微生物發(fā)酵產(chǎn)酶課件

第二章微生物發(fā)酵產(chǎn)酶重點(diǎn)：微生物細(xì)胞中酶生物合成的調(diào)節(jié)，酶生物合成的模式，酶發(fā)酵生產(chǎn)的工藝條件及其控制，提高酶產(chǎn)率的措施，固定化微生物發(fā)酵產(chǎn)酶。

微生物發(fā)酵產(chǎn)酶

是指在人工控制的條件下，有目的地利用微生物培養(yǎng)來生產(chǎn)所需的酶，其技術(shù)包括培養(yǎng)基和發(fā)酵方式的選擇，以及發(fā)酵條件的控制管理等方面的內(nèi)容。微生物發(fā)酵產(chǎn)酶的工藝流程產(chǎn)酶菌種的篩選

含菌樣品的采集,菌種分離,產(chǎn)酶性能測(cè)定及復(fù)篩等全過程。微生物酶的類型

1.胞外酶：細(xì)胞內(nèi)合成而在細(xì)胞外起作用的酶。包括位于細(xì)胞外表面或細(xì)胞外質(zhì)空間的酶，也指釋放入培養(yǎng)基的酶。大多是水解酶（如淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶、果膠酶），是微生物為了利用環(huán)境中的大分子而釋放到細(xì)胞外的。2.胞內(nèi)酶：指合成后仍留在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用的酶，這些酶在細(xì)胞內(nèi)常與顆粒體結(jié)合并有著一定的分布。如線粒體上分布著三羧酸循環(huán)酶系和氧化磷酸化酶系，而蛋白質(zhì)合成的酶系則分布在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的核糖體上。

酶的發(fā)酵生產(chǎn)方式

①固體培養(yǎng)發(fā)酵:把菌種接入固體培養(yǎng)基中,保溫?cái)?shù)天,用水或緩沖液浸泡培養(yǎng)基,將酶抽提,測(cè)定酶活力,這種方法主要適用于霉菌.

適合于傳統(tǒng)發(fā)酵工藝及鄉(xiāng)鎮(zhèn)企業(yè)用來生產(chǎn)比較簡(jiǎn)單的產(chǎn)品。液體深層發(fā)酵優(yōu)點(diǎn)①液體懸浮狀態(tài)是很多微生物的最適生長(zhǎng)條件②在液體中菌體、營(yíng)養(yǎng)物、產(chǎn)物易于擴(kuò)散，便于控制③液體輸送方便，易于機(jī)械化操作④占地面積小，生產(chǎn)效率高，易進(jìn)行自動(dòng)化控制⑤產(chǎn)品易于提取和精制等③固定化微生物細(xì)胞發(fā)酵和固定化微生物原生質(zhì)體發(fā)酵前者是20世紀(jì)70年代后期，在固定化酶的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的發(fā)酵技術(shù)。是固定在水不溶性的載體上，在一定的空間范圍內(nèi)進(jìn)行生命活動(dòng)的細(xì)胞。后者是20世紀(jì)80年代中期發(fā)展起來的技術(shù)。是固定在載體上，在一定的空間范圍內(nèi)進(jìn)行生命活動(dòng)的原生質(zhì)體。固定化酶的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)多次使用可以連續(xù)反應(yīng)純化簡(jiǎn)單提高產(chǎn)物質(zhì)量應(yīng)用范圍廣第一節(jié)酶生物合成的基本理論

提取分離法微生物細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶酶的生產(chǎn)方法生物合成法

植物細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶化學(xué)合成法動(dòng)物細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶

一、酶的生物合成

遺傳信息傳遞的中心法則

蛋白質(zhì)翻譯轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制復(fù)制DNARNA

（一）RNA的生物合成--轉(zhuǎn)錄(transcription)

定義以DNA為模板，以核苷三磷酸為底物，在RNA聚合酶（轉(zhuǎn)錄酶）的作用下，生成RNA分子的過程。TCGAGTACAGCTCATGCGAGUACGCAURNA聚合酶有意義鏈反意義鏈RNAPPi5’5’3’GTPUTPCTPATPUTPRNA在DNA模板上的生物合成3’3’5’RNA的轉(zhuǎn)錄過程(三步)1.起始2.延長(zhǎng)3.終止

原核生物的RNA聚合酶(DDRP)

