農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化原理及技術(shù)

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化原理及技術(shù)

顏靜宛現(xiàn)在是1頁\一共有28頁\編輯于星期六水稻遺傳轉(zhuǎn)化已成為水稻分子生物學(xué)研究和遺傳改良的重要技術(shù)基礎(chǔ)

現(xiàn)在是2頁\一共有28頁\編輯于星期六幾種常用植物基因轉(zhuǎn)化方法的比較轉(zhuǎn)化方法農(nóng)桿菌法PEG法電擊法微針注射法基因槍法花粉管通道法受體材料完整細(xì)胞原生質(zhì)體原生質(zhì)體原生質(zhì)體完整細(xì)胞卵細(xì)胞宿主范圍有無無無無有性繁殖植物組培條件簡單復(fù)雜復(fù)雜復(fù)雜簡單無嵌合體比例有無無無多無操作復(fù)雜性簡單簡單復(fù)雜復(fù)雜復(fù)雜簡單設(shè)備要求便宜便宜昂貴昂貴昂貴便宜工作效率高低低低高低單子葉植物應(yīng)用少可行可行可行廣泛廣泛現(xiàn)在是3頁\一共有28頁\編輯于星期六農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的優(yōu)點(diǎn)操作簡便外源基因插入一般為單拷貝或低拷貝轉(zhuǎn)移DNA片段明確可轉(zhuǎn)移大片段DNA可直接用不同的植物組織進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移現(xiàn)在是4頁\一共有28頁\編輯于星期六農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化的原理現(xiàn)在是5頁\一共有28頁\編輯于星期六農(nóng)桿菌是一種革蘭氏陰性土壤桿菌，分為發(fā)根農(nóng)桿菌（導(dǎo)致毛狀根的發(fā)生）和根癌農(nóng)桿菌（導(dǎo)致冠癭瘤，冠癭瘤細(xì)胞可產(chǎn)生正常細(xì)胞不能產(chǎn)生的冠癭堿）。根癌農(nóng)桿菌含有可向植物轉(zhuǎn)移并使植物致瘤的質(zhì)粒（Ti質(zhì)粒）。根癌農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒包括毒性區(qū)（Vir區(qū)）、結(jié)合區(qū)（Con區(qū)）、復(fù)制起始區(qū)（Ori區(qū)）和T-DNA區(qū)四個(gè)部分，其中與冠癭瘤生成有關(guān)系的是Vir區(qū)和T-DNA區(qū)?，F(xiàn)在是6頁\一共有28頁\編輯于星期六T-DNA區(qū)左右邊界各有25bp的重復(fù)序列，其中14bp是核心，分10bp（CAGGAATATAT)和4bp（GTAA)不連續(xù)的兩組，是完全保守的。Vir區(qū)為30Kb,由VirA、VirB、VirC、VirD、VirG、VirH等七個(gè)操縱子共24個(gè)基因起共調(diào)控作用?，F(xiàn)在是7頁\一共有28頁\編輯于星期六Ti質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖

現(xiàn)在是8頁\一共有28頁\編輯于星期六

農(nóng)桿菌侵染過程

損傷的植物細(xì)胞產(chǎn)生植物酚類作為農(nóng)桿菌的侵染信號;這些化學(xué)誘導(dǎo)物透過農(nóng)桿菌的細(xì)胞膜,活化virA和virG基因,再誘導(dǎo)Vir區(qū)的其他基因;Vir基因的活化,作用于T-DNA的加工及T-DNA的轉(zhuǎn)移;T-DNA進(jìn)入植物細(xì)胞后整合到核DNA上;T-DNA在植物細(xì)胞中表達(dá)產(chǎn)生冠癭堿及植物激素;農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒上有專一性的冠癭堿分解酶基因(ocs),該基因啟動合成各種酶,分解植物細(xì)胞產(chǎn)生的冠癭堿作為惟一的碳源和氮源;冠癭堿促進(jìn)農(nóng)桿菌的附著及激活tra基因有利于Ti質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移,擴(kuò)大侵染范圍現(xiàn)在是9頁\一共有28頁\編輯于星期六根癌農(nóng)桿菌通過基因轉(zhuǎn)化把T-DNA上的基因?qū)胫参锛?xì)胞并整合到核DNA上。

現(xiàn)在是10頁\一共有28頁\編輯于星期六BiologyofA.tumefaciensWellknowntoinducecrowngalltumorA.tumefacienslivesaroundrootsurfaces(inrhizosphere)whereitusingnutrientsthatleakfromtheroottissuesinfectsonlythroughwoundsites

