種子的擴(kuò)大培養(yǎng)

4.2種子制備技術(shù)概要4.1目的與要求4.3種子制備過(guò)程舉例種子的擴(kuò)大培養(yǎng)1制備過(guò)程2實(shí)驗(yàn)室階段3生產(chǎn)車間階段4種子質(zhì)量控制

內(nèi)容速覽現(xiàn)在是1頁(yè)\一共有57頁(yè)\編輯于星期日4/24/20231長(zhǎng)江大學(xué)生科院生物工程系種子擴(kuò)大培養(yǎng)的目的:

□接種量的需要□縮短發(fā)酵時(shí)間、提高發(fā)酵效率需要數(shù)量多、代謝旺盛、活力強(qiáng)的種子接入發(fā)酵罐中。□菌種的馴化一種子擴(kuò)大培養(yǎng)的目的與要求種子擴(kuò)大培養(yǎng)的概念:

種子擴(kuò)大培養(yǎng)是指將保存在砂土管、冷凍干燥管中處于休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入試管斜面活化后，再經(jīng)過(guò)扁瓶或搖瓶及種子罐逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種過(guò)程。這些純種培養(yǎng)物稱為種子?，F(xiàn)在是2頁(yè)\一共有57頁(yè)\編輯于星期日4/24/20232長(zhǎng)江大學(xué)生科院生物工程系優(yōu)良種子應(yīng)具備的條件：菌體濃度及總量能滿足大規(guī)模發(fā)酵罐接種量的要求；生理狀態(tài)穩(wěn)定，如菌絲形態(tài)、菌絲生長(zhǎng)速率等；生長(zhǎng)活力強(qiáng)，移種至發(fā)酵罐后，能夠迅速生長(zhǎng)；無(wú)雜菌污染，保證純種發(fā)酵；菌種適應(yīng)性強(qiáng)，能保持穩(wěn)定的生產(chǎn)能力。

返回現(xiàn)在是3頁(yè)\一共有57頁(yè)\編輯于星期日4/24/20233長(zhǎng)江大學(xué)生科院生物工程系二種子制備技術(shù)概要（一）種子制備的過(guò)程1－砂土孢子2—冷凍干燥孢子3－斜面孢子4—搖瓶液體培養(yǎng)5—茄子瓶斜面培養(yǎng)6—固體培養(yǎng)基培養(yǎng)7、8—種子罐培養(yǎng)9—發(fā)酵罐

返回現(xiàn)在是4頁(yè)\一共有57頁(yè)\編輯于星期日4/24/20234長(zhǎng)江大學(xué)生科院生物工程系（二）實(shí)驗(yàn)室階段1、培養(yǎng)物選擇的原則目的：種子擴(kuò)培到一定的量和質(zhì)。

根據(jù)菌種的特點(diǎn)最終的培養(yǎng)物可分為兩類：實(shí)驗(yàn)室階段：不用種子罐，所用的設(shè)備為培養(yǎng)箱、搖床等實(shí)驗(yàn)室常見設(shè)備，在工廠這些培養(yǎng)過(guò)程一般都在菌種室完成，因此形象地將這些培養(yǎng)過(guò)程稱為實(shí)驗(yàn)室階段。現(xiàn)在是5頁(yè)\一共有57頁(yè)\編輯于星期日4/24/20235長(zhǎng)江大學(xué)生科院生物工程系對(duì)于不產(chǎn)孢子的微生物，實(shí)驗(yàn)室階段的種子擴(kuò)培最終是獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的菌體，如谷氨酸的種子培養(yǎng)。三角瓶搖床培養(yǎng)現(xiàn)在是6頁(yè)\一共有57頁(yè)\編輯于星期日4/24/20236長(zhǎng)江大學(xué)生科院生物工程系

對(duì)于產(chǎn)孢子的微生物

獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的菌絲體：對(duì)于產(chǎn)孢子能力不強(qiáng)及孢子發(fā)芽慢的菌種，可以采用搖瓶液體培養(yǎng)法，經(jīng)恒溫振蕩培養(yǎng)獲得菌絲體。獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的孢子：對(duì)于產(chǎn)孢子能力強(qiáng)及孢子發(fā)芽、生長(zhǎng)迅速的菌種可采用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)孢子，所獲孢子可直接作為種子罐的種子?，F(xiàn)在是7頁(yè)\一共有57頁(yè)\編輯于星期日4/24/20237長(zhǎng)江大學(xué)生科院生物工程系