E.coli的RNA聚合酶是由四種亞基組成的五聚體（2）

起始因子RNA鏈的延伸圖解3′5′RNA-DNA雜交螺旋聚合酶的移動(dòng)方向新生RNA復(fù)鏈解鏈有義鏈模板鏈（反義鏈）延長(zhǎng)部位啟動(dòng)子：在DNA分子上，RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的核苷酸序列，即轉(zhuǎn)錄作用起始的部位。終止子：DNA上的一段核苷酸序列，給RNA聚合酶提供終止轉(zhuǎn)錄的信號(hào)，也稱終止序列。操縱子：轉(zhuǎn)錄的功能單位。（調(diào)控系統(tǒng)和結(jié)構(gòu)基因的綜合）。（3）SD區(qū)：在起始密碼子ATG上游約10bp處，有一個(gè)富含嘌呤的保守序列，其與16SrRNA3′端序列互補(bǔ)。SD序列：5′AGGAGGU3′3′UCCUCCA5′16SrRNA（4）轉(zhuǎn)錄終止子和終止因子轉(zhuǎn)錄終止子：一個(gè)基因或一個(gè)操縱子3′端，提供轉(zhuǎn)錄停止信號(hào)的DNA核苷酸序列。終止因子：協(xié)助mRNA聚合酶識(shí)別終止信號(hào)的輔助因子的蛋白。A.-independent真核生物基因組成（1）基因區(qū)：（2）轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)區(qū)：mRNArDNAmDNAtDNArRNAtRNARNApoLIRNApoLIIIRNApoLIIaa3′5′構(gòu)成核糖體NmRNAproteinP1P3P2DNA（3）轉(zhuǎn)錄終止子：對(duì)真核生物轉(zhuǎn)錄的終止子信號(hào)和終止過程了解甚少。但在高等真核生物的細(xì)胞中，mRNA在靠近3′端區(qū)有一段非常保守的序列AAUAAA，這一序列為鏈的切斷和poly(A)化提供了某些終止信號(hào)。

定義以mRNA為模板，以氨基酸為底物，在核糖體上通過各種tRNA、酶和輔助因子的作用，合成多肽鏈的過程。（二）蛋白質(zhì)的生物合成--翻譯(translation)

酪5’5’3’AUGGUUUACACA酪氨酰-tRNA反密碼mRNA密碼與反密碼的堿基配對(duì)AUGACA5’蛋蘇UGUGUU3’受位(A位)給位(P位)大亞基小亞基原核生物真核生物核蛋白體小亞基大亞基核蛋白體小亞基大亞基S70S30S50S80S40S60SrRNA16S-rRNA5S-rRNA23S-rRNA18S-rRNA28S-rRNA5S-rRNA5.8S-rRNA蛋白質(zhì)rpS21種rpL36種rpS33種rpL49種

不同細(xì)胞核糖體的組成核蛋白體的組成

小亞基貌似一個(gè)動(dòng)物胚胎，由頭部、基部和平臺(tái)組成，平臺(tái)與頭部之間有一個(gè)裂隙；大亞基很像一個(gè)沙發(fā)，有一個(gè)柄、一個(gè)中央凸出部和一個(gè)脊；二者組裝成核糖體時(shí)，小亞基頭部與大亞基凸出部之間形成一個(gè)隧道，在蛋白質(zhì)合成中mRNA很可能從這里通過。大腸桿菌核糖體三維結(jié)構(gòu)模型

蛋白質(zhì)的合成過程

（大腸桿菌）

氨基酸的活化肽鏈合成的起始肽鏈的延伸肽鏈合成的終止與釋放氨基酸的活化與轉(zhuǎn)運(yùn)反應(yīng)式：AA+tRNA+ATP氨酰-tRNA合成酶氨酰-tRNA+AMP+PPi

對(duì)于E.coli而言，肽鏈合成時(shí)的第一個(gè)氨基酸都是甲酰甲硫氨酸（fMet）。在核糖體上合成多肽（三階段）1、起始階段2、延伸階段3、終止階段肽鏈合成的起始階段1.mRNA與小亞基結(jié)合：形成30S-mRNA-IF3復(fù)合物2.AUG與蛋氨酰-tRNA結(jié)合：

30S-mRNA-IF3

fMet-tRNA-IF2-GTPfMet-tRNA正好位于mRNA的起始密碼子上（AUG）。3.大小亞基結(jié)合IF130S起始復(fù)合物AUGACA5’3’AUGACA5’3’UACUACAUGACA5’3’小亞基mRNA蛋氨酰tRNAGTP大亞基GDP+Pi受位給位蛋蛋肽鏈合成的起始階段肽鏈合成的延伸階段1.進(jìn)位:氨基酰-tRNA進(jìn)入受位;2.轉(zhuǎn)肽:形成肽鍵,在轉(zhuǎn)肽酶作用下,給位與受位結(jié)合;3.移位:核蛋白體向3’端移動(dòng)一個(gè)密碼子的位置,空出受位,不斷地進(jìn)位、轉(zhuǎn)肽、移位,使肽鏈延長(zhǎng)。AUGACA5’3’UAC蛋蘇UGUAUGACA5’UAC蛋蘇UGUGUUAUGACA5’UAC蛋蘇UGUGUUAUGACA5’蛋蘇UGUGUU3’3’3’GTPGDP+PiGDP+PiGTP起始復(fù)合體進(jìn)位轉(zhuǎn)肽移位Mg+K+肽鏈合成的終止階段1.出現(xiàn)終止密碼并與終止因子結(jié)合;2.肽鍵水解,多肽釋放;3.tRNA,mRNA,大小亞基解離.

