細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法專家講座

細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)法王思理細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法專家講座第1頁較95版藥典修改關(guān)鍵點(diǎn)新增加三個定義1.細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)用水2.鱟試劑靈敏度3.反應(yīng)終點(diǎn)濃度細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法專家講座第2頁其它增加內(nèi)容序言：細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品用途增加了復(fù)核鱟試劑靈敏度。試驗(yàn)準(zhǔn)備：增加了試驗(yàn)所和器皿應(yīng)確證無干擾細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)。鱟試劑靈敏度復(fù)核:增加了2管陰性對照。供試品干擾試驗(yàn):增加了標(biāo)準(zhǔn)對照檢驗(yàn)法:鱟試劑支數(shù)由原來4支增加為5支結(jié)果判斷:

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法專家講座第3頁細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)法應(yīng)用指導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)

1.細(xì)菌內(nèi)毒素限值確實(shí)定：L=K/M2.干擾試驗(yàn)3.標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)4.鱟試劑5.細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)用水細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法專家講座第4頁細(xì)菌內(nèi)毒素定量測定法

（比濁法和顯色基質(zhì)法）

1.標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)2.細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)用水3.鱟試劑：應(yīng)符合定量測定要求。4.試驗(yàn)準(zhǔn)備：同細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)法。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法專家講座第5頁細(xì)菌內(nèi)毒素定量試驗(yàn)方法1.標(biāo)準(zhǔn)曲線可靠性試驗(yàn):r<-0.982.供試品干擾試驗(yàn):MVD=L.C/λ1 3.測定及判斷:回收率50%-200%4.供試品定量測定：測定結(jié)果與L比較細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法專家講座第6頁細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)法應(yīng)用指導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)指導(dǎo)意義

1.明確指明了制訂指導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)目標(biāo)是“為了將細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)法廣泛應(yīng)用于藥品、生物制品質(zhì)量控制”講非常明確。2.首次從官方文件中必定了細(xì)菌內(nèi)毒素定量測定法，這對促進(jìn)“定量法”在我國應(yīng)用將起重大促進(jìn)作用。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法專家講座第7頁細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)法應(yīng)用指導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)指導(dǎo)意義

3.指導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)對細(xì)菌內(nèi)素限值作出了非常明確要求：1、細(xì)菌內(nèi)毒素限值確實(shí)定藥品、生物制品細(xì)菌內(nèi)毒素限值(L)普通按以下公式確定：L=K/M4.在這次指導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)中只字未提熱源與細(xì)菌內(nèi)毒素兩法改變中對比試驗(yàn)，即今后在兩法改換中無須再做對比試驗(yàn)。這么必將大大加速我國兩法改換進(jìn)程。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法專家講座第8頁細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)法應(yīng)用指導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)指導(dǎo)意義

5.指導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)中明確要求：“標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)試驗(yàn)中所用細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)應(yīng)使用由中國藥品生物制品檢定所研制、標(biāo)定和分發(fā)細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品和工作標(biāo)準(zhǔn)品?！?.伴隨定量法在我國得到必定、應(yīng)用和推廣，它還將有力地推進(jìn)促進(jìn)細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)法在我國新進(jìn)展。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法專家講座第9頁細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品981研制

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法專家講座第10頁概況1.我國細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品從1979年研制成功并正式建立至今共研制分發(fā)了六批。2.現(xiàn)行細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品981研制與考評時間3.研制分四個階段細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法專家講座第11頁細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品981特點(diǎn)

1.細(xì)菌內(nèi)毒素精品提取2.細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品賦形劑3.候選品生產(chǎn)4.候選品考評5.協(xié)作標(biāo)定---新國際標(biāo)準(zhǔn)品IS2為基準(zhǔn)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法專家講座第12頁細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品981特點(diǎn)6.標(biāo)定方法---凝膠法和定量法7.協(xié)作標(biāo)定后結(jié)果經(jīng)數(shù)據(jù)處理和教授討論8.報中檢所學(xué)術(shù)委員會審定9.長久穩(wěn)定性考評與分裝后穩(wěn)定性考評10.標(biāo)準(zhǔn)品使用期細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法專家講座第13頁細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)法考查匯報

