DB44T 868-2011靈芝（赤芝）菌種

靈芝(赤芝)菌種2011-04-11發(fā)布2011-07-15實(shí)施1靈芝(赤芝)菌種本標(biāo)準(zhǔn)適用于靈芝(赤芝)固體菌種。下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T4789.28食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)染色法、培養(yǎng)基和試劑NY/T528食用菌菌種生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程完整，無損，無色透明干燥、潔凈、松緊適度，能滿足透氣和濾菌要求試管總?cè)莘e的五分之一至四分之一頂端距棉塞或硅膠塞40mm～50mm接種塊大小(接種量)長滿斜面菌絲白色、濃密、短絨狀，氣生菌絲有但不茂盛。在接種塊附近的菌絲有時(shí)呈淺黃色。2表1(續(xù))均勻、平展、無角變、無高溫抑制線無濃密、豐滿、旺健，長速正常、整齊，菌絲有較多鎖狀聯(lián)合。不得檢出完整，無損接種量(每支母種接原種數(shù)，接種物大小)4瓶(袋)～6瓶(袋),≥(12mm×15mm)3表3(續(xù))均勻、平展、無角變、無高溫抑制線、均勻緊緊貼瓶(袋)壁、無干縮無無無無量每袋200g干料為例),在避光、適溫(25℃±1℃)條件下，菌絲長速為8.0mm/d±0.8mm/d,菌絲完整，無損干燥、潔凈、松緊適度，滿足透氣和濾菌要求接種量[每瓶(袋)原種接栽培種數(shù)]30瓶(袋)～50瓶(袋)長滿培養(yǎng)料菌絲白色、濃密、短絨狀生長齊整，色澤一致，無角變，無高溫抑制線緊貼瓶(袋)壁、無干縮無無無在瓶(袋)口附近允許有小塊原基出現(xiàn)有靈芝菌種特有清香味，無酸、臭、霉等異味4在適宜培養(yǎng)基上、適宜培養(yǎng)容器里(以附錄A.2.3為配方、使用17cm×34cm聚量每袋400g干料為例),在避光、適溫(25℃±1℃)條件下，菌絲長速為6.7mm/d±0.8mm/d,菌絲表5感官要求檢驗(yàn)方法檢驗(yàn)項(xiàng)目檢驗(yàn)項(xiàng)目肉眼觀察母種、原種肉眼觀察、測量栽培種肉眼觀察培養(yǎng)基上表面距瓶(袋)口的肉眼觀察菌種外觀各項(xiàng)(雜菌菌落除外)肉眼觀察肉眼觀察，必要時(shí)用5×放大肉眼觀察用放大倍數(shù)不低于400倍的光學(xué)顯微鏡對(duì)培養(yǎng)物的水封片進(jìn)行觀察，每一檢樣應(yīng)觀察不少于50個(gè)視℃~38℃避光震蕩培養(yǎng)1d,觀察培養(yǎng)液是否混濁。培養(yǎng)液混濁，為有細(xì)菌污染；培養(yǎng)液澄清，為無細(xì)28℃避光培養(yǎng)3d～4d,出現(xiàn)白色以外色澤的菌落或非靈芝菌絲形態(tài)菌落的，或出現(xiàn)異味者5檢驗(yàn)項(xiàng)目檢驗(yàn)項(xiàng)目母種長滿所需時(shí)間(d)原種長滿所需時(shí)間(d)菌絲長滿培養(yǎng)基料面所需時(shí)間(d)總生物學(xué)效率(%)出第一潮菇所需時(shí)間(d)第一潮菇生物學(xué)效率(%)芝形平均單產(chǎn)(g/袋)芝蓋尺寸(mm)各級(jí)菌種都要留樣備查，留樣的數(shù)量應(yīng)每個(gè)批號(hào)菌種3支(瓶、袋)～5支(瓶、袋),于避光、4菌種量的10%、5%、1%。但每批抽樣數(shù)量不得少于10支(瓶、袋);若一級(jí)抽樣超過100支(瓶、袋)66.2判定規(guī)則每支(瓶、袋)菌種應(yīng)貼(印)有清晰注明以下內(nèi)容的標(biāo)簽：a)產(chǎn)品名稱(如：靈芝母種);b)品種名稱(如：赤芝02);c)生產(chǎn)單位(如：×x菌種廠);每箱(或其它包裝單位)菌種必須貼有清晰注明以下要素的包裝標(biāo)簽：7外包裝可采用潔凈、干燥的塑料箱、編織袋或有足夠強(qiáng)度的紙箱，箱7.3.2氣溫達(dá)30℃或以上時(shí)，需用4℃~15℃冷藏車運(yùn)輸，運(yùn)輸時(shí)間不得超過7d。7.3.3運(yùn)輸中必須有防震、防曬、防塵、防雨淋、防凍、用于轉(zhuǎn)管保藏的母種，在4℃~6℃避光保藏不超過6個(gè)月；母種至使用時(shí)，在4℃~6℃避光保藏不超過90d;至銷售時(shí)，在4℃~6℃避光保藏不超過80d。