AUGUAA5’UACAUGUAA5’UAC3’3’終終AUGUAA5’UAC3’終5’3’UAC終肽鏈二、酶生物合成的調(diào)節(jié)定義：通過調(diào)節(jié)酶合成的量來控制微生物代謝速度的調(diào)節(jié)機(jī)制，是在基因轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行的。意義：通過阻止酶的過量合成，節(jié)約生物合成的原料和能量。

操縱子——基因表達(dá)的協(xié)同單位操縱子結(jié)構(gòu)基因（編碼蛋白質(zhì),structuralgene,S）控制部位操縱基因（operatorgene,O）啟動(dòng)子（promotorgene,P）（一）基因調(diào)控理論

JacobandMonod的操縱子學(xué)說（operontheory）

調(diào)節(jié)基因(regulatorgene)：

可產(chǎn)生一種組成型調(diào)節(jié)蛋白(regulatoryprotein)

，通過與效應(yīng)物(effector)

（包括誘導(dǎo)物或輔阻遏物）的特異結(jié)合而發(fā)生變構(gòu)作用，從而改變它與操縱基因的結(jié)合力。調(diào)節(jié)基因常位于調(diào)控區(qū)的上游。基因操縱子調(diào)節(jié)系統(tǒng)示意圖

調(diào)節(jié)基因

啟動(dòng)基因操縱基因結(jié)構(gòu)基因

DNA

轉(zhuǎn)錄

（-）

RNA聚合酶（+）轉(zhuǎn)錄

翻譯

mRNA

翻譯

阻遏蛋白

蛋白質(zhì)

誘導(dǎo)劑

控制區(qū)信息區(qū)操縱子cAMP-CRP復(fù)合物的作用示意圖

啟動(dòng)基因（promotorgene）（啟動(dòng)子）：有兩個(gè)位點(diǎn)：

（1）RNA聚合酶的結(jié)合位點(diǎn)（2）cAMP-CAP的結(jié)合位點(diǎn)。CAP：分解代謝產(chǎn)物基因活化蛋白（catabolitegeneactivatorprotein），又稱環(huán)腺苷酸受體蛋白(cAMPreceptorprotein，CRP）。只有cAMP-CRP復(fù)合物結(jié)合到啟動(dòng)子的位點(diǎn)上，RNA聚合酶才能結(jié)合到其在啟動(dòng)子的位點(diǎn)上，酶的合成才能開始。操縱基因（Operatergene）:

位于啟動(dòng)基因和結(jié)構(gòu)基因之間的一段堿基順序，能特異性地與調(diào)節(jié)基因產(chǎn)生的變構(gòu)蛋白結(jié)合，操縱酶合成的時(shí)機(jī)與速度。結(jié)構(gòu)基因（Structuralgene）:

決定某一多肽的DNA模板，與酶有各自的對(duì)應(yīng)關(guān)系，其中的遺傳信息可轉(zhuǎn)錄為mRNA，再翻譯為蛋白質(zhì)。(二)酶合成調(diào)節(jié)的類型

1.誘導(dǎo)

(induction)

組成酶：細(xì)胞固有的酶類。誘導(dǎo)酶：是細(xì)胞為適應(yīng)外來底物或其結(jié)構(gòu)類似物而臨時(shí)合成的一類酶。

2.阻遏

(repression)

分解代謝物阻遏(cataboliterepression)

反饋?zhàn)瓒?feedbackrepression)（三）酶合成的調(diào)節(jié)機(jī)制

1.酶合成的誘導(dǎo)加進(jìn)某種物質(zhì)，使酶生物合成開始或加速進(jìn)行。酶合成誘導(dǎo)的現(xiàn)象：已知分解利用乳糖的酶有：

-半乳糖苷酶；透過酶；硫代半乳糖苷轉(zhuǎn)乙酰酶。實(shí)驗(yàn)：（1）大腸桿菌生長(zhǎng)在葡萄糖培養(yǎng)基上時(shí)，細(xì)胞內(nèi)無上述三種酶合成；（2）大腸桿菌生長(zhǎng)在乳糖培養(yǎng)基上時(shí)，細(xì)胞內(nèi)有上述三種酶合成；表明菌體生物合成的經(jīng)濟(jì)原則：需要時(shí)才合成。調(diào)節(jié)基因操縱基因乳糖結(jié)構(gòu)基因PLacZLacYLacamRNA

阻遏蛋白（有活性）基因關(guān)閉啟動(dòng)子ORPLacZLacYLaca調(diào)節(jié)基因操縱基因乳糖結(jié)構(gòu)基因啟動(dòng)子ORmRNAZmRNAYmRNAa

阻遏蛋白（無活性）基因表達(dá)mRNAA、乳糖操縱子的結(jié)構(gòu)

B、乳糖酶的誘導(dǎo)

乳糖

阻遏蛋白（有活性）2.末端產(chǎn)物阻遏

由某代謝途徑末端產(chǎn)物的過量累積引起的阻遏。

酶合成阻遏的現(xiàn)象：

實(shí)驗(yàn)：

（1）大腸桿菌生長(zhǎng)在無機(jī)鹽和葡萄糖的培養(yǎng)基上時(shí)，檢測(cè)到細(xì)胞內(nèi)有色氨酸合成酶的存在；

（2）在上述培養(yǎng)基中加入色氨酸，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)色氨酸合成酶的活性降低，直至消失。

表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，體現(xiàn)了菌體生長(zhǎng)的經(jīng)濟(jì)原則:不需要就不合成。

色氨酸操縱子——酶的阻遏調(diào)節(jié)基因操縱基因結(jié)構(gòu)基因mRNA酶蛋白阻遏蛋白不能與操縱基因結(jié)合，結(jié)構(gòu)基因表達(dá)調(diào)節(jié)基因操縱基因結(jié)構(gòu)基因輔阻遏物代謝產(chǎn)物與阻遏蛋白結(jié)合，使之構(gòu)象發(fā)生變化與操縱基因結(jié)合，結(jié)構(gòu)基因不能表達(dá)酶的誘導(dǎo)和阻遏操縱子模型B.有活性阻遏蛋白加誘導(dǎo)劑A.有活性阻遏蛋白C.無活性阻遏蛋白D.無活性阻遏蛋白加輔阻遏劑操縱基因啟動(dòng)基因調(diào)節(jié)基因結(jié)構(gòu)基因

阻遏蛋白(有活性)阻遏蛋白阻擋操縱基因結(jié)構(gòu)基因不表達(dá)誘導(dǎo)物誘導(dǎo)物與阻遏蛋白結(jié)合,使阻遏蛋白不能起到阻擋操縱基因的作用,結(jié)構(gòu)基因可以表達(dá)酶蛋白mRNA阻遏蛋白不能跟操縱基因結(jié)合,結(jié)構(gòu)基因可以表達(dá)阻遏蛋白(無活性)酶蛋白mRNA代謝產(chǎn)物與阻遏蛋白結(jié)合,從而使阻遏蛋白能夠阻擋操縱基因,結(jié)構(gòu)基因不表達(dá)代謝產(chǎn)物調(diào)控方式阻遏蛋白添加物與操縱基因結(jié)合阻遏效應(yīng)舉例酶的誘導(dǎo)有活性－＋不轉(zhuǎn)錄，繼而不翻譯誘導(dǎo)物－轉(zhuǎn)錄，繼而翻譯乳糖操縱子酶的阻遏無活性－阻遏物＋不轉(zhuǎn)錄，繼而不翻譯色氨酸操縱子酶合成的誘導(dǎo)與阻遏操縱子模型調(diào)控作用對(duì)比3.分解代謝物阻遏指細(xì)胞內(nèi)同時(shí)有兩種分解底物（碳源或氮源）存在時(shí)，利用快的那種分解底物會(huì)阻遏利用慢的底物的有關(guān)酶合成的現(xiàn)象。分解代謝物的阻遏作用，并非由于快速利用的甲碳源本身直接作用的結(jié)果，而是通過甲碳源（或氮源等）在其分解過程中所產(chǎn)生的中間代謝物所引起的阻遏作用。分解代謝物阻遏現(xiàn)象：

實(shí)驗(yàn)：細(xì)菌在含有葡萄糖和乳糖的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，優(yōu)先利用葡萄糖。待葡萄糖耗盡后才開始利用乳糖，產(chǎn)生了兩個(gè)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中間隔開一個(gè)生長(zhǎng)延滯期的“二次生長(zhǎng)現(xiàn)象”(diauxie或biphasicgrowth）。

這一現(xiàn)象又稱葡萄糖效應(yīng)，產(chǎn)生的原因是由于葡萄糖降解物阻遏了分解乳糖酶系的合成。此調(diào)節(jié)基因的產(chǎn)物是環(huán)腺苷酸受體蛋白（CRP）,亦稱降解物基因活化蛋白（CAP）。分解代謝物阻遏RLacZLacYLacamRNAmRNAZmRNAYmRNAa基因表達(dá)CAP基因結(jié)構(gòu)基因TCAPOCAP結(jié)合部位RNA聚合酶TcAMP-CAPP葡萄糖分解代謝產(chǎn)物腺苷酸環(huán)化酶磷酸二酯酶ATPcAMP5'-AMP抑制激活葡萄糖降解物與cAMP的關(guān)系cAMPCAP：降解物基因活化蛋白（catabolicgeneactivationprotein）降低cAMP濃度使CAP呈失活狀態(tài)真核生物酶生物合成的調(diào)節(jié)細(xì)胞分化改變酶的生物合成基因擴(kuò)增加速酶的生物合成增強(qiáng)子促進(jìn)酶的生物合成抗原誘導(dǎo)抗體酶的生物合成

10月4日，在瑞典首都斯德哥爾摩的卡羅林斯卡醫(yī)學(xué)院，諾貝爾獎(jiǎng)評(píng)審委員會(huì)宣布，英國(guó)生理學(xué)家羅伯特·愛德華茲獲得2010年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。今年８５歲的愛德華茲因創(chuàng)立體外受精技術(shù)而獲得這一獎(jiǎng)項(xiàng)。愛德華茲現(xiàn)在是英國(guó)劍橋大學(xué)的名譽(yù)教授。

