shù)次，并于100℃干烤15分鐘，最終高壓蒸汽下15分鐘。上述處理可除去器皿上痕量DEPC,以防DEPC經(jīng)過(guò)羧甲基化作用對(duì)RNA嘌呤堿基進(jìn)行修飾。臨床pcr檢驗(yàn)標(biāo)本的采集處理保存及核酸提取方法第38頁(yè)RNA提取所用溶液準(zhǔn)備

對(duì)于RNA提取所需溶液配制,必須用高壓滅菌水和RNA研究專用化學(xué)試劑配制溶液,用干烤過(guò)藥匙稱取試劑,將溶液裝入無(wú)RNase玻璃器皿。可能話,溶液均應(yīng)用0.1%DEPC于37℃最少處理12小時(shí),然后于100℃加熱15分鐘或高壓蒸汽滅菌15分鐘。須注意是,DEPC可與胺類快速發(fā)生化學(xué)反應(yīng),所以不能用來(lái)處理含有Tris一類緩沖液,所以可存幾瓶新,未開(kāi)封Tris試劑以制備無(wú)RNase溶液。臨床pcr檢驗(yàn)標(biāo)本的采集處理保存及核酸提取方法第39頁(yè)RNA提取中RNase污染控制試驗(yàn)操作人員手是RNase污染最主要潛在起源。策略是：在準(zhǔn)備用于RNA純化試驗(yàn)材料和溶液時(shí),以及在包括RNA整個(gè)提取操作過(guò)程中,都應(yīng)戴一次性手套。在RNA提取試驗(yàn)中，應(yīng)勤換手套。臨床pcr檢驗(yàn)標(biāo)本的采集處理保存及核酸提取方法第40頁(yè)RNA提取常見(jiàn)方法

表面活性劑加蛋白酶K，氯仿-酚抽提法。胍鹽提取結(jié)合氯仿-酚抽提法。胍鹽提取結(jié)合玻璃粉、二氧化硅等顆粒懸浮吸附法等。臨床pcr檢驗(yàn)標(biāo)本的采集處理保存及核酸提取方法第41頁(yè)異硫氰酸胍結(jié)合氯仿-酚提取法

臨床pcr檢驗(yàn)標(biāo)本的采集處理保存及核酸提取方法第42頁(yè)核酸提取改良方法

旋轉(zhuǎn)離心柱（SPINCOLUMN）方法玻璃粉吸附法二氧化硅（Se）或硅藻吸附法微量全血核酸提取法：NaI方法其它方法：疏水性Immobilon-P膜、全自動(dòng)核酸純化儀臨床pcr檢驗(yàn)標(biāo)本的采集處理保存及核酸提取方法第43頁(yè)旋轉(zhuǎn)離心柱（SPINCOLUMN）屬于硅吸附方法一個(gè)。在原理上現(xiàn)行旋轉(zhuǎn)離心柱系統(tǒng)通?？煞譃槿齻€(gè)個(gè)別：（1）利用裂解液促使細(xì)胞破碎，使細(xì)胞中核酸釋放出來(lái)（2）把釋放核酸特異地吸附在特定硅載體上，當(dāng)然這種載體只對(duì)核酸有較強(qiáng)親和力和吸附力而對(duì)其它生化組分如蛋白質(zhì)、多糖、脂類則不相親和也不吸附（3）把吸附在特定載體上核酸洗脫下來(lái)，從而得到純化核酸。

臨床pcr檢驗(yàn)標(biāo)本的采集處理保存及核酸提取方法第44頁(yè)臨床pcr檢驗(yàn)標(biāo)本的采集處理保存及核酸提取方法第45頁(yè)臨床pcr檢驗(yàn)標(biāo)本的采集處理保存及核酸提取方法第46頁(yè)玻璃粉吸附法

