實(shí)驗(yàn)一細(xì)菌形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察

醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)ExperimentofMedicalMicrobiology

基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心病原生物學(xué)與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室楊致邦

2010.1

目前一頁\總數(shù)二十九頁\編于十七點(diǎn)教材高等醫(yī)學(xué)院校基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)系列教材?病原生物學(xué)實(shí)驗(yàn)?科學(xué)出版社，2008年6月主編楊致邦葉彬目前二頁\總數(shù)二十九頁\編于十七點(diǎn)掌握病原生物學(xué)的基本方法與基本操作技術(shù)；強(qiáng)化實(shí)驗(yàn)室生物安全觀念，掌握無菌操作技術(shù)；加深對病原生物學(xué)基本理論知識的理解與認(rèn)識；培養(yǎng)獨(dú)立操作、獨(dú)立觀察和思考、獨(dú)立分析問題和解決實(shí)際問題的能力；增強(qiáng)科技創(chuàng)新能力；培養(yǎng)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)淖黠L(fēng)、科學(xué)的方法和嚴(yán)肅認(rèn)真的工作態(tài)度。

實(shí)驗(yàn)教學(xué)的目標(biāo)目前三頁\總數(shù)二十九頁\編于十七點(diǎn)臨床醫(yī)學(xué)本科實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及安排實(shí)驗(yàn)課的帶教內(nèi)容學(xué)時(shí)數(shù)顯微鏡錄像1細(xì)菌形態(tài)觀察4需要

2細(xì)菌的生長現(xiàn)象與消毒滅菌

4

有3致病性球菌4需要有4腸道桿菌4

有5白喉?xiàng)U菌、厭氧菌4需要

6四體、真菌、病毒4需要有目前四頁\總數(shù)二十九頁\編于十七點(diǎn)臨床藥學(xué)本科實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及安排實(shí)驗(yàn)課的帶教內(nèi)容學(xué)時(shí)數(shù)顯微鏡錄像1細(xì)菌形態(tài)觀察4需要

2細(xì)菌的生長現(xiàn)象與消毒滅菌

4

有3致病性球菌4需要有4藥物的微生物檢測45藥物的敏感性實(shí)驗(yàn)4

6四體、真菌、病毒4需要有目前五頁\總數(shù)二十九頁\編于十七點(diǎn)非臨床醫(yī)學(xué)本科實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及安排實(shí)驗(yàn)課內(nèi)容學(xué)時(shí)數(shù)顯微鏡錄像1細(xì)菌形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察4需要

2細(xì)菌的生長現(xiàn)象與消毒滅菌4

有3四體、真菌、病毒4需要有目前六頁\總數(shù)二十九頁\編于十七點(diǎn)實(shí)驗(yàn)一細(xì)菌形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察

ObserveonMorphologyandStructure

ofBacteria目前七頁\總數(shù)二十九頁\編于十七點(diǎn)【目的要求】1.熟悉實(shí)驗(yàn)室生物安全規(guī)則,掌握無菌操作技術(shù)；2.掌握細(xì)菌標(biāo)本革蘭染色的操作步驟和方法；顯微鏡(油鏡)下細(xì)菌形態(tài)的觀察;革蘭染色結(jié)果判斷；3.掌握細(xì)菌的特殊結(jié)構(gòu)（莢膜、鞭毛、芽孢）的形態(tài)特點(diǎn)。目前八頁\總數(shù)二十九頁\編于十七點(diǎn)【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容】1.實(shí)驗(yàn)室生物安全規(guī)則(P3)

；2.細(xì)菌標(biāo)本革蘭染色觀察（Gram’sStain)(每人做）(P10)

；3.復(fù)習(xí)顯微鏡(油鏡)的使用(每人做）；4.細(xì)菌特殊結(jié)構(gòu)（莢膜、鞭毛、芽胞）的觀察（示教鏡）(P104)

。目前九頁\總數(shù)二十九頁\編于十七點(diǎn)【實(shí)驗(yàn)材料】

(1)菌種:葡萄球菌、大腸桿菌斜面培養(yǎng)物。(2)試劑:革蘭染色液。(3)其他:生理鹽水、載玻片、酒精燈、接種環(huán)、顯微鏡、香柏油、擦鏡紙、二甲苯等。目前十頁\總數(shù)二十九頁\編于十七點(diǎn)【實(shí)驗(yàn)方法】1．細(xì)菌涂片的制作步驟：涂片干燥固定

注意點(diǎn)：1）無菌操作2）加生理鹽水（固體培養(yǎng)物）目前十一頁\總數(shù)二十九頁\編于十七點(diǎn)生理鹽水生理鹽水生理鹽水+++葡萄球菌大腸桿菌葡萄球菌+大腸桿菌載玻片目前十二頁\總數(shù)二十九頁\編于十七點(diǎn)2.革蘭染色1)方法初染:結(jié)晶紫和碳酸氫鈉各1～3滴,3s-5s，水沖凈,甩干。媒染:碘液1～3滴,3s-5s秒鐘，水沖凈,甩干。脫色:95%乙醇數(shù)滴,5s-10s,水沖凈,甩干。復(fù)染:稀釋石炭酸復(fù)紅液1～3滴,10s，水沖凈,甩干。關(guān)鍵步驟：掌握脫色程度。目前十三頁\總數(shù)二十九頁\編于十七點(diǎn)【結(jié)果觀察】指標(biāo):形態(tài)、染色性、排列。染色性判斷：革蘭陽性菌染成藍(lán)紫色,革蘭陰性菌染成紅色。3.觀察標(biāo)本片自然干燥或在酒精燈火焰上烤干后,在涂菌處滴加1滴香柏油,油鏡下觀察。目前十四頁\總數(shù)二十九頁\編于十七點(diǎn)Gram’sStain,×1000葡萄球菌:革蘭陽性球菌,成堆或呈葡萄狀排列。目前十五頁\總數(shù)二十九頁\編于十七點(diǎn)大腸桿菌:革蘭陰性桿菌,不規(guī)則分散排列。Gram’sStain,×1000

