氣相色譜法測(cè)定己酸菌發(fā)酵液中的己酸等有機(jī)酸含量

氣相色譜法測(cè)定己酸菌發(fā)酵液中的己酸等有機(jī)酸含量袁華偉;楊澤剛;蘭著璽;游玲;劉光錢;胡永奇;王松濤;沈才洪【摘要】對(duì)氣相色譜法測(cè)定己酸菌發(fā)酵液中己酸等有機(jī)酸含量的預(yù)處理方法進(jìn)行了研究，優(yōu)化了色譜條件，建立了一種快速測(cè)定己酸菌發(fā)酵液中己酸、丁酸、乙酸等有機(jī)酸的方法.己酸菌發(fā)酵液經(jīng)2M硫酸酸化至pH2后經(jīng)高速冷凍離心，再經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾，利用Pure-WAX毛細(xì)管色譜柱、以2-乙基丁酸為內(nèi)標(biāo)、直接進(jìn)樣氣相色譜法定量測(cè)定.色譜分析條件為檢測(cè)器溫度260°C,汽化溫度250°C,柱溫150°C,分流比50:1,采樣時(shí)間10min.研究結(jié)果表明，應(yīng)用該法測(cè)定己酸菌發(fā)酵液中的己酸、丁酸、乙酸等有機(jī)酸含量,RSD為2.22%~2.54%，加標(biāo)回收率在96.83%~103.71%之間.該方法具有快速方便、定量準(zhǔn)確等特點(diǎn),適合己酸菌發(fā)酵液中己酸、丁酸、乙酸等有機(jī)酸的檢測(cè).％Thepretreatmentformeasuringthecontentofcaproicacidandotherorganicacidsinfermentedliquidofcaproicacidbac-teriawasstudied.Firstly,thefermentedliquidunderwent2MsulfuricacidacidificationtillpH=2,thenthroughhigh-speedfreezecen-trifugationandmicroporefiltration,directsamplingGCusingPure-WAXcapillary-columnand2-ethylbutyricacidasinternalstan-dardwasperformed.Thechromatographicconditionswereasfollows:thedetectortemperaturewasat260°C,thevaporizationtem-peraturewasat250°C,thecolumntemperaturewasat150°C,thesplitratiowas50:1andthesamplingtimewas10min.Theresultsshowedthatthecontentofcaproicacid,butyricacid,aceticacidandotherorganicacidscouldbemeasuredbysuchmethod,RSDwas2.22%to2.54%,andstandardadditionrecoverywas96.83%to103.71%.Thismethodhadtheadvantagessuchasconvenient,fastandaccuratedetermination.【期刊名稱】《釀酒科技》【年(卷)，期】2018(000)003【總頁(yè)數(shù)】4頁(yè)(P102-105)【關(guān)鍵詞】己酸菌發(fā)酵液;己酸;氣相色譜法;檢測(cè)【作者】袁華偉;楊澤剛;蘭著璽;游玲瀏光錢湖永奇;王松濤;沈才洪【作者單位】宜賓學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，四川宜賓644000;瀘州老窖股份有限公司,四川瀘州646000;國(guó)家固態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心，四川瀘州I646000;宜賓學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，四川宜賓644000;宜賓學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，四川宜賓644000;宜賓學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，四川宜賓644000;瀘州老窖股份有限公司，四川瀘州646000;瀘州老窖股份有限公司，四川瀘州646000;國(guó)家固態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心，四川瀘州646