孢子的制備①細(xì)菌孢子的制備◆斜面培養(yǎng)基多采用碳源限量而氮源豐富的配方?！襞囵B(yǎng)溫度：一般為37?C，少數(shù)28?C。

◆培養(yǎng)時(shí)間：需要5～10天。

②霉菌孢子的制備

一般以大米、小米、玉米、麩皮、麥粒等天然農(nóng)產(chǎn)品為培養(yǎng)基。

培養(yǎng)的溫度：一般為25～28?C。

培養(yǎng)時(shí)間：4～14天?，F(xiàn)在是8頁(yè)\一共有57頁(yè)\編輯于星期日4/24/20238長(zhǎng)江大學(xué)生科院生物工程系③放線菌孢子的制備◆一般采用瓊脂斜面培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中含有一些適合產(chǎn)孢子的營(yíng)養(yǎng)成分，如麩皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些無(wú)機(jī)鹽等，C、N不要太豐富（碳源約為1%，氮源不超過(guò)0.5%）。◆培養(yǎng)溫度：大多數(shù)為28?C，少數(shù)37?C?！襞囵B(yǎng)時(shí)間：5～14天?，F(xiàn)在是9頁(yè)\一共有57頁(yè)\編輯于星期日4/24/20239長(zhǎng)江大學(xué)生科院生物工程系

原始菌種斜面試管獲得孢子250ml茄子瓶（大米或小米）25~28℃，4~14天成熟（在真空下抽去水分，使水分含量在10%以下，于4℃冰箱保存）。e.g產(chǎn)黃青霉菌現(xiàn)在是10頁(yè)\一共有57頁(yè)\編輯于星期日4/24/202310長(zhǎng)江大學(xué)生科院生物工程系對(duì)于不產(chǎn)孢子的赤霉素生產(chǎn)菌（Gibberellinefujikuroi），也可用大米固體培養(yǎng)基在茄子瓶中培養(yǎng)菌絲體，用作種子罐種子。不產(chǎn)孢子的細(xì)菌，如生產(chǎn)谷氨酸的棒狀桿菌（Corynebacterium）、短桿菌（Brevibacterium），生產(chǎn)上一般采用斜面營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)培，再轉(zhuǎn)入液體搖瓶培養(yǎng)，獲得細(xì)胞懸液再接種?，F(xiàn)在是11頁(yè)\一共有57頁(yè)\編輯于星期日4/24/202311長(zhǎng)江大學(xué)生科院生物工程系e.g.Glutamicacid-producer：（谷氨酸生產(chǎn)菌）原始菌種（出發(fā)菌種）固體試管斜面（32°C，18~24小時(shí)）

三角瓶培養(yǎng)（搖床）(flaskculture)

種子罐培養(yǎng)e.g.yeast：原始菌種（出發(fā)菌種）10ml麥汁試管250ml三角瓶培養(yǎng)（27°C~28°C，3天）（25°C，2天）5~10L卡氏罐（15°C~20°C，3~5天）現(xiàn)在是12頁(yè)\一共有57頁(yè)\編輯于星期日4/24/202312長(zhǎng)江大學(xué)生科院生物工程系2、培養(yǎng)基選擇的原則培養(yǎng)基的選擇應(yīng)該是有利于菌體的生長(zhǎng)，對(duì)孢子培養(yǎng)基應(yīng)該是有利于孢子的生長(zhǎng)。在原料方面，實(shí)驗(yàn)室種子培養(yǎng)階段，規(guī)模一般比較小，因此為了保證培養(yǎng)基的質(zhì)量，培養(yǎng)基的原料一般都比較精細(xì)。