1.王思理等一行4人于1998年1月16日-27日首次赴美國進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)法專題考查。2.我們這次考查作了充分準(zhǔn)備,是帶著問題而去,在出訪前又集中討論了要了解重點(diǎn)問題.3.這次考查將對我國細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)法發(fā)展起到良好作用.細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法專家講座第14頁考查主要收獲

一.鱟試劑生產(chǎn)與管理1.鱟試劑生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)試劑均須按照美國聯(lián)邦法律相關(guān)要求進(jìn)行質(zhì)量控制并送FDA檢驗(yàn)經(jīng)過后方可銷售。2.生產(chǎn)企業(yè)在批批送檢時須呈交全部質(zhì)量控制和原始統(tǒng)計。3.在對鱟試劑靈敏度進(jìn)行標(biāo)定時需同進(jìn)使用美國內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品和鱟試劑參考標(biāo)準(zhǔn)品。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法專家講座第15頁考查主要收獲

二.內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品管理1.美國FDA負(fù)責(zé)管理內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品(EC系列)和鱟試劑參考品,政府無償提供內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品和鱟試劑參考品給鱟試劑生產(chǎn)廠家用于靈敏度標(biāo)定。2.工作標(biāo)準(zhǔn)品(CSE)由廠家自行生產(chǎn)和發(fā)放,政府不核發(fā)相關(guān)執(zhí)照。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法專家講座第16頁

考查主要收獲

三.細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)法用于藥品生產(chǎn)過程及最終產(chǎn)品質(zhì)量控制細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法專家講座第17頁考查主要收獲

四.由熱原檢驗(yàn)法改為細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)法

1.細(xì)菌內(nèi)毒素限值計算2.由熱原檢驗(yàn)法轉(zhuǎn)換為細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)法條件是供試品在一定條件下不干擾鱟試驗(yàn)，每個廠家每個品種做3批供試品干擾試驗(yàn)即可，無須進(jìn)行對比試驗(yàn)。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法專家講座第18頁考查主要收獲

五.細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)法1.鱟試劑靈敏度復(fù)核目標(biāo)不是考查靈敏度是否準(zhǔn)確，而且考查操作是否準(zhǔn)確，以及工作標(biāo)準(zhǔn)品是否準(zhǔn)確。2.0.1ml規(guī)格鱟試劑生產(chǎn)與使用應(yīng)與國際接軌。3.對供試品進(jìn)行常規(guī)檢驗(yàn)時，陽性對照對4個濃度，最少有兩個濃度，即2λ和0.25λ。同時供試品陽性對照不可缺乏。每個濃度平等做兩管。4.．用于配制調(diào)整供試品酸堿度氫氧化鈉溶液、鹽酸溶液、緩沖溶液等均嚴(yán)格要求細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)用水。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法專家講座第19頁考查主要收獲

六.其它1．在計算大輸液內(nèi)毒素限值時，M普通定為10ml/kg/hr。2.FDA關(guān)于細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)法Guldeline(指南)不含有法律效應(yīng)，它不是Regulation。3.美國藥典收裁細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)法法定方法為凝膠法，其它兩種方法能夠采取，但需做比較試驗(yàn)。4.新藥在生產(chǎn)過程中和最終產(chǎn)品質(zhì)量控制均須要求采取細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)法。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法專家講座第20頁幾點(diǎn)提議1.抓緊修訂和完善中國藥典附錄細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)法。2.制訂細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)法應(yīng)用指導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)一規(guī)范檢驗(yàn)中相關(guān)問題。3.對鱟試劑實(shí)施批批檢定或統(tǒng)一發(fā)放細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品，提議中檢所研究處理。4.擴(kuò)大品種應(yīng)用，提議藥典會制訂標(biāo)準(zhǔn)，宜先將中國藥典95年版中要求進(jìn)行熱原檢驗(yàn)法品種改為細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)法，新藥應(yīng)主動推廣使用細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)法。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法專家講座第21頁關(guān)于怎樣在我國將熱原檢驗(yàn)法改為細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)法記得提議細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法專家講座第22頁提議一.首先應(yīng)該明確將熱原檢驗(yàn)法改為細(xì)內(nèi)菌毒素檢驗(yàn)法不要做“兔法”與“鱟試驗(yàn)法”對比試驗(yàn)。對比試驗(yàn)嚴(yán)重地影響了我國在藥品熱原檢驗(yàn)中改為細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)進(jìn)度，大大落后了美國，這個歷史才識必須吸收。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法專家講座第23頁提議二.要在我國大量品種實(shí)施細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)法一個主要任務(wù)是必須要作好細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)法系統(tǒng)工程標(biāo)準(zhǔn)化工作。