000;瀘州老窖股份有限公司，四川瀘州646000;國(guó)家固態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心，四川瀘州646000;瀘州老窖股份有限公旬四川瀘州646000;國(guó)家固態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心，四川瀘州646000【正文語(yǔ)種】中文【中圖分類】TS262.3;TS261.7;TS261.4白酒中的有機(jī)酸可以調(diào)節(jié)口味使酒體醇和爽口，更主要的是酸類物質(zhì)是形成相對(duì)應(yīng)的乙酯類香味成分的前體物質(zhì)。不同的有機(jī)酸與醇在微生物酶的催化作用下，生成不同的酯，沒(méi)有有機(jī)酸就沒(méi)有相對(duì)應(yīng)的酯類物質(zhì)生成。其中己酸乙酯在濃香型白酒中的含量最高，對(duì)濃香型白酒的貢獻(xiàn)也最大，是濃香型白酒的主體香味物質(zhì)，也是判定濃香型白酒質(zhì)量等級(jí)的關(guān)鍵指標(biāo)［1］。同時(shí)，己酸乙酯也是醬香型白酒三大典型原酒之一的窖底香型中最突出的香味物質(zhì)，賦予其芳香濃郁的顯著特征［2］。在白酒特定的釀造環(huán)境下，己酸乙酯主要是在窖池內(nèi)通過(guò)微生物的酯化作用合成。由己酸菌產(chǎn)生的己酸和酵母菌產(chǎn)生的乙醇生物合成［3-4］。由于己酸菌的生長(zhǎng)速度緩慢，生長(zhǎng)繁殖需要嚴(yán)格的厭氧條件，所以研究濃香型白酒中的產(chǎn)酸細(xì)菌重點(diǎn)在己酸菌［5-6］。己酸菌培養(yǎng)液中己酸等有機(jī)酸的組成及其含量往往隨菌種的種類、純度和發(fā)酵工藝的不同而不同，分析其中的有機(jī)酸組成與含量對(duì)開(kāi)發(fā)己酸菌菌種資源、完善己酸菌發(fā)酵生產(chǎn)工藝條件和科學(xué)指導(dǎo)白酒生產(chǎn)都具有重要意義。因此，己酸菌在篩選、培養(yǎng)過(guò)程中如何快速、準(zhǔn)確測(cè)定發(fā)酵液中的己酸等有機(jī)酸的含量是非常值得研究的。目前測(cè)定己酸菌發(fā)酵液中己酸的方法主要有：以醋酸銅與己酸反應(yīng)生成藍(lán)色己酸銅沉淀，被乙醚抽提出來(lái)使乙醚層呈現(xiàn)藍(lán)色的顯色反應(yīng)為原理的比色法［7-8］；己酸菌發(fā)酵液進(jìn)行蒸餾后，在毛細(xì)管色譜柱上直接進(jìn)樣檢測(cè)［9］；經(jīng)乙醚萃取后用非極性毛細(xì)管色譜柱分析的氣相色譜法［10］。比色法分析發(fā)酵液中的己酸含量時(shí)，培養(yǎng)基中醋酸鈉及其他有機(jī)酸的存在對(duì)己酸定性顯色反應(yīng)有影響［11-12］。采用蒸餾或乙醚萃取的方法處理己酸菌發(fā)酵液，用氣相色譜法測(cè)定己酸含量，可避免比色法的誤差，提高分析準(zhǔn)確度，但前處理操作復(fù)雜，并且分析時(shí)間也較長(zhǎng)。本研究對(duì)氣相色譜法測(cè)定己酸菌發(fā)酵液中己酸的方法作了改進(jìn)，建立了一種利用毛細(xì)管色譜柱、直接進(jìn)樣氣相色譜法定量測(cè)定己酸菌發(fā)酵液中的己酸、丁酸、乙酸等有機(jī)酸的方法。1材料與方法1.1材料、試劑及儀器菌株：使用瀘州老窖股份有限公司自行分離篩選自老窖泥的產(chǎn)己酸細(xì)菌進(jìn)行己酸發(fā)酵。己酸菌培養(yǎng)基（巴氏合成培養(yǎng)基）：（NH4）2SO40.05%、K2HPO40.04%、MgSO4?7H2O0.02%、乙酸鈉0.5%、酵母膏0.1%、CaCO31%、乙醇2%。試劑：己酸、丁酸、乙酸、2-乙基丁酸（均為標(biāo)準(zhǔn)品），天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；無(wú)水乙醇（色譜純），天津市科密歐化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心。準(zhǔn)確稱取己酸、丁酸、乙酸、2-乙基丁酸100mg于100mL容量瓶中，用25%色譜純乙醇溶液定容至刻度。配制標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為己酸1000mg/L.T酸1000mg/L、乙酸1000mg/L、2-乙基丁酸1000mg/L。儀器設(shè)備：色譜儀為日本島津公司GC-2010型氣相色譜儀，F(xiàn)ID氫火焰檢測(cè)器，配N2000工作站。