返回現(xiàn)在是13頁(yè)\一共有57頁(yè)\編輯于星期日4/24/202313長(zhǎng)江大學(xué)生科院生物工程系（三）生產(chǎn)車間階段1、培養(yǎng)物的選擇原則在生產(chǎn)車間階段，最終一般都是獲得一定數(shù)量的菌絲體。菌絲體比孢子要有利：縮短發(fā)酵時(shí)間有利于獲得好的發(fā)酵結(jié)果生產(chǎn)車間階段：種子培養(yǎng)在種子罐里面進(jìn)行，在工廠一般歸為發(fā)酵車間管理，因此形象地稱這些培養(yǎng)過(guò)程為生產(chǎn)車間階段。現(xiàn)在是14頁(yè)\一共有57頁(yè)\編輯于星期日4/24/202314長(zhǎng)江大學(xué)生科院生物工程系2、培養(yǎng)基選擇的原則目的：獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的菌體，因此培養(yǎng)基的選擇應(yīng)首先考慮的是有利于孢子的發(fā)育和菌體的生長(zhǎng)，所以營(yíng)養(yǎng)要比發(fā)酵培養(yǎng)基豐富。在原料方面：不如實(shí)驗(yàn)室階段那么精細(xì)，而是基本接近于發(fā)酵培養(yǎng)基，這有兩個(gè)方面的原因:一是成本、二是馴化。現(xiàn)在是15頁(yè)\一共有57頁(yè)\編輯于星期日4/24/202315長(zhǎng)江大學(xué)生科院生物工程系3、發(fā)酵級(jí)數(shù)的確定谷氨酸：三級(jí)發(fā)酵一級(jí)種子（搖瓶）→二級(jí)種子（小罐）→發(fā)酵青霉素：三級(jí)發(fā)酵（二級(jí)種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)）一級(jí)種子（小罐）→二級(jí)種子（中罐）→發(fā)酵

一般由菌絲體培養(yǎng)開始計(jì)算發(fā)酵級(jí)數(shù)，但有時(shí)，工廠從第一級(jí)種子罐開始計(jì)算發(fā)酵級(jí)數(shù)?，F(xiàn)在是16頁(yè)\一共有57頁(yè)\編輯于星期日4/24/202316長(zhǎng)江大學(xué)生科院生物工程系現(xiàn)在是17頁(yè)\一共有57頁(yè)\編輯于星期日4/24/202317長(zhǎng)江大學(xué)生科院生物工程系發(fā)酵級(jí)數(shù)確定的依據(jù)：級(jí)數(shù)受發(fā)酵規(guī)模、菌體生長(zhǎng)特性、接種量的影響；

級(jí)數(shù)大，難控制、易染菌、易變異，管理困難，一般2～4級(jí)；

在發(fā)酵產(chǎn)品的生產(chǎn)中，反應(yīng)級(jí)數(shù)的確定是非常重要的一個(gè)方面?，F(xiàn)在是18頁(yè)\一共有57頁(yè)\編輯于星期日4/24/202318長(zhǎng)江大學(xué)生科院生物工程系采用三級(jí)種子的谷氨酸發(fā)酵工藝

李文東，發(fā)酵科技通訊，2003,7斜面→一級(jí)種子（1200ml/5000ml三角瓶）→二級(jí)種子（2m3）→三級(jí)種子（20m3)→發(fā)酵罐（240m3)背景：近年來(lái)，由于谷氨酸發(fā)酵產(chǎn)酸水平快速提高，發(fā)酵工藝也在不斷改進(jìn)和創(chuàng)新，國(guó)內(nèi)大多數(shù)廠家都采用“大種量二級(jí)種子發(fā)酵工藝”（種子罐是發(fā)酵罐的5%以上）

