病毒感染診斷與防治

病毒感染診斷與防治病毒感染診斷與防治第1頁常見病毒學(xué)診療方法包含：病毒分離判定病毒血清學(xué)檢驗(yàn)病毒蛋白和核酸檢測(cè)第一節(jié)病毒感染診療病毒感染診斷與防治第2頁一、標(biāo)本采取與送檢應(yīng)注意以下標(biāo)準(zhǔn)：1.對(duì)本身帶有雜菌(如咽拭子、糞便)或易受污染標(biāo)本，要進(jìn)行病毒分離培養(yǎng)時(shí)，應(yīng)使用抗生素。2.因病毒在室溫中易失去活性，標(biāo)本應(yīng)低溫保留并盡快送檢。3.血清學(xué)診療標(biāo)本采取應(yīng)在發(fā)病早期和病后2～3w內(nèi)各取1份血清，方便對(duì)比雙份血清抗體效價(jià)動(dòng)態(tài)改變。病毒感染診斷與防治第3頁二、病毒分離與判定(一)病毒分離1.動(dòng)物接種是最原始病毒培養(yǎng)方法，依據(jù)病毒種類不一樣，選擇敏感動(dòng)物及適宜接種部位，如嗜神經(jīng)性病毒（狂犬病毒）可接種于小鼠腦內(nèi)，痘病毒可接種于家兔角膜或皮內(nèi)。

病毒感染診斷與防治第4頁2.雞胚培養(yǎng)雞胚對(duì)各種病毒敏感。普通采取孵化9～14天雞胚，依據(jù)病毒種類不一樣，將病毒標(biāo)本接種于雞胚不一樣部位，最常見雞胚接種部位有：羊膜腔、尿囊腔、絨毛尿囊膜和卵黃囊等。病毒感染診斷與防治第5頁病毒感染診斷與防治第6頁病毒感染診斷與防治第7頁3.組織培養(yǎng)法(tissueculture)或細(xì)胞培養(yǎng)(cellculture)法是將離體活組織塊或分散組織細(xì)胞加以培養(yǎng)技術(shù)總稱，為病毒分離判定中最常見基礎(chǔ)方法。病毒感染診斷與防治第8頁病毒感染診斷與防治第9頁

細(xì)胞改變有些病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖時(shí)可引發(fā)特有細(xì)胞病變，稱為細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)。常見改變有細(xì)胞變圓、聚集、壞死、溶解或脫落等。有些病毒如麻疹病毒、CMV、RSV等作用于細(xì)胞膜，可使鄰近細(xì)胞相互融合，形成多核巨細(xì)胞或稱融合細(xì)胞。有些病毒(如狂犬病病毒、麻疹病毒等)可在培養(yǎng)細(xì)胞中形成胞漿或核內(nèi)包涵體。病毒在培養(yǎng)細(xì)胞中增殖指標(biāo)病毒感染診斷與防治第10頁病毒感染診斷與防治第11頁病毒培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)CPE病毒感染診斷與防治第12頁2.紅細(xì)胞吸附(hemadsorption,HAd)流感或副流感病毒等感染細(xì)胞后，因?yàn)榧?xì)胞膜上出現(xiàn)了血凝素(haemagglutinin,HA)，含有吸附脊椎動(dòng)物(豚鼠、雞、猴等)紅細(xì)胞能力，這一現(xiàn)象稱紅細(xì)胞吸附，常見來測(cè)定含有HA粘病毒與副粘病毒增殖。若有對(duì)應(yīng)抗血清，則能中和細(xì)胞膜上HA，HAd不再發(fā)生，稱紅細(xì)胞吸附抑制試驗(yàn)。病毒感染診斷與防治第13頁3.干擾現(xiàn)象(interference)一些病毒感染細(xì)胞時(shí)不出現(xiàn)CPE或其它易于測(cè)出改變(如HAd)，但能干擾在其后感染另一病毒增殖。如風(fēng)疹病毒感染Vero細(xì)胞時(shí)CPE不顯著，但它能干擾后感染埃可病毒(ECHOV)增殖，從而阻抑后者所特有CPE。病毒感染診斷與防治第14頁4.細(xì)胞代謝改變病毒感染細(xì)胞結(jié)果可使培養(yǎng)液pH值改變，說明細(xì)胞代謝在病毒感染后發(fā)生了改變。這種培養(yǎng)環(huán)境生化改變也可作為判斷病毒增殖指標(biāo)。病毒感染診斷與防治第15頁(二)病毒數(shù)量與感染性測(cè)定