體外受精技術(shù)俗稱試管嬰兒技術(shù)。醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)顯示，世界上每十對(duì)夫婦中就有一對(duì)有生育問題，而試管嬰兒技術(shù)可以幫助其中絕大多數(shù)夫婦實(shí)現(xiàn)有自己后代的夢(mèng)想。自１９７８年第一個(gè)試管嬰兒路易絲·布朗呱呱墜地，全球已有４００萬人通過試管嬰兒技術(shù)出生，其中許多人通過自然受精方式生育了下一代。試管嬰兒之父愛德華茲

北京時(shí)間10月5日下午17時(shí)30分，2009年度諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)在瑞典卡羅林斯卡醫(yī)學(xué)院揭曉，三位美國(guó)科學(xué)家共同獲得該獎(jiǎng)項(xiàng)。發(fā)現(xiàn)了端粒和端粒酶保護(hù)染色體的機(jī)理杰克－紹斯塔克

（JackW.Szostak）

卡羅爾－格雷德

（CarolW.Greider）

伊麗莎白－布賴克本

（ElizabethH.Blackburn）

08/10/6，瑞典，“諾貝爾路１號(hào)”的卡羅林斯卡醫(yī)學(xué)院“諾貝爾論壇樓”內(nèi)舉行，諾貝爾獎(jiǎng)評(píng)審委員會(huì)成員走上講臺(tái)，宣布了08年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)得主。

德國(guó)哈拉爾德·楚爾·豪森HaraldzurHausen法國(guó)巴爾-西諾西Fran?oiseBarré-Sinoussi法國(guó)呂克-蒙塔尼LucMontagnier他們分別在宮頸癌致病因子和艾滋病病毒研究上有突出成就

（德國(guó)科學(xué)家因發(fā)現(xiàn)人乳突淋瘤病毒引發(fā)子宮頸癌獲此殊榮，兩名法國(guó)科學(xué)家因發(fā)現(xiàn)人類免疫缺陷病毒獲此殊榮。）諾貝爾獎(jiǎng)?wù)筋C獎(jiǎng)典禮每年12月10日在諾貝爾逝世紀(jì)念日這一天分別在瑞典首都斯德哥爾摩和挪威首都奧斯陸舉行。本年度諾貝爾獎(jiǎng)各獎(jiǎng)項(xiàng)得主將獨(dú)享或分享總額為１０００萬瑞典克朗（約合１４０萬美元）的獎(jiǎng)金。07/10/8，瑞典，諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)組委會(huì)及評(píng)審委員會(huì)秘書漢斯·約納沃博士宣布2007年諾獎(jiǎng)醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)得主馬里奧·卡佩奇（美國(guó)）馬丁·埃文斯（英國(guó)）奧利弗·史密斯（美國(guó)）他們?cè)诟脑旎铙w內(nèi)特定基因的“基因靶向”

技術(shù)等方面做出了奠基性貢獻(xiàn)?；虬邢蚣夹g(shù)是指利用細(xì)胞脫氧核糖核酸(DNA)可與外源DNA同源序列發(fā)生同源重組的性質(zhì)，定向改造生物某一基因的技術(shù)。它可用于有針對(duì)性地尋找某些遺傳性疾病的療法。第二節(jié)常用的產(chǎn)酶微生物

一、用于酶的生產(chǎn)的細(xì)胞必須具備以下幾個(gè)條件：

a產(chǎn)酶量高

b容易培養(yǎng)和管理

c產(chǎn)酶穩(wěn)定性好

d利于酶的分離純化

e安全可靠、無毒性二、常用的微生物細(xì)菌放線菌酵母菌霉菌農(nóng)田上層15cm處微生物的數(shù)量微生物 每克土壤中的數(shù)量細(xì)菌 9.8×107放線菌 2.0×106真菌 1.2×105藻菌 2.5×104原生動(dòng)物 3.0×104菌落數(shù)與空氣清潔度的關(guān)系空氣清潔度 菌落數(shù)最清潔的空氣 1-2潔凈空氣 30個(gè)以下普通空氣 30-150輕度污染空氣 300以下嚴(yán)重污染空氣 301以上人體微生態(tài)中微生物的含量部位 含量 部位 含量眼睛 1g 肺 20g鼻腔 10g 腸道 1000g口腔 20g 生殖道 20g皮膚 200g 總量 1271g人體消化系統(tǒng)中微生物群體(個(gè)/g)

回腸 結(jié)腸 直腸或糞便雙歧桿菌 104 107 1010擬桿菌 103 108 1010腸桿菌 103 106 106腸球菌 － 107

－乳桿菌 － － 104細(xì)菌的結(jié)構(gòu)細(xì)菌的繁殖：細(xì)菌主要是以二分裂的方式進(jìn)行繁殖細(xì)菌的菌落定義：?jiǎn)蝹€(gè)或者少數(shù)細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上大量繁殖時(shí)，會(huì)形成一個(gè)肉眼可見的、具有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞群體。特征：大小、形狀、光澤度、顏色、硬度、透明度等。功能：每種細(xì)菌在一定條件下所形成的菌落可以作為菌種鑒定的重要依據(jù)。大腸桿菌枯草桿菌放線菌菌落及形態(tài)氣生菌絲孢子絲孢子基內(nèi)菌絲培養(yǎng)基放線菌的結(jié)構(gòu)放線菌的分布放線菌在自然界分布很廣，在土壤、堆肥和湖底、河底的淤泥等處，尤其在土壤中種類和數(shù)量很多。放線菌的繁殖主要通過形成無性抱子形式進(jìn)行無性繁殖，成熟的生孢子或孢囊孢子在適宜環(huán)境里發(fā)芽形成新的菌絲體。鏈霉菌酵母菌主要分布于含糖質(zhì)較多偏酸性環(huán)境中，如水果、蔬菜、花蜜和植物葉片上，果園土壤中，石油酵母多分布在油田周圍的土壤中。多數(shù)為腐生，常以單個(gè)細(xì)胞存在，以發(fā)芽形式進(jìn)行繁殖。啤酒酵母菌霉菌分布很廣土壤、空氣、水和生物體內(nèi)大量存在偏酸性環(huán)境中多數(shù)以無性孢子繁殖為主。米曲霉木霉青霉紅曲霉毛霉根霉擔(dān)子菌及藻類菌種的來源根據(jù)需要直接從有關(guān)科研單位、高等院校、工廠或菌種保藏部門購(gòu)買；從大自然中分離篩選新的微生物菌種。新菌種分離與篩選的步驟定方案：先要查閱資料了解所需菌種的生長(zhǎng)培養(yǎng)特性采樣：有針對(duì)性地采集樣品增殖：通過控制養(yǎng)分或培養(yǎng)條件，使所需菌種增殖培養(yǎng)分離：利用分離技術(shù)得到純種發(fā)酵性能測(cè)定：進(jìn)行生產(chǎn)性能測(cè)定采樣對(duì)象一般園田土和耕作過的沼澤土中，以細(xì)菌和放線菌為主，富含碳水化合物的土壤和沼澤地中，酵母和霉菌較多，采樣的對(duì)象也可以是植物，腐敗物品，某些水域等。從自然界篩選采樣季節(jié)：以溫度適中，雨量不多的秋初為好。采土方式：在選好適當(dāng)?shù)攸c(diǎn)后，取離地面5-15cm處的土約10g，盛入清潔的牛皮紙袋或塑料袋中，扎好，標(biāo)記。記錄采樣時(shí)間、地點(diǎn)、環(huán)境條件等。增殖培養(yǎng)為了容易分離到所需的菌種，讓無關(guān)的微生物至少是在數(shù)量上不要增加，可以通過配制選擇性培養(yǎng)基，選擇一定的培養(yǎng)條件來控制。培養(yǎng)分離盡管通過增殖培養(yǎng)效果顯著，但還是處于微生物的混雜生長(zhǎng)狀態(tài)。因此還必須分離，純化。純種分離的方法有劃線分離法、稀釋分離法。

篩選采用與生產(chǎn)相近的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，通過三角瓶的容量進(jìn)行小型發(fā)酵試驗(yàn)，以求得適合于工業(yè)生產(chǎn)用菌種。毒性試驗(yàn)據(jù)國(guó)家規(guī)定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草桿菌無須做毒性試驗(yàn)外，其他微生物均需通過兩年以上的毒性試驗(yàn)。從自然界分離的菌種產(chǎn)品基因工程誘變育種誘變育種生產(chǎn)用菌種擴(kuò)大培養(yǎng)原料微生物菌體代謝產(chǎn)物分離提純發(fā)酵罐發(fā)酵條件控制接種培養(yǎng)基配置滅菌工業(yè)發(fā)酵的目的——大量地積累人們所需要的微生物代謝產(chǎn)物。在正常生理?xiàng)l件下

微生物通過其代謝調(diào)節(jié)系統(tǒng)吸收利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)用于合成細(xì)胞結(jié)構(gòu)，進(jìn)行生長(zhǎng)和繁殖，它們通常不浪費(fèi)原料和能量，也不積累中間代謝產(chǎn)物代謝的人工控制人為地打破微生物的代謝控制體系，就有可能使代謝朝著人們希望的方向進(jìn)行人工控制代謝的手段：改變微生物遺傳特性(遺傳學(xué)方法）；控制發(fā)酵條件（生物化學(xué)方法）；改變細(xì)胞膜透性；誘變育種

(1)使誘導(dǎo)型變?yōu)榻M成型——選育組成型突變株如果調(diào)節(jié)基因發(fā)生突變，以至產(chǎn)生無效的阻遏物而不能和操縱基因結(jié)合，或操縱基因突變，從而造成結(jié)構(gòu)基因不受控制的轉(zhuǎn)錄，酶的生成將不再需要誘導(dǎo)劑或不再被末端產(chǎn)物或分解代謝物阻遏，這樣的突變株稱為組成型突變株。少數(shù)情況下，組成型突變株可產(chǎn)生大量的、比親本高的多的酶，這種突變株稱為超產(chǎn)突變株。組成型突變株結(jié)構(gòu)基因不受控制地轉(zhuǎn)錄，酶的生成將不再需要誘導(dǎo)劑或不再被末端產(chǎn)物或分解代謝物阻遏。調(diào)節(jié)基因發(fā)生突變產(chǎn)生無效的阻遏物而不能與操縱基因結(jié)合操縱基因突變突變操縱基因不能與阻遏物結(jié)合組成型突變(2)使阻遏型變?yōu)槿プ瓒粜瓦x育營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株解除反饋?zhàn)瓒暨x育結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株解除分解代謝物阻遏——選育抗分解代謝阻遏突變株第三節(jié)發(fā)酵工藝條件及其控制