色譜柱為日本島津公司的InertCapTMPureWax毛細(xì)管柱，長(zhǎng)30m,內(nèi)徑0.25mm，膜厚0.25pmo1.2樣品處理取樣品40mL加2M硫酸酸化至pH2，加無(wú)水乙醇至50mL，在12000r/min、4°C條件下進(jìn)行冷凍離心5min，取上清液，過(guò)0.2pm微孔濾膜。進(jìn)樣前將樣品和內(nèi)標(biāo)1:1混勻。1.3氣相色譜分析條件采用InertCapTMPureWax毛細(xì)管柱，載氣為高純氮?dú)?，燃燒氣為H2。內(nèi)標(biāo)為以25%乙醇配制的1000mg/L的2-乙基丁酸。檢測(cè)器溫度260C,汽化溫度250C，柱溫150C。進(jìn)樣量為0.5pL,分流比50:1，采樣時(shí)間10min。N2000色譜工作站，采用保留時(shí)間定性，內(nèi)標(biāo)法定量。2結(jié)果與討論2.1發(fā)酵液預(yù)處理方法直接進(jìn)樣毛細(xì)管柱氣相色譜法分析己酸菌發(fā)酵液中的己酸等有機(jī)酸，進(jìn)樣的樣品需達(dá)到色譜進(jìn)樣要求。要求進(jìn)樣的樣品無(wú)固形物，關(guān)鍵要對(duì)樣品進(jìn)行處理。發(fā)酵培養(yǎng)基中添加了碳酸鈣，發(fā)酵液中己酸等有機(jī)酸很大一部分以鹽的形式存在，因此酸化處理己酸發(fā)酵液是必要的。己酸等有機(jī)酸沸點(diǎn)都比較高，不容易蒸餾出，蒸餾后的殘液中己酸含量占很大部分［13］。如用鹽酸酸化，鹽酸與發(fā)酵液中的碳酸鈣反應(yīng)生成溶于水的氯化鈣，樣品中存在一定的鹽分，對(duì)色譜柱的使用壽命有不良影響。用硫酸酸化后生成難溶于水的硫酸鈣，可離心分離去除，減少樣品中的鹽分，確保色譜柱的正常使用。通過(guò)處理?xiàng)l件實(shí)驗(yàn)，確定己酸發(fā)酵液用2M硫酸酸化至pH2后以12000r/min、4C進(jìn)行高速冷凍離心5min，取上清液，再用0.2pm微孔濾膜過(guò)濾，所得樣品直接進(jìn)樣分析。2.2色譜條件的優(yōu)化經(jīng)處理后的己酸發(fā)酵液樣品pH值較低，故采用具有最高惰性、鍵合了聚乙二醇強(qiáng)極性固定相的InertCapTMPureWax毛細(xì)管柱。應(yīng)用30mx0.25mmx0.25pmPureWax毛細(xì)管柱進(jìn)行氣相色譜分離時(shí)，目標(biāo)峰可得到較好的分離效果。為防止氣相色譜分析所用的毛細(xì)管柱被氧化，采用99.9995%的高純氮?dú)鉃檩d氣，選擇載氣壓力為120kPa［14］。綜合考慮己酸菌發(fā)酵液有機(jī)酸的分離度、分析時(shí)間、檢測(cè)器靈敏度和歧化效應(yīng)的影響，選定分流比為50:1。由于己酸菌發(fā)酵液有機(jī)酸的組分較少，為提高分析速度、縮短分析周期，使組分快速流出色譜柱，保證有機(jī)酸組分峰具有較高的分離度，經(jīng)過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)對(duì)比色譜條件，選擇毛細(xì)管柱的柱溫150C,汽化溫度250C，檢測(cè)器溫度260C。進(jìn)樣量為0.5pL,采樣時(shí)間10min。在本色譜條件下，對(duì)濃度為1000mg/L己酸、丁酸、乙酸和2-乙基丁酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示能將己酸、丁酸、乙酸和2-乙基丁酸完全分開(kāi)。混合標(biāo)準(zhǔn)色譜圖見(jiàn)圖1,己酸菌發(fā)酵液色譜圖見(jiàn)圖2。有機(jī)酸之間的分離度非常好，分離效果良好，而且色譜出峰尖銳、對(duì)稱，可準(zhǔn)確定性。氣相色譜測(cè)定己酸菌發(fā)酵液中的己酸、丁酸、乙酸等有機(jī)酸分析時(shí)間在10min以內(nèi)，分離時(shí)間快，分析周期短。圖1乙酸、丁酸、己酸混標(biāo)色譜譜圖2.3氣相色譜法精密度實(shí)驗(yàn)圖2己酸菌發(fā)酵液色譜圖氣相色譜測(cè)定己酸、丁酸、乙酸等有機(jī)酸的方法精密度以測(cè)定待測(cè)組分含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)評(píng)價(jià)。