，發(fā)酵產(chǎn)酸水平和糖酸轉(zhuǎn)化率比“小種量二級(jí)種子發(fā)酵工藝”（種子罐是發(fā)酵罐的1%左右）有了較大提高。但是生產(chǎn)水平和糖酸轉(zhuǎn)化率穩(wěn)定性較差，發(fā)酵平均周期35h左右，沒有達(dá)到提高設(shè)備利用率和降低生產(chǎn)成本的目的。文章：三級(jí)種子工藝現(xiàn)在是19頁(yè)\一共有57頁(yè)\編輯于星期日4/24/202319長(zhǎng)江大學(xué)生科院生物工程系①種量更大，生長(zhǎng)速度更快，產(chǎn)酸提前且速度快：工藝8小時(shí)產(chǎn)酸（%）12小時(shí)產(chǎn)酸（%）發(fā)酵周期（h)三級(jí)種子2.2～2.74.6～5.232大種量二級(jí)種子1.0～1.52.6～3.435②糖酸轉(zhuǎn)化率高且穩(wěn)定工藝產(chǎn)酸（%）糖酸轉(zhuǎn)化率（%）單罐產(chǎn)量(噸）三級(jí)種子10.9359.821二級(jí)種子9.85818三級(jí)種子的特點(diǎn)：現(xiàn)在是20頁(yè)\一共有57頁(yè)\編輯于星期日4/24/202320長(zhǎng)江大學(xué)生科院生物工程系4、接種量的確定接種量指移入種子液的體積和接種后培養(yǎng)液體積之比。接種量大小取決于生產(chǎn)菌種的生長(zhǎng)繁殖速度。過(guò)大過(guò)小都不好，最終以實(shí)踐定，如大多數(shù)抗生素為7～15%，而由北京棒狀桿菌發(fā)酵谷氨酸只需1%。

現(xiàn)在是21頁(yè)\一共有57頁(yè)\編輯于星期日4/24/202321長(zhǎng)江大學(xué)生科院生物工程系一般認(rèn)為大一點(diǎn)好。采用較大的接種量可縮短菌絲體繁殖達(dá)到高峰的時(shí)間，使產(chǎn)物形成提前到來(lái)；生產(chǎn)菌占優(yōu)勢(shì)，減少雜菌生長(zhǎng)的機(jī)會(huì)。接種量過(guò)多，往往又會(huì)使菌絲生長(zhǎng)過(guò)快，培養(yǎng)液黏度增加，造成溶解氧不足，而影響產(chǎn)物的合成。接種量過(guò)小，引起發(fā)酵前期菌體生長(zhǎng)緩慢，使發(fā)酵周期延長(zhǎng)，菌絲量少，產(chǎn)生菌絲團(tuán)，導(dǎo)致發(fā)酵異常等4、接種量的確定現(xiàn)在是22頁(yè)\一共有57頁(yè)\編輯于星期日4/24/202322長(zhǎng)江大學(xué)生科院生物工程系近年來(lái)，生產(chǎn)多以加大種子量及采用豐富培養(yǎng)基作為獲得高產(chǎn)的措施。有的產(chǎn)品采用雙種法：兩個(gè)種子罐接種到一個(gè)發(fā)酵罐中，如卡那霉素生產(chǎn)中采用雙種比單種的發(fā)酵單位提高8%；也有的采用倒種法：一部分種子來(lái)源于種子罐，一部分來(lái)源于發(fā)酵罐中發(fā)酵液，如鏈霉素發(fā)酵中，使用倒種比單種發(fā)酵單位提高12%。

4、接種量的確定現(xiàn)在是23頁(yè)\一共有57頁(yè)\編輯于星期日4/24/202323長(zhǎng)江大學(xué)生科院生物工程系接種量對(duì)菌體形態(tài)和產(chǎn)Υ亞麻酸的影響楊博，中國(guó)油脂，2002

Υ亞麻酸是一種人體必需多價(jià)不飽和脂肪酸，它是人體前列腺素的前體物質(zhì)，在預(yù)防與治療心腦血管疾病、糖尿病治療、增強(qiáng)免疫力、抗癌和保護(hù)皮膚等方面具有重要的生理功能。因發(fā)酵法生產(chǎn)Υ亞麻酸與從天然植物提取相比具有一系列優(yōu)點(diǎn)，發(fā)酵法生產(chǎn)Υ亞麻酸成了當(dāng)今研究的一個(gè)熱點(diǎn)。