在酶的發(fā)酵生產(chǎn)中，除了選擇性能優(yōu)良的產(chǎn)酶細(xì)胞外，還必須控制好各種工藝條件，并且在發(fā)酵過程中根據(jù)情況變化進(jìn)行調(diào)節(jié)，以滿足細(xì)胞生長(zhǎng)、繁殖和產(chǎn)酶的需要。微生物發(fā)酵的一般工藝流程一、細(xì)菌活化與擴(kuò)增培養(yǎng)活化一般保存于冷凍管及砂土管或冰箱中的優(yōu)良生產(chǎn)菌種和選育的新菌種，在正式使用前要先接種到新鮮斜面培養(yǎng)基上，在一定的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，使細(xì)胞的生命活性得以恢復(fù)。擴(kuò)大培養(yǎng)是指菌種活化后經(jīng)過搖瓶或種子罐逐步擴(kuò)大培養(yǎng)，獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種的全過程。二、培養(yǎng)基孢子培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基種類組成碳源和氮源無機(jī)鹽和微量元素生長(zhǎng)因子水產(chǎn)物形成的誘導(dǎo)物、前體和促進(jìn)劑(1)用作培養(yǎng)菌種及擴(kuò)大生產(chǎn)的發(fā)酵罐的培養(yǎng)基的配制(2)培養(yǎng)基、發(fā)酵罐以及輔助設(shè)備的消毒滅菌(3)將已培養(yǎng)好的有活性的純菌株以一定量轉(zhuǎn)接到發(fā)酵罐中(4)接種到發(fā)酵罐中的菌株控制在最適條件下生長(zhǎng)并形成代謝產(chǎn)物(5)將產(chǎn)物抽提并進(jìn)行精制(6)回收或處理發(fā)酵過程中產(chǎn)生的廢物和廢水工業(yè)發(fā)酵步驟和工藝流程發(fā)酵的流程空氣空氣凈化處理保藏菌種斜面活化擴(kuò)大培養(yǎng)種子罐主發(fā)酵碳源、氮源、無機(jī)鹽等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)滅菌產(chǎn)物分離純化成品菌種篩選搖瓶試驗(yàn)發(fā)酵罐試驗(yàn)三、發(fā)酵工藝控制

發(fā)酵過程中，為了能對(duì)生產(chǎn)過程進(jìn)行必要的控制，需要對(duì)有關(guān)工藝參數(shù)進(jìn)行定期取樣測(cè)定或進(jìn)行連續(xù)測(cè)量。參數(shù)中，對(duì)發(fā)酵過程影響較大的有溫度、ＰＨ、溶解氧濃度等。1.溫度溫度對(duì)發(fā)酵的影響是多方面的，主要表現(xiàn)在對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、產(chǎn)物形成、發(fā)酵液的物理性質(zhì)和生物合成方面。最適發(fā)酵溫度是適合菌體生長(zhǎng)、又適合代謝產(chǎn)物合成的溫度，它隨菌種、培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)條件和菌體生長(zhǎng)階段不同而改變。2.pH發(fā)酵過程中pH的變化取決于所用的菌種、培養(yǎng)基的成分和培養(yǎng)條件。微生物生長(zhǎng)和生物合成都有其最適和能夠耐受的pH范圍，大多數(shù)微生物生長(zhǎng)的最適pH6.3-7.5，霉菌和酵母生長(zhǎng)的最適pH4-6，放線菌生長(zhǎng)的最適pH7-8。幾種抗生素發(fā)酵的最適pH范圍3.溶解氧濃度對(duì)于好氧發(fā)酵，溶解氧濃度是最重要的參數(shù)之一。好氧性微生物深層培養(yǎng)時(shí)，需要適量的溶解氧以維持其呼吸代謝和某些產(chǎn)物的合成，氧的不足會(huì)造成代謝異常，產(chǎn)量降低。四、提高酶產(chǎn)量的措施在酶的發(fā)酵生產(chǎn)過程中，為了提高酶的產(chǎn)量，除了選育優(yōu)良的產(chǎn)酶細(xì)胞外，還可以采取一些與酶發(fā)酵工藝有關(guān)的措施，例如添加誘導(dǎo)物、控制阻遏物濃度、添加表面活性劑等。

1.添加誘導(dǎo)物①酶的作用底物：如青霉素是青霉素酰化酶的誘導(dǎo)物。②酶的反應(yīng)產(chǎn)物：如纖維素二糖可誘導(dǎo)纖維素酶的產(chǎn)生。③酶的底物類似物：如異丙基-β-硫代半乳糖苷（IPTG）對(duì)β-半乳糖苷酶的誘導(dǎo)效果比乳糖高幾百倍。

