hn亞型禽流感分離鑒定

H9N2亞型禽流感病毒的檢測、分離與鑒定姓名：劉**專業(yè)：動醫(yī)10-2班

現(xiàn)在是1頁\一共有24頁\編輯于星期一研究背景研究目的與意義研究技術(shù)路線結(jié)果結(jié)論概要現(xiàn)在是2頁\一共有24頁\編輯于星期一一、研究背景

2012年4月13日，山東省青島某大型養(yǎng)雞廠出現(xiàn)一批疑似感染H9N2亞型禽流感病毒的?。ㄋ溃╇u，臨床上表現(xiàn)為精神沉郁，采食量下降，呼吸困難，個別病雞出現(xiàn)腹瀉癥狀

，產(chǎn)蛋量下降?，F(xiàn)在是3頁\一共有24頁\編輯于星期一臨床剖檢氣管出血現(xiàn)在是4頁\一共有24頁\編輯于星期一腸道、胰腺出血現(xiàn)在是5頁\一共有24頁\編輯于星期一腺胃乳頭出血現(xiàn)在是6頁\一共有24頁\編輯于星期一腎臟腫脹、出血

現(xiàn)在是7頁\一共有24頁\編輯于星期一二、研究目的與意義對送檢病料進行實驗室檢查，確定該雞群發(fā)病的原因。對H9N2亞型禽流感病毒進行分離鑒定，為以后分子水平的研究打下基礎(chǔ)?，F(xiàn)在是8頁\一共有24頁\編輯于星期一臨床剖檢疑似病例病料的RT-PCR檢測雞胚接種尿囊液檢測尿囊液HA、HI檢測尿囊液RT-PCR檢測三、研究技術(shù)路線現(xiàn)在是9頁\一共有24頁\編輯于星期一1、病料的采集處理2、病毒RNA的提取3、病毒cDNA的獲取

4、基因的RT-PCR擴增5、電泳

1.病料RT-PCR檢測現(xiàn)在是10頁\一共有24頁\編輯于星期一選取經(jīng)PCR初步檢測后的陽性病料，三次反復(fù)凍融后3000rpm離心5min，過濾后接種9-11日齡SPF雞胚（0.2ml/枚）。37℃下孵育72h，棄去24h內(nèi)死胚，將24-72h內(nèi)死亡和存活雞胚置4℃，無菌收獲尿囊液。2.雞胚培養(yǎng)現(xiàn)在是11頁\一共有24頁\編輯于星期一3.尿囊液檢測（1）接種雞胚血凝試驗（HA）測定

在96孔微量血凝板上，每孔加25μl生理鹽水。每行的第1孔加入25μl尿囊液，充分混勻后吸取25μl加入第2孔，如此倍比稀釋至第11孔，從第11孔中吸棄25μl，第12孔不加尿囊液，作為陰性對照孔。每孔內(nèi)再加1%雞紅細(xì)胞懸液25μl，振蕩混勻，于室溫靜置30min，觀察結(jié)果?，F(xiàn)在是12頁\一共有24頁\編輯于星期一HA結(jié)果判定：

結(jié)果以++++、+++、++、+和－表示。判定以++為終點，亦即一個血凝單位。依此標(biāo)準(zhǔn)判定：能凝集紅細(xì)胞的最大稀釋度即是病毒的血凝價，即HA價?，F(xiàn)在是13頁\一共有24頁\編輯于星期一（2）接種雞胚血凝抑制試驗（HI）測定