Υ亞麻酸發(fā)酵一般是采用絲狀真菌來(lái)進(jìn)行，絲狀真菌的形態(tài)往往對(duì)發(fā)酵有較明顯的影響，而絲狀真菌發(fā)酵Υ亞麻酸時(shí)菌絲體形態(tài)的不同對(duì)發(fā)酵的影響很少有報(bào)道。現(xiàn)在是24頁(yè)\一共有57頁(yè)\編輯于星期日4/24/202324長(zhǎng)江大學(xué)生科院生物工程系采用被孢霉進(jìn)行Υ亞麻酸發(fā)酵時(shí)接種量可以明顯影響菌絲體現(xiàn)在是25頁(yè)\一共有57頁(yè)\編輯于星期日現(xiàn)在是26頁(yè)\一共有57頁(yè)\編輯于星期日4/24/202326長(zhǎng)江大學(xué)生科院生物工程系本研究發(fā)現(xiàn)，采用被孢霉進(jìn)行Υ亞麻酸發(fā)酵時(shí)接種量可以明顯影響菌絲體的形態(tài)，從而影響菌體干重和Υ亞麻酸產(chǎn)量。種子的擴(kuò)大培養(yǎng)現(xiàn)在是27頁(yè)\一共有57頁(yè)\編輯于星期日4/24/202327長(zhǎng)江大學(xué)生科院生物工程系5、種齡(seedage)種齡是指種子罐中培養(yǎng)的菌絲體開始移入下一級(jí)種子罐或發(fā)酵罐時(shí)的培養(yǎng)時(shí)間。種齡年輕：接入發(fā)酵罐后，往往會(huì)出現(xiàn)前期生長(zhǎng)緩慢、整個(gè)發(fā)酵周期延長(zhǎng)、產(chǎn)物開始形成的時(shí)間推遲，甚至出現(xiàn)發(fā)酵異常情況；種齡過(guò)老：引起生產(chǎn)能力下降而菌絲過(guò)早自溶。原則：一般以處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌絲體較為合適，細(xì)胞活力強(qiáng)，菌體濃度相對(duì)較大。具體需實(shí)驗(yàn)確定。現(xiàn)在是28頁(yè)\一共有57頁(yè)\編輯于星期日4/24/202328長(zhǎng)江大學(xué)生科院生物工程系舒琴，林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，2004菌種為嗜堿性芽孢桿菌鏡檢：24小時(shí)多個(gè)桿菌首位相連成線形，處于繁殖旺盛期，30小時(shí)開始出現(xiàn)芽孢

返回現(xiàn)在是29頁(yè)\一共有57頁(yè)\編輯于星期日4/24/202329長(zhǎng)江大學(xué)生科院生物工程系（四）種子質(zhì)量控制1、種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)2、影響種子質(zhì)量的因素3、種子質(zhì)量的控制措施４、種子質(zhì)量異常分析現(xiàn)在是30頁(yè)\一共有57頁(yè)\編輯于星期日4/24/202330長(zhǎng)江大學(xué)生科院生物工程系①生化指標(biāo)②檢查菌絲形態(tài)、菌絲濃度和培養(yǎng)液外觀（色澤、氣味、渾濁度等）③檢查有無(wú)雜菌污染④產(chǎn)物生成量⑤其他參數(shù)

1、種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)現(xiàn)在是31頁(yè)\一共有57頁(yè)\編輯于星期日4/24/202331長(zhǎng)江大學(xué)生科院生物工程系檢測(cè)培養(yǎng)液中的糖氨基氮磷酸鹽含量:萃取-磷鉬藍(lán)比色法

pH值①生化指標(biāo)3，5-二硝基水楊酸法斐林試劑法現(xiàn)在是32頁(yè)\一共有57頁(yè)\編輯于星期日4/24/202332長(zhǎng)江大學(xué)生科院生物工程系色澤、氣味、渾濁度等單細(xì)胞：菌體健壯、菌形一致、均勻整齊，有的還要求有一定的排列或形態(tài)；霉菌、放線菌：菌絲粗壯、對(duì)某些染料著色力強(qiáng)、生長(zhǎng)旺盛、菌絲分枝情況和內(nèi)含物情況好。