1.蝕斑測(cè)定是一個(gè)檢驗(yàn)和準(zhǔn)確滴定病毒感染性方法。將稀釋病毒懸液加入單層細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。病毒吸附后，再覆蓋一層融化半固體營養(yǎng)瓊脂，使病毒在單層細(xì)胞培養(yǎng)中有限擴(kuò)散。結(jié)果是每一個(gè)有感染性病毒在單層細(xì)胞中可產(chǎn)生一個(gè)不足感染灶。用活性染料(如中性紅)染色，則活細(xì)胞著色，受病毒感染而破壞細(xì)胞不著色，形成肉眼可見蝕斑(plaque)。每個(gè)蝕斑是由一個(gè)感染性病毒顆粒形成，稱作蝕斑形成單位(plaqueformingunit,PFU)。病毒懸液中感染性病毒量滴度可用PFU／ml表示。病毒感染診斷與防治第16頁2.50%組織細(xì)胞感染量(TCID50)測(cè)定法該方法是測(cè)定病毒能使50%組織培養(yǎng)細(xì)胞發(fā)生感染最小量。普通是將病毒懸液作10倍系列稀釋，分別接種細(xì)胞，經(jīng)一定時(shí)間后觀察CPE、血細(xì)胞吸附等指標(biāo)，以最高稀釋度能感染50%細(xì)胞量為終點(diǎn)。最終用統(tǒng)計(jì)方法計(jì)算出50%組織細(xì)胞感染量（50%tissuecultureinfectiousdose,TCID50)。病毒感染診斷與防治第17頁三、病毒感染血清學(xué)診療原理是用已知病毒抗原來檢測(cè)病人血清中有沒有對(duì)應(yīng)抗體，故須待病人感染后體內(nèi)產(chǎn)生抗體時(shí)才能檢出。另外，在采取臨床標(biāo)本及病人血清應(yīng)注意病程，必須采取患者急性期血清與恢復(fù)期血清(雙份血清)進(jìn)行血清學(xué)試驗(yàn)。若第2次血清抗體滴度比第1次高出4倍以上時(shí)，才有診療意義。病毒感染診斷與防治第18頁1.中和試驗(yàn)(neutralizingtest,NTtest)

是病毒在活體內(nèi)或細(xì)胞培養(yǎng)中被特異性抗體中和而失去感染性一個(gè)試驗(yàn)。中和抗體(netralizingantibodies,NTAb)是作用于病毒表面抗原(衣殼或包膜)抗體，同種不一樣型病毒間普通無交叉，特異性高，而且抗體在體內(nèi)維持時(shí)間長。中和抗體陽性不一定表示正在感染中，也可能因以前有過隱性感染所致。所以，中和試驗(yàn)適合用于人群免疫情況調(diào)查，在臨床診療上較少使用。病毒感染診斷與防治第19頁2.補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)

(complementfixationtest,CFtest)用已知病毒可溶性(CF)抗原來檢測(cè)病人血清中對(duì)應(yīng)(CF)抗體。CF抗原是病毒內(nèi)部抗原，同種異型間常有交叉，故特異性較中和試驗(yàn)低。但CF抗體出現(xiàn)較早，消失較快，故CF陽性可作為近期感染指標(biāo)。病毒感染診斷與防治第20頁3.血凝抑制試驗(yàn)(hemagglutinatiainhibitiontest,HItest)

含有HA病毒能凝集雞、豚鼠、人等紅細(xì)胞，稱血凝現(xiàn)象。這種現(xiàn)象能被對(duì)應(yīng)抗體抑制，稱HI試驗(yàn)。其原理是對(duì)應(yīng)抗體與病毒結(jié)合后，阻抑了病毒表面HA與紅細(xì)胞結(jié)合。本試驗(yàn)簡易、經(jīng)濟(jì)，特異性高，常見于粘病毒及乙型腦炎病毒感染輔助診療及流行病學(xué)調(diào)查，也可判定病毒型與亞型。病毒感染診斷與防治第21頁病毒+雞RBC=凝集（血凝試驗(yàn)）病毒+特異性抗體+雞RBC=不凝集（血凝抑制試驗(yàn)）病毒感染診斷與防治第22頁四、病毒感染快速診療

快速診療主要是指從含有病毒標(biāo)本及感染機(jī)體血清中檢測(cè)病毒顆粒、蛋白抗原、IgM抗體和核酸等，往往在數(shù)小時(shí)內(nèi)即可得出結(jié)果。病毒感染診斷與防治第23頁(一)形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)1.電鏡和免疫電鏡檢驗(yàn)2.普通光學(xué)顯微鏡檢驗(yàn)有些病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)增殖后，在細(xì)胞一定部位(胞核、胞漿或二者兼有)出現(xiàn)一個(gè)或數(shù)個(gè)、圓形或橢圓形、嗜酸性或嗜堿性結(jié)構(gòu)，即包涵體。包涵體對(duì)病毒感染診療有一定價(jià)值。病毒感染診斷與防治第24頁(二)病毒蛋白抗原檢驗(yàn)

用熒光素、放射性同位素、過氧化物酶等標(biāo)識(shí)抗體，采取免疫學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)，檢測(cè)標(biāo)本中病毒蛋白抗原，含有敏感、特異、快速等優(yōu)點(diǎn)。1.免疫熒光技術(shù)(immunofluorescence,IF)2.固相放射免疫測(cè)定(solid-phaseradioimmunoassay,SPRIA)3.酶免疫技術(shù)(enzymeimmunoassay,EIA)此法可檢測(cè)各種病毒及其抗體，主要是酶免疫組化法和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法(ELISA)。病毒感染診斷與防治第25頁(三)特異性IgM抗體檢測(cè)

檢測(cè)病毒特異性IgM抗體可診療急性感染，尤其是對(duì)證實(shí)孕婦感染風(fēng)疹病毒尤為主要，但應(yīng)注意類風(fēng)濕因子(IgM)干擾。另外，檢測(cè)早期抗原抗體是快速診療另一路徑。如檢測(cè)針對(duì)EBV早期抗原(EA)、關(guān)鍵抗原(EANA)和衣殼抗原(VCA)等抗體，能夠區(qū)分急性或慢性EBV感染。另外，分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)、氣相色譜技術(shù)等，均可用來分析和判定病毒感染。病毒感染診斷與防治第26頁(四)檢測(cè)病毒核酸

1.核酸雜交技術(shù)用于病毒檢測(cè)有斑點(diǎn)雜交、細(xì)胞內(nèi)原位雜交、DNA印跡雜交、RNA印跡雜交等。2.核酸擴(kuò)增法當(dāng)前多數(shù)病毒基因已經(jīng)過分子克隆技術(shù)被明確了核苷酸序列，使得DNA擴(kuò)增技術(shù)逐步發(fā)展為常規(guī)診療技術(shù)之一。3.基因芯片技術(shù)病毒感染診斷與防治第27頁基因芯片又稱DNA芯片、生物芯片（biochip）。其原理是：將已知生物分子探針或基因探針，大規(guī)?；蛴行蚺挪加谛K硅片等載體上，與待測(cè)樣品中生物分子或基因序列相互作用和并行反應(yīng)，在激光激發(fā)下，產(chǎn)生熒光譜信號(hào)被接收器搜集，計(jì)算機(jī)自動(dòng)分析處理數(shù)據(jù)并匯報(bào)結(jié)果。其優(yōu)點(diǎn)是：能夠一次性完成大量樣品DNA序列檢測(cè)和分析，處理了傳統(tǒng)核酸雜交技術(shù)許多不足。芯片技術(shù)在病毒等微生物學(xué)診療和流行病學(xué)調(diào)查方面有著遼闊應(yīng)用前景。病毒感染診斷與防治第28頁第二節(jié)病毒感染預(yù)防一、人工自動(dòng)免疫(一)活疫苗(attenuatedvaccine,orlivingvaccine)1.常規(guī)活疫苗即減毒活疫苗(attenuatedvaccine)，通常是用自然或人工選擇法(如溫度敏感株)篩選對(duì)人低毒或無毒變異株制成疫苗，如脊髓灰質(zhì)炎、流感、麻疹減毒活疫苗等。病毒感染診斷與防治第29頁2.新型活疫苗應(yīng)用基因工程技術(shù)，控制病毒變異，或利用DNA重組技術(shù)，插入和定向缺失病毒基因，將保護(hù)性病毒蛋白編碼基因插入活載體中或選擇性地去除病毒某一個(gè)或幾個(gè)致病基因而到達(dá)減毒作用制備可在機(jī)體內(nèi)增殖，誘發(fā)抗病毒免疫應(yīng)答疫苗。病毒感染診斷與防治第30頁(二)死疫苗(killedvaccine)1.滅活全病毒疫苗應(yīng)用物理或化學(xué)方法使病毒完全滅活而制成疫苗。常見有乙型腦炎、狂犬病、流感等滅活疫苗。2.亞單位疫苗(subunitvaccine)制備不含有病毒核酸、僅含有能誘發(fā)中和抗體病毒衣殼蛋白或包膜表面抗原，是最理想疫苗。3.合成肽病毒疫苗(synthesizedpeptideviralvaccine)人工合成與病毒保護(hù)性抗原決定簇氨基酸序列相同肽段，制備成免疫原后免疫動(dòng)物或人體，使機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體病毒感染診斷與防治第31頁4.基因工程疫苗(geneengineringvaccine)利用基因工程技術(shù)，分離、重組、轉(zhuǎn)化和表示基因，制備出能引發(fā)人體保護(hù)性免疫應(yīng)答疫苗。5.DNA疫苗又稱基因疫苗或核酸疫苗，這種核酸分子是一個(gè)細(xì)菌質(zhì)粒，在克隆了特異性基因以后，能在真核細(xì)胞中表示蛋白質(zhì)抗原，刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性體液和細(xì)胞免疫。6.新型多價(jià)聯(lián)合疫苗、口服疫苗研究病毒感染診斷與防治第32頁減毒活疫苗與死疫苗優(yōu)缺點(diǎn)比較特點(diǎn)減毒活疫苗死疫苗制備方法經(jīng)過非正常培養(yǎng)減毒株經(jīng)過化學(xué)物理方法使感染失活免疫接種普通為一次性屢次免疫疫苗穩(wěn)定性相對(duì)不穩(wěn)定相對(duì)穩(wěn)定免疫類型體液免疫和細(xì)胞免疫體液免疫毒力回升有可能不可能安全性對(duì)免疫缺點(diǎn)者有危險(xiǎn)安全性好生產(chǎn)和成本生產(chǎn)較復(fù)雜、成本高生產(chǎn)簡單、成本低病毒感染診斷與防治第33頁二、人工被動(dòng)免疫人工被動(dòng)免疫制劑有免疫血清和丙種球蛋白，或與細(xì)胞免疫相關(guān)因子等。大多數(shù)人均受過不一樣種類病毒感染，從正常血清中提取免疫球蛋白可用于緊急預(yù)防。常注射人免疫球蛋白預(yù)防甲型肝炎、麻疹、脊髓灰質(zhì)炎等。可使接觸病原者不出現(xiàn)癥狀或僅出現(xiàn)輕微癥狀。多年來有些人應(yīng)用含有高滴度抗HBs乙肝免疫球蛋白Ig)預(yù)防乙型肝炎有一定效果。在使用免疫球蛋白時(shí)因其半衰期短，故應(yīng)注意使用期。病毒感染診斷與防治第34頁第三節(jié)病毒感染治療一、抗病化學(xué)制劑（一）核苷類藥品核苷類藥品作用機(jī)制有主要是抑制病毒基因復(fù)制①模擬核苷成份摻入病毒基因組：合成異常嘧啶取代病毒DNA前體胸腺嘧啶，病毒在復(fù)制過程中，這種異常嘧啶分子摻入子代DNA中使子代病毒結(jié)構(gòu)基因合成和表示無法進(jìn)行，從而抑制病毒復(fù)制，或復(fù)制出病毒為缺點(diǎn)病毒。②競(jìng)爭(zhēng)病毒復(fù)制酶病毒感染診斷與防治第35頁1.無環(huán)鳥苷(acyclovir,ACV，阿昔洛韋)和丙氧鳥苷（ganciclovirGCV，庚昔洛韋）為鳥嘌呤或脫氧鳥嘌呤核苷類似物。該藥細(xì)胞毒性很小，是當(dāng)前最有效抗皰疹病毒藥品之一。廣泛用于皰疹病毒感染引發(fā)單純皰疹、生殖器皰疹及帶狀皰疹。病毒感染診斷與防治第36頁2.疊氮胸苷(azidothymidine,AZT)胸腺嘧啶核苷類似物，經(jīng)過阻斷前病毒DNA合成而抑制HIV復(fù)制，AZT對(duì)病毒逆轉(zhuǎn)錄酶抑制比對(duì)細(xì)胞DNA多聚酶敏感100倍以上。能夠有效地降低AIDS發(fā)病率與病死率。耐藥株出現(xiàn)系由基因突變?cè)斐赡孓D(zhuǎn)錄酶含有耐藥性。因有抑制骨髓作用和形成病毒耐藥而面臨被淘汰。病毒感染診斷與防治第37頁3.病毒唑?qū)Ω鞣NRNA和DNA病毒復(fù)制都有抑制作用，但主要用于RNA病毒感染治療，對(duì)細(xì)胞核酸也有抑制作用。當(dāng)前臨床主要用于流感病毒和呼吸道合胞病毒治療。病毒感染診斷與防治第38頁（二）病毒基因轉(zhuǎn)錄抑制劑這類核苷衍生物模擬天然二脫氧核苷底物，經(jīng)一系列磷酸化成為5’-三磷酸后，作為相同底物競(jìng)爭(zhēng)性抑制病毒逆轉(zhuǎn)錄酶活性。被磷酸化藥品分子與核苷酸分子相同，在RNA模板合成DNA過程中被嵌入DNA中。此DNA再轉(zhuǎn)錄時(shí)，因?yàn)槠渲兴幤贩肿硬皇钦：塑账?，因而轉(zhuǎn)錄酶不能識(shí)別，從而使轉(zhuǎn)錄受阻。病毒感染診斷與防治第39頁（三）非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑①nevirapine第1個(gè)新合成非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑。1996年獲準(zhǔn)用于治療HIV，耐藥株已出現(xiàn)，故提議與其它藥聯(lián)合使用；②pyridone作用類似nevirapine.病毒感染診斷與防治第40頁（四）蛋白酶抑制劑1．賽科納瓦(saquinavir)1995年同意第1個(gè)蛋白酶抑制劑。2．英迪納瓦（indinavir）、瑞托納瓦（ritonavir）是1996年同意新一代蛋白酶抑制劑，用于HIV。病毒感染診斷與防治第41頁（五）其它抗病毒藥品1.金剛烷胺和甲基金剛烷胺金剛烷胺為合成胺類，甲基金剛烷胺是其衍生物，二者有相同抗病毒譜和副作用，能阻止脫殼，主要用于治療甲型流感。2.甲酸磷霉素?zé)o機(jī)焦磷酸鹽有機(jī)類似物，抑制各種皰疹病毒，包含CMV、HSV、VZV、EBV、HHV6，可能還對(duì)HBV和逆轉(zhuǎn)錄病毒有作用。選擇性抑制病毒DNA多聚酶和逆轉(zhuǎn)錄酶，而對(duì)宿主細(xì)胞無影響。病毒感染診斷與防治第42頁二、干擾素和干擾素誘生劑應(yīng)用1.干擾素(IFN)含有廣譜抗病毒作用，毒性小，使用同種IFN無抗原性，主要用于甲、乙、丙型肝炎，HSV，乳頭瘤病毒和鼻病毒等感染