目前十六頁\總數(shù)二十九頁\編于十七點(diǎn)4.細(xì)菌特殊結(jié)構(gòu)（莢膜、鞭毛、芽胞）的觀察注意點(diǎn)：觀察時(shí)只能動(dòng)顯微鏡的微調(diào),不要?jiǎng)游恢?。要求：畫圖記錄。目前十七頁\總數(shù)二十九頁\編于十七點(diǎn)1）破傷風(fēng)桿菌的芽胞:芽胞染色×1000目前十八頁\總數(shù)二十九頁\編于十七點(diǎn)鞭毛染色×10002)變形桿菌的鞭毛:目前十九頁\總數(shù)二十九頁\編于十七點(diǎn)3)肺炎鏈球菌的莢膜:莢膜染色×1000目前二十頁\總數(shù)二十九頁\編于十七點(diǎn)【實(shí)驗(yàn)注意點(diǎn)】1.生物安全、無菌操作,菌種管清理；2.顯微鏡(油鏡)的使用——用后擦鏡頭；3.用過的載玻片放進(jìn)有消毒水的玻缸。4.做好清潔衛(wèi)生。目前二十一頁\總數(shù)二十九頁\編于十七點(diǎn)【實(shí)驗(yàn)報(bào)告內(nèi)容】1.細(xì)菌標(biāo)本革蘭染色觀察（方法、結(jié)果畫圖、討論）；2.細(xì)菌特殊結(jié)構(gòu)（莢膜、鞭毛、芽胞）觀察（畫圖）。目前二十二頁\總數(shù)二十九頁\編于十七點(diǎn)【實(shí)驗(yàn)報(bào)告示范】實(shí)驗(yàn)一細(xì)菌形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容】1.實(shí)驗(yàn)室生物安全規(guī)則（每人掌握）；2.細(xì)菌標(biāo)本革蘭染色觀察（Gram’sStain)(每人做）；3.復(fù)習(xí)顯微鏡(油鏡)的使用(每人做）；4.細(xì)菌特殊結(jié)構(gòu)（莢膜、鞭毛、芽胞）的觀察（示教鏡）。目前二十三頁\總數(shù)二十九頁\編于十七點(diǎn)【實(shí)驗(yàn)材料和方法】一、細(xì)菌標(biāo)本革蘭染色觀察1．細(xì)菌涂片的制作菌種：葡萄球菌、大腸桿菌斜面培養(yǎng)物方法：涂片干燥固定

1）涂片：在酒精燈火焰旁用接種環(huán)無菌操作取生理鹽水和葡萄球菌、大腸桿菌斜面培養(yǎng)物，涂抹、混勻于載玻片上，如下圖：生理鹽水生理鹽水生理鹽水+++葡萄球菌大腸桿菌葡萄球菌+大腸桿菌目前二十四頁\總數(shù)二十九頁\編于十七點(diǎn)3）固定將載玻片以均勻的速度通過酒精燈火焰來回3次。2）干燥將涂片在酒精燈火焰上方約20cm高處烤干。2.革蘭染色1)方法初染:結(jié)晶紫和碳酸氫鈉各1～3滴,3s-5s，水沖凈,甩干。媒染:碘液1～3滴,3s-5s秒鐘，水沖凈,甩干。脫色:95%乙醇數(shù)滴,5s-10s,水沖凈,甩干。復(fù)染:稀釋石炭酸復(fù)紅液1～3滴,10s，水沖凈,甩干。目前二十五頁\總數(shù)二十九頁\編于十七點(diǎn)3.觀察將標(biāo)本片在酒精燈火焰上烤干后,在涂菌處滴加1滴香柏油,油鏡下觀察。4.結(jié)果見圖1:葡萄球菌:革蘭陽性球菌,成堆或呈葡萄狀排列大腸桿菌:革蘭陰性桿菌,不規(guī)則分散排列Gram’sStain,×1000圖1：細(xì)菌標(biāo)本革蘭染色觀察結(jié)果目前二十六頁\總數(shù)二十九頁\編于十七點(diǎn)5.討論本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,通過革蘭染色在油鏡下可清楚地觀察到標(biāo)本片上細(xì)菌的形態(tài)、染色性和排列狀態(tài)。革蘭染色可將細(xì)菌分為2大類，即染成藍(lán)紫色的革蘭陽性菌和染成紅色的革蘭陰性菌。其原理是革蘭陽性菌和革蘭陰性菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的差異。結(jié)果不正確的影響因素分析：目前二十七頁\總