2.控制阻遏物濃度微生物酶的生產(chǎn)受到代謝末端產(chǎn)物的阻遏和分解代謝物阻遏的調(diào)節(jié)。為避免分解代謝物的阻遏作用，可采用難于利用的碳源，如在β-半乳糖苷酶的生產(chǎn)中，只有在培養(yǎng)基中不含葡萄糖時(shí)，才能大量誘導(dǎo)產(chǎn)酶。3.添加表面活性劑/(產(chǎn)酶促進(jìn)劑）改變細(xì)胞的通透性或?qū)γ阜肿佑幸欢ǖ姆€(wěn)定作用如在霉菌的發(fā)酵生產(chǎn)中添加1%的吐溫可使纖維素酶的產(chǎn)量提高幾倍到幾十倍。

第四節(jié)酶發(fā)酵動(dòng)力學(xué)主要研究發(fā)酵過程中細(xì)胞生長(zhǎng)速度，產(chǎn)物生成速度，基質(zhì)消耗速度以及環(huán)境因素對(duì)這些速度的影響等。

一、細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)

研究細(xì)胞生長(zhǎng)速率以及外界環(huán)境因素對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)速率影響的規(guī)律。在培養(yǎng)成分一定時(shí)，微生物的生長(zhǎng)一般分五個(gè)階段延緩期（適應(yīng)期）對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期減速期靜止期（平衡期）衰退期（死亡期）

營(yíng)養(yǎng)物濃度（生長(zhǎng)限制基質(zhì)濃度）和生長(zhǎng)速率之間的動(dòng)力學(xué)關(guān)系：Monod模型μ:比生長(zhǎng)速率（1/h）（specificgrowthrate）μm：最大比生長(zhǎng)速率（1/h）S：營(yíng)養(yǎng)物濃度（生長(zhǎng)限制基質(zhì)濃度）克/LKs：莫諾德常數(shù)或飽和常數(shù)或營(yíng)養(yǎng)物利用常數(shù)克/L，或mol/L

二、酶生物合成的模式

根據(jù)酶的合成與細(xì)胞生長(zhǎng)之間的關(guān)系，可將酶的生物合成分為3種模式，即：同步合成型生長(zhǎng)偶聯(lián)型——

中期合成型部分生長(zhǎng)偶聯(lián)型——延續(xù)合成型非生長(zhǎng)偶聯(lián)型——

滯后合成型1.生長(zhǎng)偶聯(lián)型（又稱同步合成型）

酶的生物合成與細(xì)胞生長(zhǎng)同步。特點(diǎn)：酶的合成可以誘導(dǎo)，但不受分解代謝物阻遏和產(chǎn)物的反饋?zhàn)瓒?。?dāng)去除誘導(dǎo)物、細(xì)胞進(jìn)入平衡期后，酶的合成立即停止。生長(zhǎng)偶聯(lián)型中的特殊形式——中期合成型

酶的合成在細(xì)胞生長(zhǎng)一段時(shí)間后才開始，而在細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入平衡期以后，酶的合成也隨著停止。特點(diǎn)：酶的合成受產(chǎn)物的反饋?zhàn)瓒艋蚍纸獯x物阻遏。

枯草桿菌堿性磷酸酶合成曲線

2.部分生長(zhǎng)偶聯(lián)型（又稱延續(xù)合成型）

酶的合成在細(xì)胞的生長(zhǎng)階段開始，在細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入平衡期后，酶還可以延續(xù)合成較長(zhǎng)一段時(shí)間。特點(diǎn)：可受誘導(dǎo)，一般不受分解代謝物和產(chǎn)物阻遏。

黑曲霉聚半乳糖醛酸酶合成曲線3.非生長(zhǎng)偶聯(lián)型（又稱滯后合成型）

只有當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入平衡期以后，酶才開始合成并大量積累。許多水解酶的生物合成都屬于這一類型。特點(diǎn)：受分解代謝物的阻遏作用。

黑曲霉酸性蛋白酶合成曲線

酶生產(chǎn)中最理想的合成模式：延續(xù)合成型：發(fā)酵過程中沒有生長(zhǎng)期和產(chǎn)酶期的明顯差別。細(xì)胞開始生長(zhǎng)就有酶的產(chǎn)生，直至細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入平衡期后，酶還可以繼續(xù)生成一段時(shí)間。對(duì)于：同步合成型：提高對(duì)應(yīng)的mRNA的穩(wěn)定性，如降低發(fā)酵溫度。滯后合成型：盡量減少甚至解除分解代謝物阻遏，使酶的合成提早開始。中期合成型：要在提高mRNA穩(wěn)定性以及解除阻遏兩方面努力。三、產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)主要研究在發(fā)酵過程中細(xì)胞產(chǎn)酶速度以及各種環(huán)境因素對(duì)產(chǎn)酶速度的影響規(guī)律。

產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)根據(jù)研究的著眼點(diǎn)不同，可分為：

宏觀產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)（非結(jié)構(gòu)動(dòng)力學(xué)）:研究群體細(xì)胞的產(chǎn)酶速度及其影響因素（整個(gè)發(fā)酵系統(tǒng)的角度）。

微觀產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)（結(jié)構(gòu)動(dòng)力學(xué)）