對(duì)同一個(gè)己酸菌發(fā)酵液樣品進(jìn)行6次重復(fù)性測(cè)試，其己酸、丁酸、乙酸等有機(jī)酸含量的各個(gè)測(cè)定值及平均值見(jiàn)表1，己酸、丁酸、乙酸的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.54%、2.22%、2.35%，說(shuō)明該方法具有較好的精密度。2.4加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)分別取同一己酸菌發(fā)酵液為樣品，對(duì)該樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，添加〃高中低”3個(gè)濃度的己酸、丁酸、乙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液作為加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)添加水平做3次平行，最后計(jì)算平均回收率，驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確度，結(jié)果見(jiàn)表2。通過(guò)對(duì)樣品進(jìn)行加標(biāo)測(cè)定，由表2可得出方法加標(biāo)回收率在96.83%~103.71%之間。說(shuō)明該方法準(zhǔn)確性好，可保證己酸、丁酸、乙酸等有機(jī)酸測(cè)量結(jié)果的可靠性。2.5己酸菌發(fā)酵液中的己酸等有機(jī)酸含量的測(cè)定取6個(gè)己酸菌發(fā)酵液樣品，分別編號(hào)為1、2、3、4、5、6,按照上述的預(yù)處理方法和分析步驟進(jìn)行試驗(yàn)，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。從上述結(jié)果可以看出，利用氣相色譜法可一次性測(cè)定己酸菌發(fā)酵液中的己酸、丁酸、乙酸等有機(jī)酸含量。己酸菌發(fā)酵液樣品中檢測(cè)出的己酸含量在5250.46~10066.27mg/L之間，丁酸含量在1129.78-2139.53mg/L之間，乙酸含量在143.47~902.08mg/L之間。3結(jié)論本研究采用硫酸對(duì)己酸菌發(fā)酵液進(jìn)行酸化及高速離心機(jī)、微孔濾膜過(guò)濾預(yù)處理方法，排除了發(fā)酵液中的一些物質(zhì)對(duì)測(cè)定的影響。使用氣相色譜法可一次性快速分析己酸菌發(fā)酵液中的己酸、丁酸、乙酸等多種有機(jī)酸組分，具有準(zhǔn)確度高、簡(jiǎn)便快速等優(yōu)點(diǎn)。該方法可應(yīng)用于己酸菌的篩選及己酸菌的發(fā)酵控制，測(cè)定發(fā)酵液中的己酸、丁酸、乙酸等有機(jī)酸含量。表1氣相色譜法精密度試驗(yàn)(n=6)組分己酸含量丁酸含量乙酸含量測(cè)定值(mg/L)19564.731336.92382.41234569124.851421.05401.679784.561398.45394.679361.471416.64402.629716.461386.69382.219498.081408.62398.72平均值(mg/L)9525.031394.73393.72RSD(%)2.542.222.35表2己酸、丁酸、乙酸在3個(gè)加標(biāo)水平下的回收率名稱己酸丁酸乙酸本底值(mg/L)7679.527679.527679.52957.26957.26957.26387.27387.27387.27加標(biāo)量(mg/L)2000.325000.168000.06500.04750.121000.26100.03201.25400.24測(cè)得值(mg/L)9714.56±180.1512816.75±214.4715613.42±168.941441.45±16.231724.76±18.491987.46±24.17485.23±7.84594.64±8.37802.37±10.13回收率(％)101.74102.7499.1796.83102.32102.9997.93103.04103.71表3發(fā)酵液中己酸等有機(jī)酸含量(mg/L)樣品編號(hào)123456己酸6541.77±82.135250.46±74.526403.78±69.2410066.27±124.345326.51±84.426857.14±76.64丁酸2139.53±18.471411.24±13.281129.78±24.511179.10±18.191202.93±17.241185.38±15.23乙酸143.47±4.36628.09±11.28562.40±8.61512.