原種應(yīng)盡快使用，在溫度不超過30℃、清潔、干燥、通風(fēng)(空氣相對(duì)濕度50%～70%)、避光的室內(nèi)存放不超過7d,在4℃~6℃下貯存時(shí)，貯存期不超過30d。栽培種應(yīng)盡快使用，在溫度不超過30℃、清潔、干燥、通風(fēng)(空氣相對(duì)濕度50%～70%)、避光的室內(nèi)存放不超過7d,在4℃~6℃下貯存時(shí)，貯存期不超過30d。8(資料性附錄)靈芝母種、原種及栽培種常用培養(yǎng)基及其可選配方A.1靈芝母種常用培養(yǎng)基及其可選配方A.1.1PDA培養(yǎng)基(1000mL)馬鈴薯(去皮)200g,葡萄糖20g,瓊脂20g,水1000mL,pH自然。A.1.2綜合PDA(CPDA)培養(yǎng)基(1000mL)馬鈴薯(去皮)200g,葡萄糖20g,磷酸二氫鉀2g,硫酸鎂0.5g,瓊脂20g,維生素B:20μg,水A.2靈芝原種和栽培種常用培養(yǎng)基及其可選配方A.2.1顆粒培養(yǎng)基高粱80%、小米19%、輕質(zhì)碳酸鈣1%。高粱用水煮熟至掰開無白心，瀝去多余水分；小米使用前浸泡12小時(shí)，瀝去多余水分；高粱、小米和輕質(zhì)碳酸鈣三者混合拌勻，pH自然。A.2.2棉籽殼培養(yǎng)基棉籽殼80%、麥麩19%、輕質(zhì)碳酸鈣1%。三者混合拌勻，加水至培養(yǎng)料含水量達(dá)60%～65%,pH自然。A.2.3闊葉木雜木屑培養(yǎng)基闊葉木雜木屑78%、麩皮20%、輕質(zhì)碳酸鈣2%。三者混合拌勻，加水至培養(yǎng)料含水量達(dá)60%～65%,9(資料性附錄)待測菌種CYM液體培養(yǎng)基配方：蛋白胨2g,酵母膏2g,葡萄糖20g,硫酸鎂(MgSO?·7H?O)0.5g,磷酸氫二鉀(K?HPO?)1g,磷酸二氫鉀(KH?PO?)1g,純水1000mL,pH自然。a)2倍CTAB提取液在65℃在水浴鍋中預(yù)熱。c)樣品轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中，管內(nèi)先加入600μL2倍CTAB提取液在65℃水浴鍋中預(yù)熱(用少量提取液洗下研缽上殘留的粉末樣品，輕輕混勻，在65℃中水浴3minmind)冷卻2min后，加入等體積(約600μL)的酚/氯仿/異戊醇(25:24:1),充分搖動(dòng)混勻。e)以約11000×g,離心10min,取上清液移入另一新1.5ml離心管，重復(fù)步驟d)操作，用氯仿/異戊醇(24:1)再抽提離心一次。同時(shí)將2/3體積的異丙醇(或2倍體積的無水乙醇)預(yù)冷。f)兩次抽提后的上清液轉(zhuǎn)入新離心管，加入2/3體積的預(yù)冷異丙醇(或2倍體積的預(yù)冷無水乙醇),再加入約1/10體積的乙酸鈉(約30μL～50μL),緩慢翻轉(zhuǎn)混勻，沉淀DNA。g)以約18000×g,離心15min,棄上清液。70%酒精(400μL)漂洗沉淀2次(快速翻轉(zhuǎn)振蕩幾分鐘),以約7000×g,離心5min,棄上清液，沉淀用紙巾吸取剩余乙醇，自然晾干或低溫烘干(電風(fēng)筒吹干)。h)加1倍TE緩沖液(Tris10mmol/L+EDTA1mmol采用真菌核糖體基因間隔區(qū)通用引物對(duì)ITSITSITSTCCGTAGGTGAACCTGCGGITS反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化后，以PCR引物為測序引物，分別雙向序列拼接后在GenBank上進(jìn)行比對(duì)(Blast),若發(fā)現(xiàn)序列與GenBank上已知序列方向相反，則列相似性達(dá)98%以上時(shí)，則可判定待測菌與GenBank上該已知菌是同一個(gè)種。取赤芝(Gl-YW)為靈TCGAGTTTTGACCGGGTTGTAGCTGGCCTTCCGAGGCATGTGCACGCCACACCTGTGCACTTACTGTGGGCTTCAGATTGCGAGGCACGCTCTTTACCGGGCTTTCTGTGCCTGCGTTTATCACAAACTCTATAAAGTAACAGAATGTGTATTGCGTATACAACTTTCAGCAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCGAGGAGCATGCCTGTTTGA