植物細(xì)胞培養(yǎng)

植物細(xì)胞培養(yǎng)1第1頁，共38頁，2023年，2月20日，星期六本章主要內(nèi)容第6章細(xì)胞培養(yǎng)單細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞懸浮培養(yǎng)2第2頁，共38頁，2023年，2月20日，星期六1、掌握得到單細(xì)胞無性系的技術(shù)2、掌握細(xì)胞培養(yǎng)的方法，其含義及特點3、學(xué)會小細(xì)胞團的計數(shù)方法4、了解影響單細(xì)胞培養(yǎng)的因子5、掌握細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的方法：成批培養(yǎng)；連續(xù)培養(yǎng)。6、理解細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的應(yīng)用第6章細(xì)胞培養(yǎng)本章教學(xué)目的與要求3第3頁，共38頁，2023年，2月20日，星期六Haberlandt：觀點：首次進行離體細(xì)胞培養(yǎng)高等植物的組織和器官可以分割成單個細(xì)胞小野芝麻和鳳眼蘭的柵欄細(xì)胞和虎眼萬年青屬表皮細(xì)胞第6章細(xì)胞培養(yǎng)4第4頁，共38頁，2023年，2月20日，星期六第一節(jié)單細(xì)胞培養(yǎng)一、單細(xì)胞的分離分離的單細(xì)胞看護培養(yǎng)微室培養(yǎng)平板培養(yǎng)單細(xì)胞無性系第6章細(xì)胞培養(yǎng)5第5頁，共38頁，2023年，2月20日，星期六制備單細(xì)胞:愈傷組織或懸浮培養(yǎng)物(常);用纖維素酶和果膠酸酶從組織分離6第6頁，共38頁，2023年，2月20日，星期六由組織器官經(jīng)愈傷組織分離單細(xì)胞步驟：1）誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織；2）愈傷組織反復(fù)繼代，使組織不斷增殖，提高愈傷組織松散性；第一節(jié)單細(xì)胞培養(yǎng)莖段7第7頁，共38頁，2023年，2月20日，星期六懸浮振蕩培養(yǎng)3）將愈傷組織在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，建立懸浮培養(yǎng)物優(yōu)點：細(xì)胞團成小細(xì)胞團或單細(xì)胞；在培養(yǎng)基中均勻分布；有空氣交流。第一節(jié)單細(xì)胞培養(yǎng)8第8頁，共38頁，2023年，2月20日，星期六二、單細(xì)胞培養(yǎng)方法（Singlecellculture）第一節(jié)單細(xì)胞培養(yǎng)9第9頁，共38頁，2023年，2月20日，星期六單細(xì)胞培養(yǎng)常用的方法：第一節(jié)單細(xì)胞培養(yǎng)單細(xì)胞培養(yǎng)方法看護培養(yǎng)法微室培養(yǎng)法固體平板培養(yǎng)法液體淺層培養(yǎng)法10第10頁，共38頁，2023年，2月20日，星期六（一）、看護培養(yǎng)法（Nurseculture）用途：誘導(dǎo)形成單細(xì)胞系。第一節(jié)單細(xì)胞培養(yǎng)含義：指用一塊活躍生長的愈傷組織來看護單個細(xì)胞，并使其生長和增殖的方法。1看護培養(yǎng)的含義及用途11第11頁，共38頁，2023年，2月20日，星期六看護培養(yǎng)圖示：NursecallusFilterpaperSinglecell單細(xì)胞無性系恒溫培養(yǎng)1個月2~3月用一塊活躍生長的愈傷組織來看護單個細(xì)胞，并使其生長和增殖。這個愈傷組織塊稱為看護愈傷組織第一節(jié)單細(xì)胞培養(yǎng)12第12頁，共38頁，2023年，2月20日，星期六2看護培養(yǎng)基本技術(shù)（1）在一個培養(yǎng)瓶中加入一定量厚的固體培養(yǎng)基，滅菌后備用。（2）在無菌條件下，將一小塊（1cm3）活躍生長的愈傷組織接種到培養(yǎng)基上，再在愈傷組織塊上放一片（1cm2）已滅菌的濾紙，放置一晚上。（3）將分離的單細(xì)胞接種到培養(yǎng)基的濾紙上。（4）恒溫培養(yǎng)。第一節(jié)單細(xì)胞培養(yǎng)13第13頁，共38頁，2023年，2月20日，星期六優(yōu)點：

（1）簡便易行。

（2）效果好，易于成功。

缺點：

（1）不能在顯微鏡下直接觀察細(xì)胞的生長過程。第一節(jié)單細(xì)胞培養(yǎng)3、看護培養(yǎng)特點：14第14頁，共38頁，2023年，2月20日，星期六1微室培養(yǎng)的含義及用途用途:主要用來觀察細(xì)胞生長、分裂、形成細(xì)胞團的過程。（二）、微室培養(yǎng)法（Microculture）第一節(jié)單細(xì)胞培養(yǎng)含義:將單細(xì)胞培養(yǎng)在少量的培養(yǎng)基中。15第15頁，共38頁，2023年，2月20日，星期六微室培養(yǎng)圖示：1滴含單細(xì)胞培養(yǎng)液周圍加石蠟油凹穴載玻片旁邊加石蠟油蓋蓋玻片蓋蓋玻片平視圖置培養(yǎng)皿中26~28℃恒溫培養(yǎng)第一節(jié)單細(xì)胞培養(yǎng)16第16頁，共38頁，2023年，2月20日，星期六第一節(jié)單細(xì)胞培養(yǎng)2微室培養(yǎng)特點：優(yōu)點：

（1）在培養(yǎng)過程中，可以連續(xù)進行顯微觀察一個細(xì)胞的生長、分裂和形成細(xì)胞團的全部過程

缺點：

（1）培養(yǎng)時間較短17第17頁，共38頁，2023年，2月20日，星期六（三）、平板培養(yǎng)法（PlanteCulture）1含義及用途：第一節(jié)單細(xì)胞培養(yǎng)含義:將單個細(xì)胞與融化的瓊脂培養(yǎng)基均勻混合后平鋪一薄層在培養(yǎng)皿底上的培養(yǎng)法。用途:分離單細(xì)胞無性系，研究其生理、生化、遺傳上的差異而設(shè)計的一種單細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。廣泛應(yīng)用于細(xì)胞、原生質(zhì)體及融合產(chǎn)物的培養(yǎng)。18第18頁，共38頁，2023年，2月20日，星期六2特點第一節(jié)單細(xì)胞培養(yǎng)固體平板培養(yǎng)圖示：優(yōu)點：

（1）可以定點觀察；

（2）分離單細(xì)胞系容易；

缺點：

（1）培養(yǎng)細(xì)胞氣體交換不暢。19第19頁，共38頁，2023年，2月20日，星期六

(1)、懸浮細(xì)胞密度的調(diào)制

平板培養(yǎng)要求最初細(xì)胞密度（即初始植板密度）為1×103-100×103個/ml

。第一節(jié)單細(xì)胞培養(yǎng)3平板培養(yǎng)的基本技術(shù)初始植板密度：單細(xì)胞固體平板培養(yǎng)時，細(xì)胞懸浮液接種到瓊脂培養(yǎng)基上最初細(xì)胞密度20第20頁，共38頁，2023年，2月20日，星期六1.4%瓊脂基本培養(yǎng)基+等量細(xì)胞培養(yǎng)液=0.7%瓊脂條件培養(yǎng)基。條件培養(yǎng)基：曾懸浮培養(yǎng)過一段時間組織或細(xì)胞的液體培養(yǎng)基。第一節(jié)單細(xì)胞培養(yǎng)（2）培養(yǎng)基配制21第21頁，共38頁，2023年，2月20日，星期六第一節(jié)單細(xì)胞培養(yǎng)植板效率（或植板率）：已形成細(xì)胞團的百分?jǐn)?shù)（即每100個鋪在平板上的細(xì)胞中有多少個能長出細(xì)胞團）。

(4)培養(yǎng)：

26℃置暗處培養(yǎng)21天。低倍顯微鏡觀察，記數(shù)單細(xì)胞或小細(xì)胞團，計算置板效率（也稱植板率）。（3）制平板：細(xì)胞懸浮液與融化狀態(tài)（35℃）條件培養(yǎng)基按一定比例均勻混合，倒成平板。22第22頁，共38頁，2023年，2月20日，星期六小細(xì)胞團計數(shù)方法：第一節(jié)單細(xì)胞培養(yǎng)2）細(xì)胞團顯影法1）低倍顯微鏡直接計算；23第23頁，共38頁，2023年，2月20日，星期六1、條件培養(yǎng)基2、細(xì)胞密度(>臨界密度)3、生長激素4、pH5、CO2三、影響單細(xì)胞培養(yǎng)的因子第一節(jié)單細(xì)胞培養(yǎng)24第24頁，共38頁，2023年，2月20日，星期六第二節(jié)、細(xì)胞懸浮培養(yǎng)