臨床pcr檢驗(yàn)標(biāo)本的采集處理保存及核酸提取方法第47頁(yè)二氧化硅（Se）或硅藻吸附法

臨床pcr檢驗(yàn)標(biāo)本的采集處理保存及核酸提取方法第48頁(yè)使用NaI微量全血核酸提取法

臨床pcr檢驗(yàn)標(biāo)本的采集處理保存及核酸提取方法第49頁(yè)全自動(dòng)核酸純化儀雅培m系統(tǒng)該儀器主要由兩個(gè)機(jī)械臂和八個(gè)單道移液器組成，將樣品放入樣品管中后，儀器就能夠自開(kāi)工作，利用磁珠法進(jìn)行核酸（DNA/RNA）提取。在樣品提取完成后，儀器還能夠進(jìn)行PCR試劑混合步驟?；A(chǔ)上沒(méi)有手工操作步驟，最大樣本量：96

臨床pcr檢驗(yàn)標(biāo)本的采集處理保存及核酸提取方法第50頁(yè)全自動(dòng)核酸純化儀美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限企業(yè)SPRI-TE小型化自動(dòng)提取：1-10個(gè)樣品VidieraNsP大型化自動(dòng)提取:96樣本臨床pcr檢驗(yàn)標(biāo)本的采集處理保存及核酸提取方法第51頁(yè)全自動(dòng)核酸純化儀QIAGEN企業(yè)生產(chǎn)BioRobotMDxWorkstation96通道自動(dòng)化提取工作站。臨床pcr檢驗(yàn)標(biāo)本的采集處理保存及核酸提取方法第52頁(yè)全自動(dòng)核酸純化儀另外還有羅氏推出MagNAPureLC2.0System，金麥格自動(dòng)核酸提取系統(tǒng)。臨床pcr檢驗(yàn)標(biāo)本的采集處理保存及核酸提取方法第53頁(yè)靶核酸提取質(zhì)量

純化靶核酸完整性：可使用凝膠電泳將樣本核酸提取物與一核酸標(biāo)準(zhǔn)比較測(cè)定。核酸提取產(chǎn)率：可在A260讀數(shù)測(cè)定。核酸純度：可經(jīng)過(guò)提取物A260/A280比率判定血清或血漿中病原體核酸純化純度：采取一個(gè)間接方法，即使用已知病原體含量溶血和/或脂血標(biāo)本用待評(píng)價(jià)試劑提取，然后進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，比較所得到結(jié)果臨床pcr檢驗(yàn)標(biāo)本的采集處理保存及核酸提取方法第54頁(yè)謝謝！臨床pcr檢驗(yàn)標(biāo)本的采集處理保存及核酸提取方法第55頁(yè)臨床pcr檢驗(yàn)標(biāo)本的采集處理保存及核酸提取方法第56頁(yè)一、標(biāo)本搜集、運(yùn)輸、保留

1、標(biāo)本搜集臨床基因擴(kuò)增檢測(cè)試驗(yàn)室對(duì)各種臨床標(biāo)本搜集應(yīng)按檢測(cè)要求建立標(biāo)準(zhǔn)操作程序，并對(duì)臨床標(biāo)本采集人員培訓(xùn)。標(biāo)本采集時(shí)間，應(yīng)在患者疾病發(fā)展過(guò)程中，標(biāo)本采集過(guò)早或過(guò)晚都可能會(huì)給出假陰性結(jié)果。

臨床pcr檢驗(yàn)標(biāo)本的采集處理保存及核酸提取方法第57頁(yè)（1）標(biāo)本采集部位準(zhǔn)備標(biāo)本采集部位清潔消毒可去掉污染微生物或其它雜物，但應(yīng)適度，故標(biāo)本采集部位準(zhǔn)備應(yīng)由訓(xùn)練有素人員進(jìn)行。

（2）標(biāo)本類型和采集量標(biāo)本類型和采集量應(yīng)依據(jù)所測(cè)病原體而定。如：定量PCR對(duì)結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)，應(yīng)選擇患者血腦脊液、胸腹水等標(biāo)本，不宜用痰標(biāo)本，因?yàn)樘抵薪Y(jié)核分枝桿菌分布不均。臨床pcr檢驗(yàn)標(biāo)本的采集處理保存及核酸提取方法第58頁(yè)P(yáng)CR檢測(cè)衣原體時(shí)，因?yàn)橐略w感染上皮細(xì)胞，所以取材一定要取到細(xì)胞，不論男女取材均應(yīng)用特制拭子，男性應(yīng)進(jìn)入尿道2-3cm，女性應(yīng)進(jìn)入子宮頸口2cm并