②檢查菌絲形態(tài)、菌絲濃度和培養(yǎng)液外觀現(xiàn)在是33頁(yè)\一共有57頁(yè)\編輯于星期日4/24/202333長(zhǎng)江大學(xué)生科院生物工程系纈霉素發(fā)酵液中氨基氮的測(cè)定氨基酸中的-NH3+基的pk值常在9.0以上，不能用一般的酸堿指示劑（包括酚酞），以氫氧化鈉溶液作滴定測(cè)量。但可以用甲醛滴定法測(cè)量。在pH中性和常溫條件下，甲醛迅速與氨基酸中氨基相互作用，使滴定終點(diǎn)移至pH9.0左右，在該過(guò)程中指示劑酚酞不與甲醛作用。pH9.0正是酚酞的變色范圍，因此，可以用酚酞作為指示劑，以氫氧化鈉溶液來(lái)滴定-NH3+基上的H+，每釋放一個(gè)氫離子，就相當(dāng)于一個(gè)氨基酸。現(xiàn)在是34頁(yè)\一共有57頁(yè)\編輯于星期日4/24/202334長(zhǎng)江大學(xué)生科院生物工程系反應(yīng)如下R-NH3+H++R-NH2R-NH2+2CH3CHOR-N(CH2OH)2現(xiàn)在是35頁(yè)\一共有57頁(yè)\編輯于星期日4/24/202335長(zhǎng)江大學(xué)生科院生物工程系實(shí)驗(yàn)步驟1.將發(fā)酵液過(guò)濾，取濾液2.5mL于250mL三角瓶中，加蒸餾水約50mL,加甲基紅指示劑2~3滴，加1mol/LHCl溶液1～2滴，使成紅色，放置3min.2.以標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液滴定至剛好轉(zhuǎn)橙黃色，讀取此時(shí)滴定管刻度，加入12％中性甲醛10mL，放置5—10min。3.加入酚酞指示劑1mL，用標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液滴定至呈微紅色為終點(diǎn)，讀取此時(shí)滴定管刻度。兩次讀數(shù)之差即為所耗NaOH毫升數(shù)?，F(xiàn)在是36頁(yè)\一共有57頁(yè)\編輯于星期日4/24/202336長(zhǎng)江大學(xué)生科院生物工程系結(jié)果計(jì)算

NNaOH×VNaOH×14.01NH-N%=×1002.5單位：mg/100ml

現(xiàn)在是37頁(yè)\一共有57頁(yè)\編輯于星期日4/24/202337長(zhǎng)江大學(xué)生科院生物工程系④產(chǎn)物生成量如，在抗生素發(fā)酵中，產(chǎn)物生成量是考察種子質(zhì)量的重要指標(biāo)，因?yàn)榉N子液中產(chǎn)物生成量的多少間接反映種子的生產(chǎn)能力和成熟程度。⑤其他參數(shù)：如某些酶的活力、種子罐的溶氧和尾氣等。eg,土霉素生產(chǎn)的種子液中的淀粉酶活力與土霉素發(fā)酵單位有一定的關(guān)系。

③檢查有無(wú)雜菌污染現(xiàn)在是38頁(yè)\一共有57頁(yè)\編輯于星期日4/24/202338長(zhǎng)江大學(xué)生科院生物工程系④產(chǎn)物生成量如，在抗生素發(fā)酵中，產(chǎn)物生成量是考察種子質(zhì)量的重要指標(biāo)，因?yàn)榉N子液中產(chǎn)物生成量的多少間接反映種子的生產(chǎn)能力和成熟程度。⑤其他參數(shù)：如某些酶的活力、種子罐的溶氧和尾氣等。eg,土霉素生產(chǎn)的種子液中的淀粉酶活力與土霉素發(fā)酵單位有一定的關(guān)系。

③檢查有無(wú)雜菌污染現(xiàn)在是39頁(yè)\一共有57頁(yè)\編輯于星期日4/24/202339長(zhǎng)江大學(xué)生科院生物工程系2、影響種子質(zhì)量的因素①原材料質(zhì)量②種齡