96孔微量血凝板的第1、2行的各孔內(nèi)依次加入25μL生理鹽水。于第1行的第1孔內(nèi)均加入25μLH9N2陽性血清，充分混勻后吸取25μL加入第2孔，如此倍比稀釋至第11孔，從第11孔吸出25μL液體，棄去。最后一孔加入25μLH9N2陽性血清。于血凝板的第二行各孔內(nèi)重復(fù)上述操作，只是將H9N2血清樣本換做新城疫血清樣本。在這兩行的各孔內(nèi)均加入25μL4個血凝單位抗原。輕輕搖勻后，放入37℃電熱恒溫培養(yǎng)箱靜置15min后，各孔均加入25μL1%雞紅細(xì)胞懸液。振蕩混勻，于37℃電熱恒溫培養(yǎng)箱靜置15min后，觀察結(jié)果?，F(xiàn)在是14頁\一共有24頁\編輯于星期一HI結(jié)果判定：

結(jié)果以++++、+++、++、+和－表示。結(jié)果判定以++為終點。依此標(biāo)準(zhǔn)判定：以能夠抑制病毒凝集紅細(xì)胞的最大血清稀釋度為該血清的血凝抑制效價，即HI效價。判定HI效價大于或等于8的血清樣本為病毒抗體陽性。現(xiàn)在是15頁\一共有24頁\編輯于星期一（3）雞胚尿囊液的RT-PCR測定

取尿囊液按常規(guī)方法進行H9N2亞型禽流感（AIV）、傳染性支氣管炎病毒（IBV）、新城疫病毒（NDV）、呼腸孤病毒(REOV)、馬立克病毒（MDV）、網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病毒（REV）、雞傳染性貧血病毒（CAV）及法氏囊病毒（IBDV）的RT-PCR檢測?，F(xiàn)在是16頁\一共有24頁\編輯于星期一1、病料RT-PCR擴增結(jié)果M為DLDNA2000Marker1為病雞肺、氣管的研磨液，用的是擴增H9N2亞型AIV的引物2為病雞肝的研磨液，用的是擴增H9N亞型AIV的引物3為H9N2的陽性對照4為病雞肝的研磨液，用的是擴增NDV的引物5為病雞肺、氣管的研磨液用的是擴增IBV的引物6、7為空白孔四、結(jié)果現(xiàn)在是17頁\一共有24頁\編輯于星期一

SPF雞胚接種病料后的胚體病變

2、接種雞胚的病變情況現(xiàn)在是18頁\一共有24頁\編輯于星期一3.尿囊液檢測結(jié)果（1）HA測定結(jié)果H9N2分離株的雞胚尿囊液能使雞外周血紅細(xì)胞發(fā)生凝集，HA為210，反應(yīng)呈強陽性。由于傳染性支氣管炎不能使雞外周血紅細(xì)胞發(fā)生凝集，故可以排除尿囊液中不含有傳染性支氣管炎病毒?，F(xiàn)在是19頁\一共有24頁\編輯于星期一其中加入NDV陽性血清的尿囊液能使雞外周血紅細(xì)胞全部發(fā)生凝集，反應(yīng)呈陰性加入H9N2陽性血清后，尿囊液能使部分雞外周血紅細(xì)胞發(fā)生凝集，反應(yīng)呈陽性，HI為28（2）HI測定結(jié)果現(xiàn)在是20頁\一共有24頁\編輯于星期一（3）尿囊液的RT-PCR測定M：DLDNA2000Marker1：H9N2亞型禽流感（AIV）2：傳染性支氣管炎（IBV）3：新城疫病毒（NDV）4：法氏囊病毒（IBDV）5：呼腸孤病毒（REOV）6：馬立克病毒（MDV）7：網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖（REV）8：雞傳染性貧血（CAV）

現(xiàn)在是21頁\一共有24頁\編輯于星期一尿囊液PCR檢測結(jié)果顯示H9N2亞型禽流感病毒呈陽性，所能夠檢測的其它病毒均為陰性，診斷該病由H9N2亞型禽流感病毒所致。同時也表明，通過雞胚培養(yǎng)，成功分離出一株單一的H9N2亞型禽流感病毒。現(xiàn)在是22頁\一共有24頁\編輯于星期一五、結(jié)論1、通過實驗室診斷確定患病雞群感染了H9N2亞型禽流感病毒。2、通過雞胚培養(yǎng)，并對尿囊液