Suspensionculture含義及特點2、特點

1）細(xì)胞可不斷增殖，形成高密度的細(xì)胞群體，適于大規(guī)模培養(yǎng)；

2）能夠提供大量較為均勻的細(xì)胞，為研究細(xì)胞的生長、分化創(chuàng)造方法和條件。第6章細(xì)胞培養(yǎng)1、含義：將離體的植物細(xì)胞懸浮在液體培養(yǎng)基中進行的無菌培養(yǎng)25第25頁，共38頁，2023年，2月20日，星期六一、懸浮培養(yǎng)類型和方法第二節(jié)細(xì)胞懸浮培養(yǎng)成批培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng)26第26頁，共38頁，2023年，2月20日，星期六（一）、成批培養(yǎng)/分批培養(yǎng)（Batchculture）含義：將愈傷組織培養(yǎng)在一定容積的密閉容器中進行培養(yǎng)。它是進行細(xì)胞生長和細(xì)胞分裂的生理生化研究常用的培養(yǎng)方法。第二節(jié)細(xì)胞懸浮培養(yǎng)27第27頁，共38頁，2023年，2月20日，星期六1、成批培養(yǎng)特點

第二節(jié)細(xì)胞懸浮培養(yǎng)（1）培養(yǎng)基體積固定；

（2）必須適當(dāng)攪拌；

（3）培養(yǎng)過程中，細(xì)胞生長，其數(shù)目不斷發(fā)生變化，呈S增長；

（4）但要進行下一批培養(yǎng)，則生長一定時間后，需要繼代轉(zhuǎn)移。28第28頁，共38頁，2023年，2月20日，星期六培養(yǎng)時間培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)目12345延遲期對數(shù)生長期直線生長期緩慢期靜止期12345第二節(jié)細(xì)胞懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長曲線29第29頁，共38頁，2023年，2月20日，星期六2、成批培養(yǎng)的方法(1)旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)(2)往返震蕩培養(yǎng)(3)旋轉(zhuǎn)震蕩培養(yǎng)(4)攪動培養(yǎng)第二節(jié)細(xì)胞懸浮培養(yǎng)30第30頁，共38頁，2023年，2月20日，星期六（二）、連續(xù)培養(yǎng)（Continuousculture）含義：指在培養(yǎng)過程中，以不斷抽取懸浮培養(yǎng)物并注入等量新鮮培養(yǎng)基，使培養(yǎng)物不斷得到養(yǎng)分補充，保持其恒定體積的培養(yǎng)。第二節(jié)細(xì)胞懸浮培養(yǎng)31第31頁，共38頁，2023年，2月20日，星期六1、連續(xù)培養(yǎng)的特點：（1）新鮮培養(yǎng)基的不斷加入,保證了養(yǎng)分的充分供應(yīng)；

（2）可使細(xì)胞保持在增殖旺盛的對數(shù)生長期中；

（3）適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)第二節(jié)細(xì)胞懸浮培養(yǎng)32第32頁，共38頁，2023年，2月20日，星期六(1)半連續(xù)培養(yǎng)：每隔一定時間倒出一定量的懸浮液，同時補充加入等量的新鮮培養(yǎng)液(2)連續(xù)培養(yǎng)：

封閉式和開放式第二節(jié)細(xì)胞懸浮培養(yǎng)2、連續(xù)培養(yǎng)的種類：Productionofanthocyanin33第33頁，共38頁，2023年，2月20日，星期六加入培養(yǎng)基排出培養(yǎng)基及其培養(yǎng)物第二節(jié)細(xì)胞懸浮培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng)圖示：34第34頁，共38頁，2023年，2月20日，星期六三、細(xì)胞懸浮培養(yǎng)主要應(yīng)用1、植物有用物質(zhì)的生產(chǎn)2、誘發(fā)和篩選突變體3、原生質(zhì)體培養(yǎng)和細(xì)胞分離4、食品生產(chǎn)。第二節(jié)細(xì)胞懸浮培養(yǎng)35第35頁，共38頁，2023年，2月20日，星期六1、單細(xì)胞的分離方法:1)愈傷組織誘導(dǎo);2)單細(xì)胞懸浮液的制備2、單細(xì)胞培養(yǎng)的方法:（1）、看護培養(yǎng)法;(2)微室培養(yǎng)法;(3)平板培養(yǎng)法3、平板培養(yǎng)的基本技術(shù)（1）單細(xì)胞懸浮液的制備

(2)懸浮細(xì)胞密度的調(diào)制（3）瓊脂培養(yǎng)基配制:0.7%瓊脂條件培養(yǎng)基。（4）平板制作（5)培養(yǎng)第6章細(xì)胞培養(yǎng)本章小結(jié)：36第36頁，共38頁，2023年，2月20日，星期六4、影響單細(xì)胞培養(yǎng)的因子:1)條件培養(yǎng)基;2)初始細(xì)胞植板密度(>臨界密度);3)生長物質(zhì);4)pH;5)CO25、細(xì)胞懸浮培養(yǎng)方法：成批培養(yǎng)；連續(xù)培養(yǎng)。6、成批培養(yǎng)的方法