③培養(yǎng)條件④斜面冷藏時(shí)間2、影響種子質(zhì)量的因素現(xiàn)在是40頁(yè)\一共有57頁(yè)\編輯于星期日4/24/202340長(zhǎng)江大學(xué)生科院生物工程系2、影響種子質(zhì)量的因素生產(chǎn)過(guò)程中經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)種子質(zhì)量不穩(wěn)定的現(xiàn)象，其主要原因是原材料質(zhì)量波動(dòng)：產(chǎn)地、品種、加工方法等。e.g1：四環(huán)素、土霉素斜面用麩皮：小麥產(chǎn)地、品種、加工方法及用量影響孢子的質(zhì)量。

e.g2：蛋白胨：有魚胨、骨胨、胰蛋白胨。瓊脂、水無(wú)機(jī)離子差別引起孢子質(zhì)量變化，微量Mg2+、Cu2+、Ba2+能刺激孢子的形成。①原材料質(zhì)量現(xiàn)在是41頁(yè)\一共有57頁(yè)\編輯于星期日4/24/202341長(zhǎng)江大學(xué)生科院生物工程系2、影響種子質(zhì)量的因素②種齡種齡過(guò)于年輕的種子接入發(fā)酵罐后，往往會(huì)出現(xiàn)前期生長(zhǎng)緩慢、泡沫多、發(fā)酵周期延長(zhǎng)以及因菌體量過(guò)少而菌絲結(jié)團(tuán)，引起異常發(fā)酵等等；種齡過(guò)老的種子接入發(fā)酵罐后，則會(huì)因菌體老化而導(dǎo)致生產(chǎn)能力衰退。一般以對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為好。

現(xiàn)在是42頁(yè)\一共有57頁(yè)\編輯于星期日4/24/202342長(zhǎng)江大學(xué)生科院生物工程系

③培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度過(guò)低會(huì)導(dǎo)致菌種生長(zhǎng)發(fā)育緩慢，過(guò)高會(huì)使菌種過(guò)早自溶。如果不是用最適溫度培養(yǎng)，其生產(chǎn)能力就會(huì)下降。

選擇最適種子培養(yǎng)pH；最后一級(jí)種子的培養(yǎng)基pH應(yīng)接近于發(fā)酵培養(yǎng)基的pH，以便種子能盡快適應(yīng)新的環(huán)境。通氣與攪拌（aerationandagitation

足夠的通氣量可提高種子質(zhì)量；攪拌可以提高通氣效果，如果攪拌效果不好、攪拌時(shí)泡沫過(guò)多會(huì)使菌絲黏壁，甚至菌絲結(jié)團(tuán)，影響種子質(zhì)量。此外，絲狀真菌，一般不宜劇烈攪拌。2、影響種子質(zhì)量的因素現(xiàn)在是43頁(yè)\一共有57頁(yè)\編輯于星期日4/24/202343長(zhǎng)江大學(xué)生科院生物工程系濕度：斜面培養(yǎng)基的濕度對(duì)孢子的質(zhì)量有較大影響，濕度低孢子生長(zhǎng)快，濕度高孢子生長(zhǎng)慢。在南方相對(duì)濕度控制在35％～42％。孢子數(shù)量最多，孢子顏色均勻，質(zhì)量較好。如土霉素生產(chǎn)菌種龜裂霉菌的孢子，在北方干燥地區(qū)孢子斜面長(zhǎng)的快，在含少量水分的試管斜面培養(yǎng)基中下部孢子長(zhǎng)的好，而上部孢子稀少；氣溫高，濕度大的地區(qū)，斜面孢子長(zhǎng)的慢，試管下部冷凝水多而不利于孢子形成。

③培養(yǎng)條件現(xiàn)在是44頁(yè)\一共有57頁(yè)\編輯于星期日4/24/202344長(zhǎng)江大學(xué)生科院生物工程系對(duì)孢子的生產(chǎn)能力有較大的影響，通常冷藏時(shí)間越長(zhǎng)，生產(chǎn)能力下降越多。