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法專家講座第24頁細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)法系統(tǒng)工程標(biāo)準(zhǔn)化內(nèi)容1.《細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)法》修訂2.細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)法擴(kuò)大應(yīng)用指導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)制訂3.細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)法標(biāo)準(zhǔn)化操作規(guī)范(SOP)制訂4.細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品研制5.鱟試劑內(nèi)在質(zhì)量研究細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法專家講座第25頁細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)法系統(tǒng)工程標(biāo)準(zhǔn)化內(nèi)容6.鱟試劑部頒標(biāo)準(zhǔn)修訂7.鱟試劑國家對照品研制8.細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品研制9.細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)用水研制10.細(xì)菌內(nèi)毒素定量法研究等十項(xiàng)內(nèi)容細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法專家講座第26頁提議三.明確了上述兩個問題，其首要詳細(xì)問題就是要科學(xué)地合理地確定細(xì)菌內(nèi)毒素限值。四.將熱原檢驗(yàn)法改為細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)法，而且確定了內(nèi)毒素限值后，關(guān)鍵總是就是作好干擾試驗(yàn)。五.做好品種選擇工作細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法專家講座第27頁提議

六.要在我國實(shí)施熱原檢驗(yàn)法改為細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)法規(guī)范化。1.要求內(nèi)毒素限值(L)2.由藥廠和鱟試劑廠相結(jié)合，共同做好供試品干擾試驗(yàn)，實(shí)現(xiàn)兩個方法轉(zhuǎn)換。3.要求各級藥檢所，做好配合和復(fù)核工作。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法專家講座第28頁提議

七、由藥典會制訂兩法轉(zhuǎn)換申報程序

總之為使藥典能有較多品種采取細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)法，必須抓緊時間，充分利用這個良好機(jī)遇，做好品種匯總申報和審批工作。

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法專家講座第29頁論藥品生物制品細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)限值確實(shí)定細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法專家講座第30頁我國細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)法建立現(xiàn)實(shí)狀況能夠概括說：慢！主要原因：1.怎樣將熱原檢驗(yàn)法改為細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)法或者說怎樣以細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)法代替熱原檢驗(yàn)法？至今還沒有一個明確要求。2.假如科學(xué)地合理地確定細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)限值？還未得到應(yīng)有重視。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法專家講座第31頁一、怎樣科學(xué)地合理地確定細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)限值

L=K/MK值確實(shí)定M值確實(shí)定細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法專家講座第32頁二、當(dāng)前國內(nèi)在細(xì)菌內(nèi)毒素限值確定中存在問題1.采取熱原檢驗(yàn)劑量就會造成細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)內(nèi)毒素限值要求過嚴(yán)。2.細(xì)菌內(nèi)毒素限值L確定后，就依據(jù)L值進(jìn)行稀釋和做干擾試驗(yàn)。這么它們結(jié)果也需重新考慮了。3.當(dāng)前大量細(xì)菌內(nèi)毒素限值實(shí)際確定、鱟試驗(yàn)、發(fā)表文章、上報結(jié)果等多用“熱原檢驗(yàn)劑量”或“L=K/（fM），f為安全系數(shù)，普通為3~10”來確定L值。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法專家講座第33頁再論細(xì)菌內(nèi)毒素限值確實(shí)定細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法專家講座第34頁當(dāng)前細(xì)菌內(nèi)毒素限值確定存在問題主要問題是對“M為人用每千克體重每小時最大劑量”作了以下解釋：1.把最大劑量解釋成“熱原檢驗(yàn)法劑量”。2.把最大劑量解釋成“每小時人用量f倍”。3.把最大劑量解釋成“熱原劑量或人用最大劑量”。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法專家講座第35頁筆者認(rèn)為科學(xué)地合理地確定細(xì)菌內(nèi)毒素限值不但對我國建立細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)法至關(guān)主要，對確保被檢藥品安全使用也十分主要。而且它還直接關(guān)系到判斷藥品合格是否