andactivelychemotactictothemPlantwoundproducesacetosyringone

BacterialT-plasmidproducesreceptorsforacetosyringone

現(xiàn)在是11頁\一共有28頁\編輯于星期六Producecallustransformcallusstimulateshootingbycytokininaddition+cytokininThisprocedureiseasyfordicotyledoneplants(legumesetc)現(xiàn)在是12頁\一共有28頁\編輯于星期六現(xiàn)在是13頁\一共有28頁\編輯于星期六農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化水稻的方法現(xiàn)在是14頁\一共有28頁\編輯于星期六水稻（秈稻）根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化技術(shù)流程愈傷誘導(dǎo)共培養(yǎng)抗性愈傷的篩選與再生成完整植株整個(gè)操作過程約需8天第一天（預(yù)培養(yǎng)）第三天（劃菌）第五天（侵染、共培養(yǎng))第八天（脫菌、篩選）NB培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基加入相應(yīng)植物生長調(diào)節(jié)劑技術(shù)關(guān)鍵：誘導(dǎo)與培養(yǎng)“狀態(tài)良好”的胚性愈傷組織；用于轉(zhuǎn)化的胚性愈傷的繼代次數(shù)不超過8代；高密度根農(nóng)桿菌液侵染與共培養(yǎng)；干燥處理；共培養(yǎng)后有效去除農(nóng)桿菌或者抑制農(nóng)桿菌生長（合適的抗生素及其濃度）；快速篩選（2-3次篩選）；迅速分化再生。現(xiàn)在是15頁\一共有28頁\編輯于星期六一、培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基為NB培養(yǎng)基，愈傷誘導(dǎo)、轉(zhuǎn)化及分化等培養(yǎng)基配方如下：1.誘導(dǎo)培養(yǎng)基：NB+2,4-D2mg·L-1；pH5.8-5.9。2.預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基：NB+2,4-D2mg·L-1；pH5.8-5.9。3.共培養(yǎng)培養(yǎng)基：NB+2,4-D2mg·L-1+AS100μM·L-1；pH5.2。4.選擇培養(yǎng)基：NB+2,4-D2mg·L-1+羧芐青霉素250mg·L-1+Hyg30-50mg·L-1，pH5.8-5.9。5.分化培養(yǎng)基：NB+KT10mg·L-1+NAA0.4mg·L-1；pH5.8-5.9。6.生根培養(yǎng)基：1/2MS；pH5.8-5.9。現(xiàn)在是16頁\一共有28頁\編輯于星期六二、胚性愈傷組織的誘導(dǎo)及繼代

取水稻授粉后15-20d的未成熟穗，將未成熟種子剝殼，用75%乙醇浸泡1min，再轉(zhuǎn)入25％的次氯酸鈉溶液中振蕩滅菌25min，于超凈工作臺中無菌水沖洗3-5次，將消毒后種子的幼胚挑出并接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每皿約30粒，于28℃暗培養(yǎng)7d，切除胚根，繼續(xù)培養(yǎng)7d，待愈傷長大后進(jìn)行繼代培養(yǎng)。從第三代開始可以選擇適當(dāng)?shù)呐咝杂鷤糜谵r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化?，F(xiàn)在是17頁\一共有28頁\編輯于星期六

胚性愈傷現(xiàn)在是18頁\一共有28頁\編輯于星期六三、農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化水稻

1.愈傷組織的預(yù)培養(yǎng)選取自然分散、顏色鮮黃、直徑約為2-3mm的顆粒狀愈傷，轉(zhuǎn)接到預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基中，置于27℃暗培養(yǎng)4天。

現(xiàn)在是19頁\一共有28頁\編輯于星期六2.農(nóng)桿菌的培養(yǎng)及處理從低溫（-85℃）凍存管中刮取少量菌液于附加Kan50mg·L-1和Rif50mg·L-1YEB固體培養(yǎng)基劃線，然后在28℃暗培養(yǎng)36~72h進(jìn)行活化；取活化平板上的單菌落轉(zhuǎn)接劃菌，28℃培養(yǎng)兩天后，用適量添加有100μM·L-1乙酰丁香酮（AS）的AAM培養(yǎng)基將菌洗脫，懸浮于添加有100μM·L-1乙酰丁香酮20mlAAM培養(yǎng)基中，劇烈搖動1min后，調(diào)整菌液濃度至OD600nm=1.5~2.0，靜置1h，以便讓農(nóng)桿菌形成懸浮液?，F(xiàn)在是20頁\一共有28頁\編輯于星期六3.共培養(yǎng)取經(jīng)預(yù)培養(yǎng)的愈傷于滅菌的培養(yǎng)瓶中，加入上述處理的農(nóng)桿菌菌液，略微搖動后靜置30min，于無菌濾紙上晾干愈傷后接種于共培養(yǎng)基，25℃暗培養(yǎng)3d?，F(xiàn)在是21頁\一共有28頁\編輯于星期六4.洗除農(nóng)桿菌挑取共培養(yǎng)后的愈傷于廣口培養(yǎng)瓶中，用無菌水沖洗3-5次，每次搖動數(shù)次，直至水中不見絲狀菌體。最后一次用含250mg·L-1羧芐青霉素的無菌水靜置1h，然后置于無菌濾紙上晾干。現(xiàn)在是22頁\一共有28頁\編輯于星期六5.愈傷組織的篩選將愈傷轉(zhuǎn)移至選擇培養(yǎng)基篩選抗性愈傷，每兩周轉(zhuǎn)接1次?？剐杂鷤?/p>

非抗性愈傷現(xiàn)在是23頁\一共有28頁\編輯于星期六6.抗性愈傷組織的繼代與植株的再生每兩周將愈傷轉(zhuǎn)移至新選擇培養(yǎng)基上，約需三周即可見瘤狀鮮黃色抗性愈傷從褐化干癟的愈傷中長出。待愈傷長大后挑選抗性愈傷的一部分轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基上。2周后愈傷開始轉(zhuǎn)綠，3周后即可長出幼芽，隨后根也長出。將幼苗移至生根培養(yǎng)基上，每培養(yǎng)瓶1個(gè)克隆。待幼苗生根長成后，移出培養(yǎng)瓶，洗凈根上的培養(yǎng)基后，移至溫室盆栽?，F(xiàn)在是24頁\一共有28頁\編輯于星期六抗性愈傷的分化抗性苗的