土霉素菌種孢子斜面培養(yǎng)四天左右，即于4℃冰箱保存，發(fā)現(xiàn)冷藏7~8天菌體自溶，而培養(yǎng)五天以后冷藏，20天未發(fā)現(xiàn)自溶。鏈霉素發(fā)酵中，斜面孢子在6℃冷藏2個(gè)月后發(fā)酵單位比冷藏1個(gè)月的降低18%。④斜面冷藏時(shí)間現(xiàn)在是45頁(yè)\一共有57頁(yè)\編輯于星期日4/24/202345長(zhǎng)江大學(xué)生科院生物工程系3、種子質(zhì)量的控制措施種子質(zhì)量的最終指標(biāo)是考察其在發(fā)酵罐中所表現(xiàn)出來(lái)的生產(chǎn)能力，所以必須保證：①菌種的穩(wěn)定性；②提供種子培養(yǎng)的適宜環(huán)境；③無(wú)雜菌侵入。（1）菌種穩(wěn)定性的檢查定期考查和挑選菌種，對(duì)其進(jìn)行自然分離，搖瓶發(fā)酵，測(cè)定生產(chǎn)能力，以不低于原有的生產(chǎn)能力為原則，從中挑選出高產(chǎn)菌株，并及時(shí)對(duì)退化菌種進(jìn)行復(fù)壯。現(xiàn)在是46頁(yè)\一共有57頁(yè)\編輯于星期日4/24/202346長(zhǎng)江大學(xué)生科院生物工程系確保菌種能在適宜的條件下生長(zhǎng)繁殖，包括營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基、適宜的培養(yǎng)溫度、pH和濕度、合理的通氣量等。（3）種子無(wú)雜菌檢查種子在制備過(guò)程中每一步移種均需進(jìn)行無(wú)雜菌檢查，并對(duì)種子液進(jìn)行生化分析：主要是取樣測(cè)定其營(yíng)養(yǎng)消耗速度、pH變化、溶解氧利用情況、色澤和氣味等。無(wú)菌檢查是判斷雜菌的主要依據(jù)，通常采用鏡檢和無(wú)菌試驗(yàn)相結(jié)合。（2）適宜的生長(zhǎng)環(huán)境現(xiàn)在是47頁(yè)\一共有57頁(yè)\編輯于星期日4/24/202347長(zhǎng)江大學(xué)生科院生物工程系４、種子質(zhì)量異常分析●菌種生長(zhǎng)過(guò)慢或過(guò)快：與孢子質(zhì)量及種子罐的培養(yǎng)條件有關(guān)。通入種子罐的無(wú)菌空氣的溫度較低或者培養(yǎng)基的滅菌質(zhì)量較差是種子生長(zhǎng)、代謝緩慢的主要原因。

●菌絲結(jié)團(tuán)：與攪拌效果差，接種量小有關(guān)。菌絲結(jié)團(tuán)會(huì)影響菌的呼吸和對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收。

●菌絲粘壁：與攪拌效果不好，泡沫過(guò)多，以及種子罐裝料系數(shù)過(guò)小等原因有關(guān)。其結(jié)果使培養(yǎng)液中菌絲濃度減少，最后就可能形成菌絲團(tuán)。

返回現(xiàn)在是48頁(yè)\一共有57頁(yè)\編輯于星期日4/24/202348長(zhǎng)江大學(xué)生科院生物工程系三

種子制備過(guò)程舉例（一）谷氨酸生產(chǎn)的種子制備制備過(guò)程斜面種子→搖瓶種子（一級(jí)種子）→種子罐種子（二級(jí)種子）→發(fā)酵現(xiàn)在是49頁(yè)\一共有57頁(yè)\編輯于星期日4/24/202349長(zhǎng)江大學(xué)生科院生物工程系1、斜面種子培養(yǎng)基：蛋白胨1%，牛肉膏1%，氯化鈉0.5%瓊脂2%，pH7.0-7.2培養(yǎng)基特點(diǎn)：有利于菌體的生長(zhǎng)，原料比較精細(xì)。培養(yǎng)條件：32℃，生長(zhǎng)18-24小時(shí)。生長(zhǎng)斜面要求：生長(zhǎng)良好，所使用斜面連續(xù)傳代不超過(guò)3次?，F(xiàn)在是50頁(yè)\一共有57頁(yè)\編輯于星期日4/24/202350長(zhǎng)江大學(xué)生科院生物工程系2.一級(jí)種子（搖瓶種子）培養(yǎng)條件：于1000ml三角瓶中，裝液200-250ml，32℃培養(yǎng)